This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

זהירות: ניסויים כרוכים בשימוש של איזוטופ רדיואקטיבי 32 P ולא עבודה צריכה להתבצע עד שכל תנאי הבטיחות המתאימים מולאו. באופן כללי אנשים נדרשים להשתתף בקורס בטיחות ועוברים בפועל בפיקוח לפני ניסויים באמצעות ריאגנטים רדיואקטיבי. אנא בציוד מגן אישי (מד מינון thermoluminescent, משקפי מגן, כפפות, מעילים במעבדה חדר קרינה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעליים) בעת ביצוע התגובה. 1. הכנת חומרי Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הנדרש חלבונים עבור assay תמלול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך הניסוי המתואר כאן, overproduce ולטהר E. coli RNAP במעבדה כמתואר 11, או להשיג ממקור מסחרי (רשימת חומרים). הערה: שניהם מספקים תוצאות דומות. שיטות אחרות לטיהור RNAP שכותרתו יליד או זיקה יכולות לשמש גם 12,13. גורמי Sigma / נוסה ניתן להשיג גם דescribed בעבודה קודמת 14,15. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים הערה: לחילופין, RNase ללא מים ניתן להשיג ממקורות מסחריים (רשימת חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל diethyl pyrocarbonate (DEPC) עד 1 ליטר של מים מטוהרים (0.1% v / v) ומערבבים לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים וטיפים DEPC החיטוי פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תבנית ה- DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פלסמיד pSG1154 16 ו / או pIA226 17 באמצעות ערכת טיהור פלסמיד (רשימת חומרים) על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר את תבנית עבור מבחני שעתוק נגר (שבר 360 נ&quot;ב המקיף באזור P xyl האמרגן), להרכיב תגובת PCR על הקרח כולל 25 μl תערובת 2x PCR (חומרים רשימה), 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(קדימה) 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (הפוכה), 1 μl pr פלסמיד pSG1154eparation (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> או לחלופין, עבור מבחני שעתוק סיבוב בודד, להגביר שבר 447 נ&quot;ב המקיף באזור האמרגן λ P R מ pIA226 17. הגדרת תגובת PCR על הקרח באמצעות 25 μl תערובת 2x PCR, 2 μl כל אחד פריימרים (5 מיקרומטר): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(קדימה) 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (הפוכה), 1 μl pIA226 17 הכנה פלסמיד (250 מיקרומטר) ו -20 μl מים מטוהרים). הערה: תבנית זו נעדרת ציטוזין עד לתפקיד +26 NT, המהווה את נוקלאוטיד -26 מאתר תחילת שעתוק. לכן, שעתוק באמצעות תבנית זו תאפשר ייזום, אישור אמרגן השתהות בבית +26 NT להקים קומפלקס התארכות שעתוק יציב (EC) כאשר ATP, UTP בלבד GTP נוכחי התגובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובת PCR עם התנאים הבאים: 95 °; צלזיוס למשך 30 שניות, 50 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C למשך 30 שניות, חוזרות במשך 30 מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את המוצר באמצעות ערכת ניקוי PCR (רשימת חומרים) על פי הוראות היצרן ו elute חיץ שעתוק 100 μl עבור assay שעתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז ה- DNA תבנית באמצעות fluorospectrometer (רשימת חומרים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת NTP הערה: NTPs ניתן להשיג ממקורות מסחריים שונים (רשימת חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים NTPs (≥99% טהור) במים DEPC שטופלו לעשות 1 M מלאי, aliquot 1 מ&quot;ל של התמיסה לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל (50 μl בצינור אחד) ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזמין α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol) לפני הניסוי. 32 P יש זמן מחצית חיים קצר של 14.29 ימים. הערה: UTP שימוש שכותרתו אלפא ימנע השוואת עוצמת להקות עם אורך שונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין סולם RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב את המעקבing התגובה בטמפרטורת החדר: 0.5 מיקרוגרם Mix תבנית רנ&quot;א (רשימת חומרים), 80 pH7.5 חיץ HEPES מ&quot;מ, 12 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 מ&quot;מ DTT, 2 מ&quot;מ ATP / CTP / GTP, 0.5 מ&quot;מ UTP, 2 μl α- 32 P UTP, 0.5 μl RNAP T7 (רשימת חומרים), DEPC שטופלו מים עד 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תגובה להמשיך ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. הכנת RNA רצף ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הצלחות מן מנגנון ג&#39;ל רצף (רשימת חומרים) פעמים עם אתנול 70% ומים מטוהרים, ולהרכיב את התא עם מסרק ושני מפרידים. הערה: צלחת אחת יכולה להיות מצופים מגיב siliconizing (רשימת חומרים) כדי להקל על הסרת ג&#39;ל שלב 4.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים אוריאה 33.6 גרם ב -22 מ&quot;ל מים 16.4 מ&quot;ל של 5x טריס / Borate / EDTA חיץ (TBE) (54 גרם טריס (hydroxymethyl) aminomethane; 27.5 גרם חומצת בור; 10 מ&quot;ל של 1 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), pH 7.4 ב 1 מי L) באמצעות בוחש מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 16 מ&quot;ל של 40% Acrylamide / bis-acrylamide פתרון (19: 1) לפתרון אוריאה ולסנן דרך פילטר 0.45 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 514 μl 10% (w / v) persulfate אמוניום מוכן טרי במים ואחריו 51.4 μl N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethylethylenediamine (TEMED) לפתרון מסוננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפוך את הפתרון ג&#39;ל כדי למנוע אוורור יתר ולהזריק מייד בצורה חלקה לתוך התא רצף מראש ארז הממוקם אופקי מחור ההזרקה התחתון. תשמור על עצמך כדי להימנע בועות במהלך הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר 1-1.5 שעות עד הג&#39;ל מוגדר לחלוטין לפני השימוש ב assay שעתוק. הג&#39;ל ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר למשך יומיים או שלושה, כאשר עטוף רקמה מים רטוב על החלק העליון של התא רצף. </li></ol></li></ol> בתגובה שעתוק 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay השהיית תמלול התארכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינונה של קומפלקס התארכות שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של אנזים הליבה rnab (1 מיקרומטר המניות חיץ שעתוק) לצינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של גורם סיגמא-70 מטוהרים (σ 70; 3 מיקרומטר המניות חיץ שעתוק) אל RNAP דגירה על קרח למשך 10 דקות כדי ליצור RNAP holoenzyme. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 תבנית ה- DNA מטוהרים μl 500 ננומטר (האמרגן R P λ מהמוצר pIA226 PCR) במאגר שעתוק אל holoenzyme RNAP לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי ליצור המתחם פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת של מרכיבי התגובה אחרת צינור 1.5 מ&quot;ל באמצעות 5 μl של חיץ שעתוק 10x (רשימת חומרים: 400 מ&quot;מ טריס- HCl, 1.6 KCl M, 100 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM DTT, 50% גליצרול, pH 7.9 ב DEPC שטופלו מים), 2 μl של 250 מיקרומטר אחד GTP ו UTP, 1 μl של 1 מ&quot;מ ATP, ו 1 μl של α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol). מוסיפים מים מטופלים DEPC ל -41 μl. לאטה: מעכב RNase (רשימת חומרים) שניתן להשתמש בהם כדי למזער את זיהום RNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את פתרון תערובת הצינור המכיל המתחם הפתוח לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי ליצור את מורכבות התארכות שעתוק עצר +26 NT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התגובה לטמפרטורת החדר (~ 21 ° C) ולהוסיף 1 μl של 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ריפמפיצין לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של 0.1 מ&quot;מ מטוהרים נוסה לתערובת התגובה דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 250 מיקרומטר CTP לתוך התערובת לתגובה ליצור נפח סופי של 50 μl ולמדוד את זמן התגובה באמצעות טיימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 μl של פתרון התגובה לתוך 2 μl של חיץ טעינת ג&#39;ל RNA (לפוראמיד 95%, 0.05% bromophenol כחול cyanol קסילן 0.05%) ב 30, 60, 120, 240, 480, ו -1,200 שניות כדי להרוות את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך 32 P UTP טיפים וצינורות בתוך המשך פסולת רדיואקטיביתainer. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמלול ייזום Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כינונה של הקומפלקס להרחיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מטוהרים σ 70 כדי 0.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1.1.1 כדי 3.1.1.3 באמצעות 0.5 מיקרומטר (במקום 3 מיקרומטר) מטוהרים σ 70, ואת תבנית ה- DNA (באזור האמרגן P xyl ממוצר pSG1154 PCR). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכוב של assay ייזום שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מעכבי שנועדו למנוע היווצרות RNAP holoenzyme כדי אנזים הליבה RNAP לפני תוספת של σ 70 (אחרי 3.1.1.1 שלב), ואחריו צעדים 3.1.1.2 ו 3.1.1.3 לבחון האם מעכב הוא מסוגל לשבש holoenzyme היווצרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לאחר שלב 3.1.1.2, להוסיף מעכב לבחון האם הוא מסוגל לעכב תחרותי σ 70 קשירה RNAP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש באותה הכמות של DMSO, הממס של המעכב, במקום מעכב היםטוק בתגובות שליטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלמת התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים הפרין במים לריכוז מלאי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו המניה ב -20 ° C. הערה: הפרין הוא מתחרה של ה- DNA שיכול לעקל RNAP שלא יצר מורכבות פתוחות. לאחר במתחם הפתוח נוצר, הפרין לא יכול להיכנס לאתר DNA המחייב של RNAP ומעכב שעתוק מתסביך פתוח מראש יצר. לכן, הפרין נדרש רק עבור מבחני יחיד עגול; זה אינו נחוץ עבור מבחנים רבים-עגולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת התגובה באמצעות 5 μl של 10x חיץ שעתוק (רשימת חומרים), 1 μl של 1 מ&quot;ג / פתרון הפרין מ&quot;ל, 1 μl של 10 מ&quot;מ כל ATP, GTP, ו CTP, 2.5 מ&quot;מ UTP, ו 1 μl של α- 32 P UTP (3,000 Ci / mmol). מוסיפים מים מטופלים DEPC 45 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את תערובת התגובה עם מורכבות שעתוק פתוחות, הספין הדופק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 10 μl של תגובה כהlution לתוך 5 μl של חיץ טעינת ג&#39;ל RNA (לפוראמיד 95%, 0.05% bromophenol כחול cyanol קסילן 0.05%) כדי להרוות את התגובה. </li></ol></li></ol></li></ol> ריצה ופיתוח 4. RNA ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצת ג&#39;ל denaturing polyacrylamide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 50 מעלות צלזיוס ו -50 W במאגר 1x TBE כ 1.5 שעות עד לטמפרטורה של ג&#39;ל למאגר יציב ב -50 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם דגימות ב 90 ºC למשך 30 שניות ולהעביר אותם על טעינה לפני קרח על הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טען לתוך הבורות העליון של ג&#39;ל לצד נתיב אחד המכיל 2 סולם RNA μl (1: 100 דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 50 וואט ו -50 ºC במאגר 1x TBE עד לצבוע בכחול bromophenol מגיע ~ 2/3 למטה הג&#39;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל הטיפולי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב לאט ובזהירות להפריד את הצלחת העליונה מתא הרצף. להקדיש תשומת לב רבה כדי למנוע את שבירת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cut chromatograpHY נייר (רשימת חומרים) כדי להתאים את גודל ג&#39;ל מלמעלה צבע כחול bromophenol. השתמש מונה גייגר כדי לאשר את המיקום המשוער של תעתיקי רנ&quot;א שכותרתו רדיואקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכסות את הג&#39;ל עם נייר הסינון, ולחץ בחוזקה עד הג&#39;ל שומר על נייר הסינון. חותכים וזורקים את החלק התחתון של הג&#39;ל פסולת רדיואקטיבית כמו NTPs מאוגדים עד לבסיסו של ג&#39;ל, אשר יכול להיות חם מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח פיסה בגודל דומה של נייר סינון על מיטת הייבוש של מכונת ואקום ייבוש, ובזהירות להניח את הנייר מצופה-ג&#39;ל על זה עם הצד ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את ג&#39;ל עם בניילון יבש ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטפים את הצד השני של נייר הסינון מצופה ג&#39;ל בניילון נצמד, ומניחים על צלחת זרחן photostimulable במקרה הדמיה, עם זמן חשיפה מתאימה, אשר יכול לנוע בין 1 hr לילה תלוי יעילות התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת צלחת זרחן באמצעותסורק תרמי על פי הוראות היצרן. לקבוע את עוצמת הלהקה יחסית באמצעות תוכנת ImageJ פי הוראות התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה גייגר לבדוק את זיהום רדיואקטיבי באזור העבודה, לנגב את הפריטים החשודים ואזור עם רקמות חומר ניקוי ולהיפטר הרקמה בתוך המיכל לרשות. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+by+RNA+polymerase:+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation.">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li><li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does.">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li><li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA:+the+basic+mechanisms.">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li><li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase.">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li><li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA.">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li><li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination.">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li><li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+at+the+core:+Similarities+among+bacterial,+archaeal,+and+eukaryotic+RNA+polymerases.">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li><li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase?.">Is it easy to stop RNA polymerase?.</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li><li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development.">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li><li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li><li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase.">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li><li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions.">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design:+From+in+silico+screening+to+validation.">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li><li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex.">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li><li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis.">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li><li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals.">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li><li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+&#197;+resolution.">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 &#197; resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li><li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp.">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li><li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes.">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li><li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation.">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בכל היצורים, שעתוק הוא תהליך מוסדר בחוזקה. מבחני שעתוק במבחנה פותחו כדי לספק פלטפורמה לבדיקת ההשפעות של גורמי שעתוק, מולקולות קטנות ומעכבי שעתוק. במאמר בשיטה זו, assay שעתוק חיידקים כללי תוארה. מבחני תמלול בשילוב עם ג&#39;ל אלקטרופורזה רצף של תמלילים חשובים מאוד...

תמלול הוא התהליך שבו RNA מסונתז מתבנית DNA ספציפית. בתאים איקריוטיים ישנם שלושה RNAPs ברורים: RNAP שאני מעתיק מבשרי rRNA, RNAP השנייה אחראי לסינתזה של mRNA ו RNAs הגרעיני הקטן מסוים, ואת הסינתזה של 5S rRNA ו tRNA מבוצעת על ידי RNAP III. אצל חיידקים, יש רק אחד RNAP אחראי שעתוק של כל סוגי RNA. ישנם שלושה שלבים של שעתוק: ייזום, התארכות והפסקה. תמלול הוא אחד התהליכים המוסדרים הגבוה ביותר בתא. כל שלב במחזור שעתוק מייצג מחסום להסדרת ביטוי גנים 1. לקבלת החניכה, RNAP יש לשייך גורם סיגמא לגבש holoenzyme, אשר נדרש לכוון את האנזים לאתרים ספציפיים בשם היזמים 2 כדי ליצור תסביך האמרגן פתוח. בהמשך לכך, חבילה גדולה של גורמי שעתוק האחראים o תקנהf RNAP פעילויות במהלך שלבי התארכות והפסקה. גורם השכפול נבחן כאן הוא החלבון השמור ביותר וחיוני, נוסה. הוא מעורב בויסות שהשהית שעתוק והפסקה, כמו גם סיום אנטי במהלך סינתזת rRNA 3-5. במבחנה מבחני שעתוק פותחו כלים רבי עוצמה כדי ללמוד את הצעדים הרגולטוריים מורכבים במהלך שעתוק 6. באופן כללי, שבר ליניארי של DNA כולל אזור האמרגן נדרש כתבנית עבור שעתוק. תבנית ה- DNA בדרך כלל מופק על ידי PCR או על ידי ליניאריזציה פלסמיד. חלבונים NTPs מטוהרים (כולל רדיואקטיבי אחד NTP למטרות זיהוי) מתווספים אז המוצר ניתח בעקבות התקופה הנדרשת של דגירה. שימוש בתבניות מתאימות ותנאי תגובה, בכל שלבי שעתוק נבחנו באמצעות גישה זו אשר אפשרה אפיון מולקולרי מפורט של transcription לעומת מחצית המאה הקודמת 7. בשילוב עם מידע על המבנה 3-הממדי של RNAP זה גם יכל לחקור את המנגנון המולקולרי של עיכוב שעתוק על ידי אנטיביוטיקה מובילה אנטיביוטי, ולהשתמש במידע זה בפיתוח תרופות חדשות, שיפור 8-10. בעבודה זו אנו מספקים דוגמאות לאופן מבחני שעתוק יכולים לשמש כדי לקבוע את מנגנון הוויסות ידי התארכות שעתוק / גרם סיום נוסה, ואיך את מנגנון הפעולה של עופרת מעכב ייזום שעתוק רומן ניתן לקבוע.

<table><tbody><tr><td>Obtain the proteins required for transcription assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of DEPC-treated water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>High Purity rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactive compound</td></tr><tr><td>RNA ladder preparation&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcription Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM Chr Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive decontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

במבחנת מבחני שעתוק פותחו בשימוש נרחב במשך שנים רבות כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים שעתוק. תהליך זה דורש RNA פולימראז רב למקטע תלוי DNA (RNAP) וסדרה של גורמי שעתוק שפועלים כדי להשפיע על פעילותם של RNAP במהלך ביטוי גנים. רצף ג&#39;ל אלקטרופורזה של תמלילי רדיואקטיבי משמשת כדי לספק מידע מכניסטית מפורט על איך תמורת שעתוק ומה פרמטרים יכול להשפיע על זה. במאמר זה נתאר את הפרוטוקול ללמוד כיצד גורם התארכות החיונית נוסה מסדיר ששהייה תעתיק, כמו גם שיטה לזיהוי סוכן אנטיבקטריאלי מיקוד ייזום שעתוק באמצעות עיכוב של היווצרות holoenzyme RNAP. שיטות אלה יכולים לשמש כפלטפורמה לפיתוח גישות נוספות כדי לחקור את מנגנון הפעולה של גורמי התעתוק אשר עדיין אינו ברור, כמו גם Agen אנטיבקטריאלי חדשts מיקוד שעתוק אשר מהווה יעד תרופה מנוצלים במחקר ופיתוח אנטיביוטי.

יעילות השעתוק יכול להיקבע על ידי מדידת רמת הקרינה הלהקות בנקודות זמן שונות. את assay השהיה כדי לבדוק את הפונקציה של גורם נוסה לאפשר הדמיה של הפסקה, פיטורין, לבין נגר מוצרים (איור 1 א). בנוכחות של תחום N-terminal של נוסה (נוסה NTD; שאריות חומצת אמינו 1-137),...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery at JoVE.com

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K Views.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Video: In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Biochemistry

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Cancer Research

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medicine

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Immunology and Infection

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA polymerase, e.g. T7. Due to the high cost of IVT reagents,&#160; IVT is a critical step in the mRNA drug substance production process and has been the focus of intense optimization in the field. To decrease the cost of mRNA production, reagents must be utilized optimally. Effective optimization necessitates a comprehensive understanding of the impact of individual reagents on reaction kinetics, i.e., the consumption of nucleoside triphosphates (NTPs) and the production of mRNA. Traditionally, low-throughput, end-point analytical techniques have been used for the analysis of mRNA. Though such methods give valuable information on mRNA content, at-line, near real-time analytics is needed to fully understand IVT reaction. We demonstrate how a liquid chromatography analytical method that separates NTPs, as well as pDNA and mRNA, can be used in near real-time to study IVT reaction kinetics. With the knowledge of the influence of different IVT components on kinetics and yield, rapid chromatographic analysis can be used to convert batch IVT reaction into a fed-batch mode that further increases productivity and reduces the overall cost of the reaction.

Optimizing in vitro transcription (IVT) is critical for cost-effective mRNA production. This protocol details an analytical chromatographic method for at-line analysis of IVT reaction, monitoring NTP depletion and mRNA production in batch or fed-batch modes, applicable to various RNA modalities, enhancing productivity and reducing costs.

אופטימיזציה של תגובת שעתוק במבחנה לייצור mRNA באמצעות ניטור כרומטוגרפי בקו

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

ב מחוץ לחוק העתק RNA-מבוססי לוציפראז העיתונאי שיטת המחקר בקרת תרגום ב Poxvirus-תאים נגועים

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioengineering

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Biology

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...