Sra Alster, o Sr. Honrath e Dr. Jiang são apreciados pela sua excelente assistência técnica. Também é apreciado Dr. Volz e do grupo de pesquisa do Dr. Dandri para fornecer o acesso ao seu dispositivo de PCR digital.

1. Preparação da mistura de cultura contendo ambas as células tumorais e células não tumorais <ol><li> Use de células tumorais a partir de uma linha celular estabelecida MPNST S462 5. Use fibroblastos como as células não tumorais 6,7 </li><li> Culturas tanto tumorais células e fibroblastos em meio DMEM padrão com 10% de soro fetal de bovino (BSA), glutamina 3 mM, 2-mercaptoetanol, 500 U / ml de penicilina 0,1, 500 g / ml de estreptomicina e piruvato de sódio 1 mM a 37 ° C e 5% de CO 2 5-7. Na sub-confluência, a colheita das células com 0,05% de tripsina e contá-los usando um hemocitômetro. </li><li> Misturar 400 células tumorais e 1.600 células não tumorais em conjunto em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços em 0,2 ml de meio. Considerando-se um crescimento mais rápido das células de tumor ao longo do período de tratamento de 5 dias, a proporção inicial de células de tumor foi fixada em 25%. Configurar 4 repetições para cada concentração da droga. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N. </li></ol> 2. Drug Tratamento <ol><li> Use nilotinib como o fármaco de teste. Preparar soluções estoque de nilotinib 0, 2, 4 e 20 mM em DMSO. Dilui-se cada uma delas por 200 vezes em 5 ml de meio DMEM, dando 2-fold-droga soluções concentradas de 0, 10, 20 e 100 uM 6,7. </li><li> Retirar 0,1 mL de meio de cada poço e adiciona-se 0,1 ml de meio contendo droga. As concentrações finais são 0, 5, 10 e 50 uM. Continuar a incubação das células em meio contendo droga durante 5 dias. </li><li> No final do tratamento, inspeccionar as células ligadas utilizando um microscópio de contraste de fase e tirar fotografias. Aspirar o meio de distância, lavar as células sobreviveram adesivas uma vez com 0,2 ml de PBS. </li></ol> 3. Preparação de DNA para PCR Digital <ol><li> Células Lyse usando HotShot 8. <ol><li> Adicionar 50 ul de solução de lise alcalina (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) a cada poço. Selar os poços com papel alumínio. Incubar a placa a 95 ° C num forno ou sobre uma placa de aquecimento durante 30 min. Verifique sob um microscope para certificar-se que não há mais células intactas permaneceu na superfície dos poços. No caso de as células não lisar completamente, aumentar o tempo de aquecimento ou adicionar detergente. Congelá-los uma vez a -20 ° C, também aumenta as células quebrar. </li><li> Adicionar 50 ul de solução (40 mM Tris-HC, pH 4,0) a cada poço neutralizantes. Transferir todos os lisados ​​em formato U poços de uma placa de PCR e seco em um aparelho de ciclos de PCR a 95 ° C durante 10 a 30 min. Reconstituir o lisados ​​com 20 l de água destilada. </li></ol></li><li> Desalt usando Drop-diálise 9 <ol><li> utilizar os filtros de membrana com tamanho de poro médio de 0,025 | im. </li><li> Flutuador do filtro em água destilada com brilhante para cima lado em poços de uma placa de 12 poços. Molhar o filtro durante 5 min. Prestar atenção para evitar bolhas de ar entre o filtro e água. </li><li> Pipetar os lisados ​​reconstituídas de cada amostra a partir do passo 3.1.4 em cuidadosamente em cada um dos 4 áreas do filtro. Cobrir a placa e dializar durante 30 a 60 min. </li><li> Sugar a água sob o filtro sem capotar o filtro nem perturbar as gotas. </li><li> Transferir o lisado-gotas em poços de uma nova placa de PCR-. Secam-se as ADN-gotas por aquecimento a 95 ° C durante 10 a 30 minutos num termociclador de PCR. Reconstituir o lisados ​​em 10 ul de água. </li></ol></li></ol> 4. PCR Digital <ol><li> componentes congelados descongelamento, tais como DNA, buffer ea mistura de ensaio à temperatura ambiente, spin para baixo por 10 segundos a força máxima de qualquer centrífuga disponível (por exemplo, VWR mini-centrífuga) e, em seguida, mantê-los no gelo. </li><li> Prepare a mistura mestre contendo todos os componentes, excepto o DNA (Tabela 1). Considere o volume morto e calcular mistura mestre cerca de 10% mais do que a quantidade necessária. Nota: Use os iniciadores e sondas utilizadas no kit comercial. </li><li> Vortex da mistura mestre, girar para baixo por 10 segundos a força máxima de qualquer centrífuga disponível (por exemplo, VWR mini-centrífuga) e dispensar 15 ul a cadapoço de uma placa de 96-PCR. Adicionar todos lisado (que contém ADN) de cada amostra para os poços que contêm a mistura mestre. Transferir 20 uL de cada mistura reaccional para dentro de um poço no lado da amostra de um cartucho à TA. </li><li> Pipetar 70 ul de óleo gerador de gotícula em cada cavidade no lado do óleo de um cartucho. Fechar o cartucho com a junta de vedação e colocar a configuração em todo um gerador de gotícula. Iniciar a geração de gotículas. </li><li> Transferência gota-solução de 40 ul nos poços de uma placa de PCR de 96 poços. Selar a placa com uma folha e colocar a placa num aparelho de ciclos de PCR. Definir a tampa temperatura a 105 ° C e de rampa taxa de 2 ° C / seg. Levar a cabo PCR usando as definições na Tabela 2. Após o PCR, transferir a placa para um leitor de gotícula e começar a ler. Alternativamente, armazenar a placa a 4 ° C durante até 24 h. </li></ol> 5. Cálculo Proporção de Células Tumorais <ol><li> Carregar os dados PCR digital e executar analys automáticasé. </li><li> Controlar os resultados de cada ensaio manualmente através do controlo da distribuição de uma dimensão e de 2-dimensional das gotículas positivos e negativos, e a certeza de que eles são bem separados e as linhas de limiar foram nas posições certas. Excluem os resultados não satisfaz os critérios, por exemplo, há uma clara separação de gotículas positivos e negativos, a partir de uma análise mais aprofundada. Copie o maior rácio de NF1 / RPP30 em uma folha de excel. </li><li> Calcular a proporção de células tumorais como: 2 x (1- NF1 / RPP30). </li></ol> Mudança 6. Dose-dependente da proporção de células tumorais <ol><li> Para cada fármaco-concentração, calcule a média eo desvio padrão das 4 repetições. Traçar os meios e os desvios-padrão contra o consumo de droga concentrações. </li></ol>

<ol>
	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

O passo chave nesta ferramenta genético-e à base de células para avaliar a especificidade de drogas in vitro é a determinação da proporção de células de tumor, utilizando um ou mais recursos genéticos específicos do tumor. Em contraste com características fenotípicas convencionais 7, características genéticas são específicos, estável e fácil de quantificar. Por exemplo, uma mutação ou variação do número de cópias específico do tumor está presente exclusivamente em células tumorais, mas não em células não tumorais. Tal estigma genética pode ser fiável e quantificado precisamente, por exemplo, utilizando PCR digital como demonstrado no presente estudo. Para a PCR digitais, de alta pureza de ADN não é essencial. No entanto, dessalinização e remoção das moléculas inibidoras são necessários o que pode ser conseguido por uma gota-a diálise utilizando um filtro adequado. A lise e gota-a diálise combinada é simples e rápido, não requer instrumentos especiais e, por conseguinte, pode ser realizado em qualquer laboratório padrão. Se as células não Break bem, tratamento adicional pode ser considerado tal como a congelação das células a -20 ° C, adicionando detergentes e / ou utilizando protease. No presente estudo, a supressão heterozigoto do gene NF1 foi usado como o recurso específico de tumor para a quantificação. Da mesma forma, também pode ser utilizado deleções de outros genes ou loci. Além disso, as mutações também podem ser utilizadas para quantificar as células tumorais. Em tal caso, os ensaios de PCR para o mutante digitais e os alelos normais têm de ser extensivamente validado para garantir a sua especificidade para cada um deles. proporção dependente da dose de células de tumor fornece uma indicação para o fármaco-especificidade ou selectividade. Além disso, ela também permite extrair a resposta das células tumorais a partir da resposta do número total de células de uma cultura mista de uma droga (Figura 4). Esta estratégia de extracção fornece uma solução para o problema técnico em utilizar culturas primárias (que contém tanto do tumor e nãocélulas de n-tumor) por drogas-teste. A genético-celular e baseada na ferramenta vitro demonstrado no presente estudo pode, portanto, tem potencial de aplicação (1) em droga-descoberta, onde ele fornece uma plataforma para avaliar a especificidade de drogas ou a selectividade in vitro e (2) no tratamento personalizado do câncer onde ele permite drogas de teste em culturas primárias e, consequentemente, pode contribuir para a droga-seleção na quimioterapia adjuvante 4. Além disso, o mecanismo farmacológico de uma droga pode ser estudada usando esta ferramenta, uma vez que certa alteração genética ou alterações genéticas múltiplas podem ser seguidas durante a droga do tratamento. Uma dificuldade na utilização de culturas primárias individualizadas é a falta de uma característica genética universal para a quantificação das células tumorais. No entanto, com o avanço de hoje na sequenciação de todo o genoma, os genes e regiões mais frequentemente alteradas são conhecidos por tumores comuns. Por exemplo, entre cabeça e pescoçotumores, 71%, 23% e 22% têm mutações em TP53, FAT1 e genes CDKN2A, e 60%, 34% e 26% têm deleções nas regiões do gene de CDKN2A, STK11 e PTEN, respectivamente 10. Rastreio de 5 a 10 tais genes e / ou as regiões através de sequenciação-alvo e / ou de PCR digital irá, portanto, provável identificar uma ou mais alterações genéticas que podem ser utilizadas para a quantificação das células tumorais na cultura primária derivada. Outra limitação é a quantidade muitas vezes insuficiente de tumores ressecados para a criação de culturas primárias. Apesar das características vantajosas ea aplicação potencial promissor da genético-e na ferramenta vitro baseado em células, as suas limitações devem ser mantidos em mente e sua natureza in vitro devem ser enfatizados. Por exemplo, os efeitos diferenciais ou citotoxicidade de um fármaco em células tumorais podem, em vez devido à diferença de tipos de células (células de Schwann contra fibroblastos) ou os seusdiferentes origens (de diferentes indivíduos). O efeito mais forte de um fármaco em células tumorais do que em células não tumorais também pode ser explicada pelo facto de que o primeiro crescer mais rapidamente do que o último. Mais importante, as células no comportamento vitro difere do que as células no corpo humano e, consequentemente, os resultados da avaliação in vitro muitas vezes não ou apenas parcialmente reflectir a situação clínica real. Portanto, a eficácia, a citotoxicidade e a especificidade das drogas obtidos para células cultivadas são em vez de biomarcador natureza, mas não têm a fiabilidade da eficácia pré-clinicamente medido de antibióticos. No entanto, movendo-se de linhas celulares para culturas mistas e / ou culturas primárias é um passo em frente na avaliação fármaco-efeito e especificidade / seletividade in vitro. Com grandes esforços, em condições in vitro, pode ser encontrado o que permite uma correlação razoável de dados in vitro com respostas reais dos pacientes, pelo menos para algumas drogas.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

Um procedimento para avaliar a especificidade de drogas anticancro in vitro utilizando culturas de células que contêm ambos tumorais e não tumorais é demonstrada. O elemento chave é a determinação quantitativa de uma alteração genética específica do tumor em relação a uma sequência universal usando um ensaio de PCR digital duplo-sonda e o cálculo subsequente da proporção de células de tumor. O ensaio é realizado em uma cultura contendo células de tumor de uma linha estabelecida e cravado-em células não tumorais. A cultura mista é tratado com um fármaco de teste a várias concentrações. Após o tratamento, o DNA é preparado directamente a partir das células adesivas sobreviveram em poços de placas de 96 poços utilizando um método simples e barato, e submetido a um ensaio de PCR digital duplo-sonda para a medição de uma alteração genética específica de tumores e uma sequência universal de referência . Na presente demonstração, uma deleção heterozigoto do gene NF1 é usado como a alteração genética específica de tumores eum gene RPP30 como gene de referência. Usando a relação NF1 / RPP30, calculou-se a proporção de células tumorais. Uma vez que a alteração dependente da dose da percentagem de células de tumor fornece uma indicação in vitro para a especificidade da droga, e este ensaio genético à base de células in vitro provavelmente terão potencial aplicação na descoberta de medicamentos. Além disso, para o cancro de cuidados personalizado, esta ferramenta genético-e à base de células pode contribuir para a optimização de quimioterapia adjuvante, por meio de testes de eficácia e especificidade de fármacos candidatos utilizando culturas primárias de tumores individuais.

Qualidade de ADN preparado utilizando o HotShot combinado / Drop-diálise é suficiente para PCR digitais satisfatória (Figura 1B). Por 2.000 fibroblastos, aproximadamente, foram obtidas 3.000 ± 500 gotas positivos, correspondendo a 75% dos esperados 4.000 cópias (duas cópias em uma célula). Neste estudo, as células tumorais foram estabelecidos a partir de uma linha MPNST S462 que são conhecidos por ter uma delecção heterozigoto do gene NF1 5. Esta redução da dosagem do gene 50% foi claramente detectado pelo ensaio de PCR digital duplo (Figura 1B). Em contraste, duas cópias deste gene foram medidos nos fibroblastos. Esta diferença genética entre células tumorais e não tumorais permite o cálculo da proporção de células de tumor em culturas mistas (Figura 2). Ao medir a dosagem do gene NF1 a relação de RPP30, proporção de células de tumor numa cultura mista pode ser determinadaem cada uma das drogas da concentração (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Figura 1. Digital PCR. (A) ilustração do princípio. (B) um ensaio de dual-sonda revela quantidade reduzida de um gene alvo (NF1) nas células tumorais MPNST S462 em relação a um gene de referência (RPP30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Figura 2. proporção calculada de células tumorais. As células tumorais e não tumorais células foram misturadas em várias proporções e semeadas em cada poço de uma placa de 96. Após a fixação, O / N wit, as células foram lisadash HotShot / Drop-diálise e os lisados ​​foram dessalinizadas sujeito a PCR digital, que deu o rácio de NF1 / RPP30. Com base neste rácio, foi calculada a percentagem de células de tumor em cada poço. Média e desvio padrão da proporção de células tumorais foram calculados a partir de 4 repetições em cada proporção set-up. As proporções calculadas de células tumorais (eixo Y) foram plotados contra as proporções set-up (eixo X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Figura 3. dependente da dose Mudança da proporção de células de tumor. (A) a redução dependente da dose de células vitais visíveis. (B) a proporção de células de tumor (média e desvio padrão de 4 réplicas) calculada a partir da<html> proporção de NF1: RPP30, diminuição na gama de 0-10? M. Na maior dose de 50? M, poucas células vitais foram deixados, provavelmente devido ao efeito tóxico para todas as células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Figura 4. Resposta de separação de células tumorais a partir das células não tumorais (A) a viabilidade e / ou proliferação de células totais pode ser medida utilizando ensaios convencionais; Proporção de células de tumor pode ser determinada utilizando o procedimento demonstrado no presente estudo. (B) usando os dois parâmetros, a resposta de células totais numa cultura mista para um fármaco pode ser dividido em resposta das células tumorais e a resposta das células não tumorais..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Reaction </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR Supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mistura de ensaio para NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mistura de ensaio para RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0,6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Subtotal </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> mistura mestre </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Total </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Mistura de PCR finais </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Configuração dupla ddPCR Reaction <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Açao </td><td> Temperatura </td><td> Tempo </td><td> Cycles </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymapagar activação </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> desnaturação do DNA </td><td> 94 ° C </td><td> 30 seg </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Annealing / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> 4 </td><td> desactivação da polimerase </td><td> 98 ° C </td><td> 10 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Espera (opcional) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> A Tabela 2 Configurações Cycler PCR

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais.

Avaliando Especificidade de Anticancer Drugs<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K visualizações.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais. 

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of isolated tracheal preparations has proven to be a useful assay of airway smooth muscle (ASM) contractile response in genetically modified mice. These in vitro tracheal preparations are relatively simple, provide a robust response, and retain both functional cholinergic nerve endings and muscle responses, even after long incubations.
Tracheal tensometry also provides a functional assay to study a variety of second messenger signaling pathways that affect contraction of smooth muscle. Contraction in trachea is primarily mediated by parasympathetic, cholinergic nerves that release acetylcholine onto ASM (Figure 1). The major ASM acetylcholine receptors are muscarinic M2 and M3 which are Gi/o and Gq coupled receptors, respectively3,4,5. M3 receptors evoke contraction by coupling to Gq to activate phospholipase C, increase IP3 production and IP3-mediated calcium release from the sarcoplasmic reticulum3,6,7. M2/Gi/o signaling is believed to enhance contractions by inhibition of adenylate cyclase leading to a decrease in cAMP levels5,8,9,10. These pathways constitute the so called "pharmaco-contraction coupling" of airway smooth muscle11. In addition, cholinergic signaling through M2 receptors (and modulated by M3 signaling) involves pathways that depolarize the ASM which in turn activate L-type, voltage-dependent calcium channels (Figure 1) and calcium influx (so called "excitation-contraction coupling")4,7. More detailed reviews on signaling pathways controlling airway constriction can be found4,12. The above pathways appear to be conserved between mice and other species. However, mouse tracheas differ from other species in some signaling pathways. Most prominent is their lack of contractile response to histamine and adenosine13,14, both well-known ASM modulators in humans and other species5,15.
Here we present protocols for the isolation of murine tracheal rings and the in vitro measurement of their contractile output. Included are descriptions of the equipment configuration, trachea ring isolation and contractile measurements. Examples are given for evoking contractions indirectly using high potassium stimulation of nerves and directly by depolarization of ASM muscle to activate voltage-dependent calcium influx (1. high K+, Figure 1). In addition, methods are presented for stimulations of nerves alone using electric field stimulation (2. EFS, Figure 1), or for direct stimulation of ASM muscle using exogenous neurotransmitter applied to the bath (3. exogenous ACH, Figure 1). This flexibility and ease of preparation renders the isolated trachea ring model a robust and functional assay for a number of signaling cascades involved in airway smooth muscle contraction.

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic mice have been extremely useful in ascribing physiological function to genes. As such, research in general, and functional studies of airway, in particular, have undergone a remarkable shift toward murine models. Here we provide protocols for in vitro trachea constriction studies to evaluate smooth muscle function in murine airway.

Em medições in vitro de constrição traqueal Utilizando camundongos

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

Medicina

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Avaliar as alterações teratogênicos em um modelo de Zebrafish de exposição fetal ao álcool

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

Citotóxicos Eficácia da Terapia Fotodinâmica no osteossarcoma Células<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Conversão Protein Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. Several drugs are administered into the anterior chamber or vitreous, and the intraocular injection has been effective in curing various intraocular diseases. Rabbit eyes have been widely used for ophthalmic research, as the animal is easy to handle and economical compared to other mammals, and the size of a rabbit eye is similar to that of a human eye. Using a 30 G needle, drugs can be injected into the intracameral and intravitreal spaces of rabbit eyes. The eyeballs are then frozen until analysis, and can be divided into the aqueous humor, vitreous, and retina/choroid. The vitreous and retina/choroid samples can be homogenized and solubilized before analysis. Then, immunoassays can be performed to measure the concentrations of intraocular drugs in each compartment. Appropriate pharmacokinetic models can be used to calculate several parameters, such as the half-life and maximum concentration of the drug. Rabbit eyes can be a good model for pharmacokinetic studies of intraocular drugs.

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Uso de olhos de coelhos em farmacocinéticas Estudos de intraoculares Drogas

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Inchaço na Organóides intestinal induzida por forscolina: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para a Avaliação de Medicamentos Response na Fibrose Cística Os pacientes

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como Ferramenta de Triagem In Vitro na Pesquisa Auditiva

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

Efeitos diferenciais de drogas hipolipemiantes na modulação da morfologia das partículas de colesterol

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Avaliando Especificidade de Anticancer Drugs

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Em medições in vitro de constrição traqueal Utilizando camundongos

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Análise otimizada de

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como Ferramenta de Triagem In Vitro na Pesquisa Auditiva

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