Diese Arbeit wurde durch Mittel aus DUKE-NUS Graduate Medical School Singapore, Goh Stiftung und Singapur NRF Gemeinschaft (NRF-NRFF2016-01) zu Manvendra K. Singh unterstützt.

Alle Experimente wurden von der Duke-NUS Graduate Medical School Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. 1. Abrufen der Embryonale Ventricles <ol><li> Opfere eine zeitlich schwangere Maus an der gewünschten Embryonalstadium (E11,5 oder E12,5) eine Euthanasie Kammer mit Kohlendioxidgas Versorgung oder einer anderen zugelassenen Euthanasie-Verfahren. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken auf einem Seziertisch. Desinfizieren Sie den Bauch der Frau mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut über dem Bauch und machen einen kleinen Schnitt (1-2 cm) mit einer Klinge, dann halten Sie die Haut mit beiden Händen und ziehen weg die Bauchdecke zu belichten. </li><li> Nun schneiden Sie die Bauchdecke des Uterushorn zu belichten. Verwenden einer sterilen Pinzette das Uterushorn zu heben und vorsichtig die fetten Gewebe und Blutgefäße an der Uterushorn wegschneiden. Schneiden Sie an den Gebärmutterhals in die Gebärmutter zu erhalten. </li><li> Legen Sie das Uterushorn in einer Petrischale mit steriler kalt 1x Phosphat Buff<html> Ered Saline (PBS) und spülen Sie vorsichtig. Legen Sie die Petrischale auf Eis. </li><li> Mit einer Schere durch die Mittellinie des uterine horn zu schneiden (gegenüber der Seite, wo die Plazenta befindet) die Embryonen zu belichten, die immer noch in den Dottersack und an der Uteruswand durch die Plazenta befestigt. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, aufgeschnitten die embryonale Dottersack, den Embryo zu befreien. </li><li> Platzieren Sie den Embryo in eine neue Petrischale mit steriler kalt 1x PBS. Enthaupten den Embryo und legen Sie es auf dem Rücken. Schneiden Sie die Brustwand öffnen, um das Herz aussetzen. </li><li> Verwenden einer sterilen Pinzette, das Herz zu heben und die Gefäße herum weggeschnitten das Herz aus der Brustwand zu befreien. Besonderes Augenmerk nicht das Epikard des Herzens mit den chirurgischen Instrumenten zu beschädigen. </li><li> Schneiden Sie das Ausflusstraktes und beide Vorhöfe. Übertragen Sie die Ventrikel auf eine andere Schale mit kaltem 1x PBS. Die Schale auf dem Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,6-1,9 bis alle Ventrikel abgerufen werden. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Epikardiale Explantation Kultur Hinweis: Kultur diese epikardialen Explantate entweder auf Glaskammer Dias oder auf Kollagen-Gel für Downstream-Anwendungen. <ol><li> Glaskammer Slides <ol><li> Zum Kulturmedium herzustellen, mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin und 2 ng / ml rekombinanten Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) zu Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Führen Sie alle Schritte in der Laminar-Flow-Haube. </li><li> Hinzufügen 500 ul Kulturmedium zu jeder Vertiefung eines 8-Well-Kammer. </li><li> Platzieren Sie jede ausgeschnittene Ventrikel in der Mitte eines gut. Richten Sie den Ventrikel die seziert Seite zu halten auf der Bodenfläche des Brunnens. </li><li> Setzen Sie vorsichtig die Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Zellkultur - Inkubator. </li><li> Pflegen Sie die Kultur mit einem Minimum an Störung die Explantate zu ermöglichen, zu haften. Die Bildung der epikardialen einschichtigen kann nach 48-72 Stunden beobachtet werden. </li><li> Zur Unterscheidung von Epikardder epikardialen einschichtigen Zellen in Differenzierungsmedium für weitere 6 Tage ial Zellen in glatten Muskelzellen, Kultur. Um die Differenzierung Medien vorzubereiten, fügen Sie 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 50 ng / ml rekombinantem transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) bis DMEM. </li><li> Ändern Sie den Kulturmedien an abwechselnden Tagen. </li></ol></li><li> Collagen Gel <ol><li> Bereiten Sie die Kollagen-Gel in einer 96-Well-Platte, die eine kommerzielle 3D-Collagen Kultur-Kit nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Um das gewünschte Volumen von Kollagen-Gel, mischen die entsprechende Menge an Kollagenlösung mit 5-fach von DMEM und Pipette auf und ab vorzubereiten. Die Lösung sollte gelb. </li><li> Fügen Sie einen entsprechenden Volumen von Neutralisierungslösung und gut mischen sofort durch Pipettieren von oben und unten. Die Lösung wird sich rosa. </li><li> Je 100 ul dieser Mischung in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen. Die Platte wird in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 30-60 min alniedrig das Gel zu polymerisieren. </li><li> Zugabe von 200 ul Kulturmedium zu jeder Vertiefung beschrieben. </li><li> Platzieren Sie jede ausgeschnittene Ventrikel in der Mitte eines gut. Richten Sie den Ventrikel zu halten, die seziert Seite nach unten auf das Kollagen-Gel (Spitze des Ventrikels sollte den Experimentator Gesicht). setzen Sie vorsichtig die Platte zurück in die Zellkultur-Inkubator. </li><li> Nach 3 Tagen, entfernen Sie die Ventrikel. Legen Sie die Platte zurück in die Zellkultur-Inkubator für 2 weitere Tage. </li><li> Ändern Sie den Kulturmedien an abwechselnden Tagen. </li></ol></li></ol> 3. Fixierung und Visualisierung Hinweis: Epikardiale Zellen können entweder Glaskammer Dias oder Kollagen-Gel sichtbar gemacht werden. <ol><li> Absaugen aus dem Kulturmedium und ein gleiches Volumen sterilen 1x PBS fügen Sie die Zellen zu waschen. </li><li> Fügen Sie gerade genug, um 4% Paraformaldehyd (PFA), um die Zellen zu decken. Fixieren die Zellen für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen PFA und waschen Explantate mit 1x PBST (1x PBS mit0,1% Triton X-100), die Zellen zu permeabilisieren. </li><li> Immunostain mit gewünschten Antikörper (zB Alexa Fluor 488-Phalloidin; ZO-1, α-Tubulin und α-smooth Aktin Muskel) 7. </li></ol>

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	<li>Mikawa, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+analysis+of+cardiac+morphogenesis:+discontinuous+formation+of+coronary+vessels.">Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).</li><li>Mikawa, T., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+mesoderm+generates+a+population+of+coronary+smooth+muscle+cells+migrating+into+the+heart+along+with+ingrowth+of+the+epicardial+organ.">Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ.</a> Dev Biol. 174, 221-232 (1996).</li><li>Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+formation+and+developmental+significance+of+the+epicardium:+a+review.">The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review.</a> Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).</li><li>von Gise, A., Pu, W. 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J., Ballard, V. L., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+outgrowth+inhibition+leads+to+compensatory+mesothelial+outflow+tract+collar+and+abnormal+cardiac+septation+and+coronary+formation.">Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation.</a> Circ Res. 87, 969-971 (2000).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Dev Cell. 8, 85-95 (2005).</li><li>Merki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+retinoid+X+receptor+alpha+is+required+for+myocardial+growth+and+coronary+artery+formation.">Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev Biol. 255, 334-349 (2003).</li><li>Huang, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+transcription+factors+mediate+epicardial+activation+during+heart+development+and+injury.">C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury.</a> Science. 338, 1599-1603 (2012).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx18+and+the+fate+of+epicardial+progenitors.">Tbx18 and the fate of epicardial progenitors.</a> Nature. 458, 8-9 (2009).</li><li>Rudat, C., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1+and+epicardial+fate+mapping.">Wt1 and epicardial fate mapping.</a> Circ Res. 111, 165-169 (2012).</li><li>Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial+cells+express+Wilms'+tumor-1:+Wt1+expression+in+the+developing,+adult+and+infarcted+heart.">Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).</li><li>Iyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+derivation+of+epicardium+and+its+differentiated+smooth+muscle+cell+progeny+from+human+pluripotent+stem+cells.">Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells.</a> Development. 142, 1528-1541 (2015).</li><li>Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+the+epicardial+lineage+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Es ist entscheidend, Techniken zu entwickeln, die die Untersuchung der Epikard erleichtern die zunehmende Bedeutung des Epikard in kardialen Entwicklung und Regeneration zu sorgen. Die epikardiale Kultursystem stellt erhebliche Vorteile für epikardiale Forschung. Eine alternative Möglichkeit epikardialen Zellen zu isolieren, ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) eingesetzt werden. Dieses Verfahren beruht auf der Verwendung von epikardialen Marker (oder Epikard-Zell-spezifisc...

Eine Fülle von experimentellen Daten haben gezeigt, dass die Epikard kritischen Schritte in der Herzentwicklung beeinflusst. Während der Entwicklung gibt das Septum transversum Aufstieg zu einem Klumpen von Mesothelzellen als Proepikard bekannt 1-4. Zellen aus dem Proepikard dann wandern und das Myokard Bildung der Epikard umhüllen. Im Anschluss daran durchlaufen eine Untergruppe von Zellen epikardialen EMT was zu einer Population von wandernd Epikard-abgeleiteten Zellen (EPDCs), der anschließend das Myokard eindringen. Genetic sowie retrovirale lineage Verfolgungsexperimente haben gezeigt, dass EPDCs in verschiedenen Abstammungen, einschließlich glatter Muskelzellen differenzieren, Fibroblasten, Endothelzellen und Kardiomyozyten (falls vorhanden). Daher EPDCs tragen wesentlich zur Entwicklung der Koronargefäße und myokardiale Architektur 1,2,4-9. Darüber hinaus ist das Epikard wesentlich für die Entwicklung der ventrikulären Preßkörperschicht 10-12. Für example Gittenberger-de Groot et al. zeigten , daß das Auswachsen der Proepikard Hemmung führt zu einer Reihe von Defekten, wie einer dünnen Myokard defizienten Umschlingung des Herzens und abnormal interventrikulären Septum Bildung und als Ergebnis 13 embryonaler Letalität. Parakrine Faktoren aus dem embryonalen Epikard sezerniert modulieren Kardiomyozyten Proliferation und Differenzierung. Übereinstimmend damit Epikard spezifische Deletion von Signalwegen wie Retinsäure (RA), Fibroblasten - Wachstumsfaktoren (FGFs) und Wnt / β-Catenin in Folge fehlerhaften myocardial Wachstum und embryonaler Letalität 14-16. Obwohl das Epikard in erwachsenen Herzen Ruhe sein wurde geglaubt, haben neuere Studien gezeigt , dass das Entwicklungsprogramm 17,18 folgenden Herzschädigung in das Epikard reaktiviert. Nach der Aktivierung durchlaufen die Zellen schnelle Verbreitung und EMT, die in EPDC Bildung führen. Diese Zellen zeigen die capacity in Fibroblasten und glatten Muskelzellen zu differenzieren , jedoch nicht Kardiomyozyten oder Endothelzellen 18. Darüber hinaus scheiden die EPDCs proangiogenic Faktoren, die Hilfe bei der Vaskularisierung des verletzten Bereich und somit durch eine Verringerung der Infarktgröße verbesserte Herzfunktion erleichtern. Aufgrund dieser Befunde wurde die Epikard Interesse bei der Untersuchung von Herz-Kreislauf-Entwicklung, der Krankheit und Regeneration gewonnen. Transgene Technologie hat die medizinische Forschung im 21. Jahrhundert revolutioniert. Mit Hilfe von transgenen Technologien, imitiert erkrankten Maus-Modellen den menschlichen Zustand metabolisch und pathophysiologisch erfolgreich entwickelt. Doch in diesen Mutanten die epikardiale Zellverhalten zu studieren war eine Herausforderung vor allem wegen der frühen embryonalen Letalität gewesen. Angesichts der bedeutenden Rolle, die das Epikard in kardialen Entwicklung und Regeneration spielt, haben wir ein in - vitro - Kultursystem für die Maus etabliert epicardial-Zellen. Dieses Verfahren ermöglicht die langfristige Kultur der epikardialen Zellen und erleichtert die detaillierte Untersuchung der zwei wichtige Eigenschaften des Epikard: ihre Fähigkeit zur Migration und zu differenzieren. Die exzidierten Ventrikel von der Maus konnte auf Kollagen-Gelen gezüchtet werden, die verwendet werden können, um Migrationsassays durchzuführen. Wird in einer 3D - Matrix kultiviert, die das Kollagen-reiche extrazelluläre Matrix der subepikardialen Schicht rekapituliert Physiologie der in vivo - Zelle besser repliziert. Alternativ können sie auf der Kammer gleitet, um kultiviert werden, um eine epikardiale Monoschicht zu schaffen, die dann für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann. Diese Monoschicht kann verwendet werden für tight junction-Proteine ​​zu färben, die Erkenntnisse über die Fähigkeit des Epikard liefert EMT zu unterziehen, die für die Migration von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus können auch auf diesen Zellen durchgeführt Experimente Differenzierung werden. Weiterhin kann Genexpressionsprofil durch Extrahieren von RNA aus den Zellen analysiert werden, undDurchführung quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Schließlich könnten auch die Monoschichten mit Mitteln, durch eine molekulare Analyse gefolgt behandelt werden für potentielle Therapeutika zu testen. Stellen Sie sich diese epikardialen Kultursystem bietet uns die Möglichkeit, zu visualisieren und molekularen Daten sammeln, die unser Verständnis über epikardiale Entwicklung fördert. Ein weiteres wünschenswertes Merkmal dieses Verfahrens ist, dass es einfach ist und keine aufwendige Einrichtung erforderlich ist. Kurz gesagt, werden die Embryonen bei E11,5 oder E12,5 folgenden geerntet, die das Herz herausgeschnitten wird. Die Ventrikel sind dann kultiviert entweder auf Kollagen-Gel oder eine Kammer gleitet. Anschließend können diese Zellen verwendet werden, stromabwärts Experimente durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin solution</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 antibody</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T 6074</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-smooth muscle actin (SMA) antibody</td><td>Sigma</td><td>A 2547</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin antibody</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>3D Collagen Culture kit&amp;nbsp;</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>ECM 675</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>NNU 154534-PK</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Superscript First Strand Synthesis kit</td><td>Life Technologies</td><td>11904-018</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro culture of epicardial cells from mouse embryonic heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

Mit Hilfe dieses Kulturprotokoll können primäre epikardialen Zellen mit hoher Reinheit für Downstream-Anwendungen isoliert werden. Die kultivierten Zellen sind in der Lage EMT zu unterziehen, wandern und zu differenzieren wie epikardialen Zellen in vivo zu tun. Um die Reinheit unserer primären epikardialen Zellkultur bestimmen, analysierten wir die epikardiale Explantate erzeugt aus Sema3d GFPCre...

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In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

7.4K Aufrufe.  Duke-NUS Graduate Medical School. The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells. 

Serie: In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

In Vitro-Generierung von Mausherzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Elektroporationsbasierte Transgenese von Herzzellen in Mausherzen

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Autor im Rampenlicht: Transgenese von Herzzellen für schnelles Gen-Screening

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Biologie

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

In - vitro - Kultur von Epikardiale Zellen aus embryonalen Maus - Herz

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

In Vitro-Generierung von Mausherzfeldspezifischen Herzvorläuferzellen

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Isolieren Primäre Melanozyten-ähnlichen Zellen aus der Maus Herz

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

A Novel

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen