Frau Alster, Herr Honrath und Dr. Jiang sind bekannt für ihre hervorragende technische Unterstützung geschätzt. geschätzt Auch Dr. Volz und die Forschungsgruppe von Dr. Dandri für die Bereitstellung der Zugriff auf ihre digitalen PCR-Gerät ist.

1. Vorbereitung Mix Kultur, die sowohl Tumorzellen als auch Nicht-Tumorzellen <ol><li> Verwenden von Tumorzellen aus einer etablierten Zelllinie MPNST S462 5. Verwenden Fibroblasten als die Nicht-Tumorzellen 6,7 </li><li> Kultur sowohl Tumorzellen und Fibroblasten in Standard-DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (BSA), 3 mM Glutamin, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 500 U / ml Penicillin, 500 g / ml Streptomycin und 1 mM Natriumpyruvat bei 37 ° C und 5% CO 05-7 Februar. Bei Subkonfluenz, ernten die Zellen mit 0,05% Trypsin und zähle sie eine Zählkammer. </li><li> Mischungs 400 Tumorzellen und 1600 Nicht-Tumorzellen zusammen in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte in 0,2 ml Medium. Berücksichtigung schnelleres Wachstum von Tumorzellen über den Behandlungszeitraum von 5 Tagen wurde der anfängliche Anteil der Tumorzellen auf 25% eingestellt. Richten Sie 4 Wiederholungen für jede Wirkstoffkonzentration. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 O / N. </li></ol> 2. Drug Behandlung <ol><li> Verwenden Sie Nilotinib als Test Droge. Stocklösungen von 0, 2, 4 und 20 mM Nilotinib in DMSO. Verdünnte jeder von ihnen um 200-fach in 5 ml DMEM - Medium, so dass 2-fach konzentriertem arzneimittel Lösungen von 0, 10, 20 und 100 &amp; mgr; M 6.7. </li><li> Entfernen Sie 0,1 ml Medium aus jeder Vertiefung und 0,1 ml Medium, das Medikament. Die Endkonzentrationen sind 0, 5, 10 und 50 uM. Weiter, um die Zellen in Medium, das Medikament für 5 Tage inkubiert. </li><li> Am Ende der Behandlung, überprüfen Sie die anhaftenden Zellen ein Phasenkontrastmikroskop und Fotos zu machen. Saugen Sie das Medium entfernt, waschen Sie einmal die überlebt Klebstoff Zellen mit 0,2 ml PBS. </li></ol> 3. Vorbereitung DNA für digitale PCR <ol><li> Lyse Zellen HotShot mit 8. <ol><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l alkalische Lyse-Lösung (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA) in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Folie. Inkubieren der Platte bei 95 ° C in einem Ofen oder auf einer Heizplatte für 30 min. Überprüfen Sie unter einer micrOscope, um sicherzustellen, dass nicht mehr intakte Zellen an der Oberfläche der Vertiefungen blieb. Bei lysieren die Zellen, erhöhen nicht vollständig die Heizzeit oder Reinigungsmittel hinzufügen. Frieren sie einmal bei -20 ° C auch verbessert das Brechen Zellen. </li><li> In 50 ul Neutralisierungslösung (40 mM Tris-HC, pH 4,0) in jede Vertiefung. Übertragen alle Lysate in U-Form Vertiefungen einer PCR-Platte und trocken in einer PCR-Cycler bei 95 ° C für 10 bis 30 min. Rekonstitution der Lysate mit 20 &amp; mgr; l destilliertes Wasser. </li></ol></li><li> Entsalzen mit Tropfen-Dialyse 9 <ol><li> verwenden Membranfilter mit einer mittleren Porengröße von 0,025 &amp; mgr; m. </li><li> Schwimmer den Filter auf destilliertem Wasser mit glänzenden Seite nach oben in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Befeuchten Sie die Filter für 5 min. Achten Sie Luftblasen zwischen dem Filter und Wasser zu vermeiden. </li><li> Pipettieren die rekonstituierten Lysaten von jeder Probe aus Schritt 3.1.4 vorsichtig auf auf jeder der vier Bereiche des Filters. Decken Sie die Platte und dialysiere für 30 bis 60 min. </li><li> Saugen Sie das Wasser unter dem Filter entfernt, ohne den Filter Umklappen noch die Tropfen zu stören. </li><li> Transfer des Lysats Tropfen in die Vertiefungen einer neuen PCR-Platte. Trockne die DNA-Tropfen durch Erhitzen bei 95 ° C für 10 bis 30 min in einer PCR-Cycler. Rekonstitution der Lysate in 10 &amp; mgr; l Wasser. </li></ol></li></ol> 4. Digitale PCR <ol><li> Auftau-frozen Komponenten wie DNA, Puffer und der Testansatz bei RT spin bei Maximalkraft von jeder verfügbaren Zentrifuge für 10 sec nach unten (beispielsweise VWR Minizentrifuge) und dann auf Eis halten. </li><li> Vorbereitung Master Mischung enthaltend alle Komponenten außer DNA (Tabelle 1). Betrachten Sie Totvolumen und berechnen Master Mischung ca. 10% mehr als die erforderliche Menge. HINWEIS: Verwenden Sie die Primer und im Handel erhältlichen Kits verwendeten Sonden. </li><li> Vortex die Master-Mischung, Spin-down für 10 Sekunden bei maximaler Kraft von jeder verfügbaren Zentrifuge (zB VWR Mini-Zentrifuge) und 15 &amp; mgr; l zu jeder verzichtenVertiefung einer Platte mit 96-PCR. Fügen Sie alle Lysat von jeder Probe (die DNA enthält) in die Vertiefungen der Master-Gemisch enthält. Transfer 20 ul jeder Reaktionsmischung in eine gut auf der Probenseite einer Kartusche bei RT. </li><li> Dispense 70 ul Tröpfchengenerator Öl in jede Vertiefung auf der Ölseite einer Kartusche. Schließen Sie die Kassette mit der Dichtung und legen Sie die gesamte Einstellung in einen Tröpfchengenerator. Starten Sie Tropfenerzeugung. </li><li> Transfer 40 ul Tröpfchen-Lösung in die Vertiefungen einer 96-Well-PCR-Platte. Verschließen Sie die Platte mit einer Folie und legen Sie die Platte in eine PCR-Cycler. Stellen Sie den Deckel-Temperatur bei 105 ° C und Rampenrate bei 2 ° C / s. Führen Sie die PCR mit den Einstellungen in der Tabelle 2. Nach der PCR, übertragen Sie die Platte in einen Tröpfchen Leser und dem Lesen beginnen. Alternativ speichern Sie die Platte bei 4 ° C bis zu 24 Stunden. </li></ol> 5. Berechnen Anteil der Tumorzellen <ol><li> Laden Sie die digitalen Daten PCR und führen Sie die automatische analysist. </li><li> Steuern die Ergebnisse jedes Test manuell durch die eindimensionale und 2-dimensionale Verteilung der positiven und negativen Tröpfchen Inspizieren und sicherzustellen, dass sie gut getrennt sind und die Schwellenlinien wurden in den richtigen Positionen. Ausschließen Ergebnisse nicht die Kriterien erfüllen, zum Beispiel keine klare Trennung von positiven und negativen Tröpfchen, von der weiteren Analyse. Kopieren Sie die resultierende Verhältnis NF1 / RPP30 in ein Excel - Blatt. </li><li> Berechnen des Anteils der Tumorzellen , wie: 2 x (1- NF1 / RPP30). </li></ol> 6. Dosisabhängige Änderung der Anteil der Tumorzellen <ol><li> Für jedes Arzneimittel-Konzentration, die mittlere und Standardabweichung von den vier Replikaten berechnen. Zeichnen Sie die Mittel und die Standardabweichungen gegen den Drogenkonzentrationen. </li></ol>

<ol>
	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

Der Schlüsselschritt in dieser Gen- und zellbasierte Werkzeug für die Beurteilung der Arzneimittelspezifität in vitro ist die Bestimmung des Anteils der Tumorzellen mit einem oder mehreren Tumor-spezifischen genetischen Merkmale. Im Gegensatz zu herkömmlichen phänotypischen Merkmale 7, sind genetische Merkmale spezifische, stabil und einfach zu quantifizieren. Zum Beispiel ist eine tumorspezifische Mutation oder Veränderung der Kopienzahl vorhanden ausschließlich in die Tumorzellen, jedoch nicht in Nicht-Tumorzellen. Eine solche genetische Stigma zuverlässig werden kann und genau quantifiziert werden, beispielsweise digitale PCR unter Verwendung der in dieser Studie nachgewiesen. Für die digitale PCR ist eine hohe Reinheit der DNA nicht wesentlich. Jedoch sind Entsalzen und Entfernen inhibitorische Moleküle notwendig, die durch einen Tropfendialyse erreicht werden kann, einen geeigneten Filter. Die kombinierte Lyse und Drop-Dialyse ist einfach und schnell, erfordert keine speziellen Instrumente und daher in jedem Standard-Labor durchgeführt werden kann. Wenn die Zellen nicht Break gut, kann eine zusätzliche Behandlung in Betracht gezogen werden, wie die Zellen bei -20 ° C einfrieren, Zugabe von Reinigungsmittel oder / und unter Verwendung von Protease. In der vorliegenden Studie wurde die heterozygote Deletion des NF1 - Gen als das tumorspezifische Merkmal für die Quantifizierung verwendet. In ähnlicher Weise kann auch verwendet werden, Deletionen anderer Gene oder Loci. Weiterhin Mutationen können auch zur Quantifizierung von Tumorzellen verwendet werden. In einem solchen Fall digital PCR-Assays für die mutierten und die normalen Allele müssen umfassend validiert werden, um ihre Spezifität für jeden von ihnen zu gewährleisten. Dosisabhängige Anteil der Tumorzellen liefert eine Anzeige für arzneimittel Spezifität oder Selektivität. Darüber hinaus ermöglicht es auch von Tumorzellen aus der Reaktion der gesamten Zellen einer gemischten Kultur mit einem Medikament (4) Extrahieren Antwort. Diese Extraktion Strategie stellt eine Lösung für das technische Problem bei der Verwendung Primärkulturen (die sowohl Tumor enthält und keinn-Tumorzellen) für Drogentests. Die Gen- und zellbasierten in vitro - Tool in der vorliegenden Studie gezeigt , daher Anwendungspotenzial aufweisen (1) in der Arzneimittelentdeckung , wo es eine Plattform für die Beurteilung der Arzneimittel Spezifität oder Selektivität in vitro und (2) in der personalisierten Krebsbehandlung bietet , wo es ermöglicht die Prüfung Drogen in Primärkulturen und damit zu arzneimittel Auswahl in der adjuvanten Chemotherapie 4 beitragen können. Darüber hinaus können pharmakologische Mechanismus eines Medikaments untersucht werden dieses Werkzeug verwenden, da bestimmte genetische Veränderung oder mehrere genetische Veränderungen können während der Arzneimittelbehandlung folgen. Eine Schwierigkeit in individualisierter Primärkulturen ist das Fehlen einer universellen genetischen Merkmal für die Quantifizierung der Tumorzellen. Jedoch mit vorab in der heutigen Gesamtgenom-Sequenzierung, die am häufigsten veränderten Gene und Regionen sind für die gemeinsame Tumoren bekannt. Zum Beispiel unter Kopf und HalsTumoren, 71%, 23% und 22% haben Mutationen im TP53, FAT1 und CDKN2A gene, und 60%, 34% und 26% weisen Deletionen in den Genregionen von CDKN2A, STK11 und PTEN bzw. 10. Screenen von 5 bis 10 solcher Gene oder / und Regionen durch gezielte-Sequenzierung oder / und digitale PCR identifiziert daher wahrscheinlich eine oder mehrere genetische Veränderungen, die zur Quantifizierung von Tumorzellen in der abgeleiteten Primärkultur verwendet werden können. Eine weitere Einschränkung ist die oft unzureichende Menge an reseziert Tumoren für Primärkulturen aufzubauen. Trotz der vorteilhaften Merkmale und viel versprechende Anwendungsmöglichkeiten der Gen- und zellbasierten in vitro - Tool sollte seine Grenzen gehalten werden , in Geist und seine in - vitro - Natur hervorzuheben. Zum Beispiel können die unterschiedlichen Effekte oder Zytotoxizität eines Arzneimittels auf Tumorzellen kann nicht aufgrund des Unterschieds in Zelltypen (Fibroblasten vs. Schwann-Zellen) oder ihreunterschiedlicher Herkunft (von verschiedenen Individuen). Die stärkere Wirkung eines Arzneimittels auf Tumorzellen als auf Nicht-Tumorzellen können auch durch die Tatsache erklärt werden, daß die erstere schneller wachsen als die letzteren. Am wichtigsten ist , Zellen in vitro Verhalten unterscheidet , als Zellen im menschlichen Körper und folglich Ergebnisse der in vitro Beurteilung oft nicht oder nur teilweise den realen klinischen Situation widerzuspiegeln. Daher Wirksamkeit, Zytotoxizität und Spezifität von Medikamenten für kultivierte Zellen erhalten werden, sind eher von biomarker Natur, aber nicht über die Zuverlässigkeit der gemessenen vorklinisch Wirksamkeit von Antibiotika. Dennoch ist Bewegen von Zelllinien zu Mischkulturen und / oder Primärkulturen ein Fortschritt arzneimittel Wirkung und Spezifität / Selektivität in vitro in der Beurteilung. Mit umfangreichen Bemühungen, in vitro Bedingungen können gefunden werden , die eine angemessene Korrelation von in vitro - Daten mit realen Reaktionen von Patienten, zumindest für einige Medikamente ermöglicht.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

Ein Verfahren für die Spezifität der Antikrebs - Arzneimittel in vitro Beurteilung unter Verwendung von Kulturen sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält , nachgewiesen wird . Das Schlüsselelement ist die quantitative Bestimmung eines tumorspezifische genetische Veränderung in Bezug auf eine universelle Sequenz, die ein Dual-Sonde digitalen PCR-Assay und die nachfolgende Berechnung des Anteils der Tumorzellen verwendet wird. Der Test wird auf einem Kulturzellen einer etablierten Linie enthaltenden Tumors durchgeführt und versetzt in Nicht-Tumorzellen. Die Mischkultur wird in verschiedenen Konzentrationen mit einem Testwirkstoff behandelt. Nach der Behandlung wird die DNA auf eine Dual-Sonde digitalen PCR Assay direkt von den überlebt Klebstoff Zellen in Wells von 96-Well-Platten eine einfache und kostengünstige Methode und unterzogen unter Verwendung eines tumorspezifische genetische Veränderung und eine Referenz universelle Sequenz zur Messung . In der vorliegenden Demonstration, eine heterozygote Deletion des NF1 - Gens wird als tumorspezifische genetische Veränderung verwendet , undein RPP30 Gen als Referenz - Gen. Verwendung des Verhältnisses NF1 / RPP30 wurde der Anteil der Tumorzellen berechnet. Da die dosisabhängige Veränderung des Anteils der Tumorzellen für die Spezifität des Medikaments eine in vitro Anzeige liefert, diese genetische und zellbasierten in vitro - Assay wird wahrscheinlich Anwendungspotential in der Wirkstoffforschung. Darüber hinaus für die personalisierte Krebsfürsorge, diese Gen- und Zell-basiertes Tool kann zur Optimierung der adjuvanten Chemotherapie durch Prüfung der Wirksamkeit und Spezifität von Wirkstoffkandidaten mit Primärkulturen von einzelnen Tumoren beitragen.

Die Qualität der hergestellten DNA die kombinierte HotShot / Tropfen-Dialyse ausreichend ist für eine zufriedenstellende digitale PCR (Abbildung 1B) verwendet wird . Für 2000 Fibroblasten, etwa 3000 ± 500 positive Tröpfchen erhalten, was 75% der erwarteten 4.000 Kopien entspricht (zwei Kopien in einer Zelle). In dieser Studie wurden die Tumorzellen aus einer etablierten Linie MPNST S462 die eine heterozygote Deletion des NF1 - Gens 5 haben , sind bekannt. Diese 50% Gendosis Reduktion wurde durch das Dual - Digital - PCR - Assay (1B) eindeutig erkannt. Im Gegensatz dazu zwei Kopien dieses Gens wurden in Fibroblasten gemessen. Diese genetische Unterschied zwischen Tumor- und Nicht-Tumorzellen ermöglicht die Berechnung des Anteils der Tumorzellen in gemischten Kulturen (Figur 2). Durch Messung der relativen Gendosis von NF1 bis RPP30, Anteil von Tumorzellen in einer Mischkultur bestimmt werdenbei jeder Arzneimittelkonzentration (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Abbildung 1. Digital PCR. (A) Darstellung des Prinzips. (B) ein Dual-Sondentest zeigt reduzierte Menge eines Ziels (NF1) Gen in den Tumorzellen MPNST S462 in Bezug auf einen Referenz (RPP30) -Gen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Abbildung 2. Berechnete Anteil der Tumorzellen. Die Tumorzellen und Nicht-Tumorzellen wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt und entkernt in jede Vertiefung einer 96-Platte. Nach der Befestigung O / N wurden die Zellen lysiert with HotShot / Tropfendialyse entsalzt und die Lysate wurden in digitale PCR unterzogen , die das Verhältnis von NF1 / RPP30 gab. Basis dieses Verhältnisses Anteil von Tumorzellen in jeder Vertiefung wurde berechnet. Mittelwert und Standardabweichung der Anteil der Tumorzellen wurden berechnet aus 4 bei jedem Set-up Anteil repliziert. Die berechneten Anteile von Tumorzellen (Y-Achse) gegen die Set-up Proportionen aufgetragen wurden (X-Achse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Abbildung 3. dosisabhängige Veränderung der Anteil der Tumorzellen. (A) eine dosisabhängige Verringerung der sichtbaren vitalen Zellen. (B) Anteil der Tumorzellen (Mittelwert und Standardabweichung von 4 Replikaten) aus der berechneten<html> Verhältnis von NF1: RPP30 verringerte sich im Bereich von 0 - 10 &amp; mgr; M. Bei der höchsten Dosis 50 &amp; mgr; M, wenige vitale Zellen gelassen wurden, wahrscheinlich durch toxische Wirkung auf alle Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Abbildung 4. Vereinzeler Reaktion von Tumorzellen von der Nicht-Tumorzellen (A) Lebensfähigkeit oder / und die Proliferation von Zellen insgesamt kann unter Verwendung herkömmlicher Tests gemessen werden; Anteil der Tumorzellen kann unter Verwendung des Verfahrens in der vorliegenden Studie gezeigt werden, bestimmt. (B) über die beiden Parameter, Reaktion der gesamten Zellen in einer Mischkultur auf ein Medikament kann in Reaktion der Tumorzellen und der Reaktion des nicht-Tumorzellen unterteilt werden..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Umsetzung </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> Assay-Mix für NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> Assay-Mix für RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0,6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Zwischensumme </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> Stammischung </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Gesamt </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Endgültige PCR-Gemisch </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Einrichten von Dual - ddPCR Reaktion <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Schritt </td><td> Aktion </td><td> Temperatur </td><td> Zeit </td><td> Fahrräder </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymlöschen Aktivierung </td><td> 95 ° C </td><td> 10 Minuten </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> DNA-Denaturierung </td><td> 94 ° C </td><td> 30 sec </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Glüh- / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 Minute </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Polymerase Deaktivierung </td><td> 98 ° C </td><td> 10 Minuten </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Hold (optional) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2 : PCR - Cycler - Einstellungen

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Das Ziel dieses Protokolls ist die Spezifität von Antikrebs - Arzneimittel in vitro zu beurteilen , Mischkulturen unter Verwendung von sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält.

Die Beurteilung Spezifität von Anti-Krebs-Medikamente<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

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Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K Aufrufe.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  Das Ziel dieses Protokolls ist die Spezifität von Antikrebs - Arzneimittel in vitro zu beurteilen , Mischkulturen unter Verwendung von sowohl Tumor- und Nicht-Tumorzellen enthält. 

Serie: Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of isolated tracheal preparations has proven to be a useful assay of airway smooth muscle (ASM) contractile response in genetically modified mice. These in vitro tracheal preparations are relatively simple, provide a robust response, and retain both functional cholinergic nerve endings and muscle responses, even after long incubations.
Tracheal tensometry also provides a functional assay to study a variety of second messenger signaling pathways that affect contraction of smooth muscle. Contraction in trachea is primarily mediated by parasympathetic, cholinergic nerves that release acetylcholine onto ASM (Figure 1). The major ASM acetylcholine receptors are muscarinic M2 and M3 which are Gi/o and Gq coupled receptors, respectively3,4,5. M3 receptors evoke contraction by coupling to Gq to activate phospholipase C, increase IP3 production and IP3-mediated calcium release from the sarcoplasmic reticulum3,6,7. M2/Gi/o signaling is believed to enhance contractions by inhibition of adenylate cyclase leading to a decrease in cAMP levels5,8,9,10. These pathways constitute the so called "pharmaco-contraction coupling" of airway smooth muscle11. In addition, cholinergic signaling through M2 receptors (and modulated by M3 signaling) involves pathways that depolarize the ASM which in turn activate L-type, voltage-dependent calcium channels (Figure 1) and calcium influx (so called "excitation-contraction coupling")4,7. More detailed reviews on signaling pathways controlling airway constriction can be found4,12. The above pathways appear to be conserved between mice and other species. However, mouse tracheas differ from other species in some signaling pathways. Most prominent is their lack of contractile response to histamine and adenosine13,14, both well-known ASM modulators in humans and other species5,15.
Here we present protocols for the isolation of murine tracheal rings and the in vitro measurement of their contractile output. Included are descriptions of the equipment configuration, trachea ring isolation and contractile measurements. Examples are given for evoking contractions indirectly using high potassium stimulation of nerves and directly by depolarization of ASM muscle to activate voltage-dependent calcium influx (1. high K+, Figure 1). In addition, methods are presented for stimulations of nerves alone using electric field stimulation (2. EFS, Figure 1), or for direct stimulation of ASM muscle using exogenous neurotransmitter applied to the bath (3. exogenous ACH, Figure 1). This flexibility and ease of preparation renders the isolated trachea ring model a robust and functional assay for a number of signaling cascades involved in airway smooth muscle contraction.

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic mice have been extremely useful in ascribing physiological function to genes. As such, research in general, and functional studies of airway, in particular, have undergone a remarkable shift toward murine models. Here we provide protocols for in vitro trachea constriction studies to evaluate smooth muscle function in murine airway.

In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

Forschung

Medizin

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen<em&gt; In-vitro-</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Prion Protein-Umwandlungsassay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. Several drugs are administered into the anterior chamber or vitreous, and the intraocular injection has been effective in curing various intraocular diseases. Rabbit eyes have been widely used for ophthalmic research, as the animal is easy to handle and economical compared to other mammals, and the size of a rabbit eye is similar to that of a human eye. Using a 30 G needle, drugs can be injected into the intracameral and intravitreal spaces of rabbit eyes. The eyeballs are then frozen until analysis, and can be divided into the aqueous humor, vitreous, and retina/choroid. The vitreous and retina/choroid samples can be homogenized and solubilized before analysis. Then, immunoassays can be performed to measure the concentrations of intraocular drugs in each compartment. Appropriate pharmacokinetic models can be used to calculate several parameters, such as the half-life and maximum concentration of the drug. Rabbit eyes can be a good model for pharmacokinetic studies of intraocular drugs.

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Die Verwendung von Kaninchenaugen in pharmakokinetischen Studien von intraokulare Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Optimierte Analyse von<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Hepatosteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als<em&gt; In vitro</em&gt; Screening-Tool in der Hörforschung

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

Differentielle Effekte von lipidsenkenden Medikamenten Modulation Morphologie der Cholesterin-Partikel

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...