This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Attenzione: Gli esperimenti prevedono l&#39;utilizzo della radioattivo dell&#39;isotopo 32 P e nessun lavoro dovrebbero essere intraprese fino a quando tutte le condizioni di sicurezza adeguate sono state soddisfatte. In generale il personale sono tenuti a frequentare un corso di sicurezza e sottoposti pratica supervisionata prima di esperimenti usando reagenti radioattivi. Si prega di indossare dispositivi di protezione individuale (dosimetro thermoluminescent, occhiali di sicurezza, guanti, camici camera radiazioni, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe) quando si esegue la reazione. 1. Preparazione di materiali necessari al test <ol><li> Ottenere il proteine ​​necessarie per il dosaggio di trascrizione. <ol><li> Per l&#39;esperimento descritto qui, sovrapproduzione e purificare E. coli RNAP in laboratorio come descritto 11, o ottenere da una fonte commerciale (Materials List). Nota: entrambi forniscono risultati simili. Altri metodi per la purificazione di RNAP nativo o affinità etichettati possono anche essere usate 12,13. Sigma / fattori Nusa possono essere ottenuti come ddescritto nella precedente lavoro 14,15. </li></ol></li><li> Acqua Preparazione di dietilpirocarbonato (DEPC) trattati Nota: In alternativa, l&#39;acqua RNase-free può essere ottenuto da fonti commerciali (Materials List). <ol><li> Aggiungere 1 ml dietilpirocarbonato (DEPC) a 1 L di acqua purificata (0,1% v / v) e miscelare notte. </li><li> acqua DEPC autoclave e suggerimenti per due volte. </li></ol></li><li> DNA stampo Preparazione <ol><li> Purificare plasmide pSG1154 16 e / o 17 pIA226 utilizzando un kit di purificazione plasmide (Elenco materiali) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Per amplificare il modello per le analisi di trascrizione run-off (un frammento di 360 bp che comprende la regione xyl promotore P), assemblare una reazione di PCR in ghiaccio tra cui 25 microlitri 2x PCR mix (Elenco materiali), 2 ml ciascuno dei primer (5 micron) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(in avanti) e 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (reverse), 1 ml pSG1154 plasmide preparation (250 mM) e 20 ml di acqua depurata). <ol><li> Oppure, in alternativa, per i singoli saggi di trascrizione rotonde, amplificare un frammento di 447 bp che comprende la regione R promotore λ P da pIA226 17. Impostare una reazione di PCR in ghiaccio con 25 microlitri 2x PCR mix, 2 ml ciascuno dei primer (5 micron): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(in avanti) e 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (reverse), pIA226 1 ml 17 miniprep (250 mM) e 20 ml di acqua depurata). Nota: Questo modello manca citosina fino alla posizione +26 nt, che è il 26 ° nucleotide dal sito di inizio della trascrizione. Pertanto, trascrizione utilizzando questo modello consentirà apertura, passaggio promotore e stallo al +26 nt per formare un complesso di allungamento trascrizione stabile (CE), quando solo ATP, UTP e GTP sono presenti nella reazione. </li></ol></li><li> Impostare una reazione PCR con le seguenti condizioni: 95 °; C per 30 sec, 50 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec, ripetendo per 30 cicli. </li><li> Purificare il prodotto utilizzando un kit PCR clean-up (Materials List) secondo le istruzioni del produttore ed eluire in 100 microlitri di buffer di trascrizione per il saggio di trascrizione. </li><li> Determinare la concentrazione modello di DNA utilizzando un fluorospectrometer (Materials List). </li></ol></li><li> NTP Preparazione Nota: PTR possono essere ottenuti da diverse fonti commerciali (Materials List). <ol><li> Sciogliere PTR (≥99% puro) in acqua DEPC trattati per fare 1 m stock, aliquota 1 ml della soluzione in provette da 1,5 ml (50 ml in ciascun tubo) e conservare a -20 ° C. </li><li> Ordine α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) prima dell&#39;esperimento. 32 P ha una breve emivita di 14.29 giorni. Nota: Usando UTP alpha-marcato evita confrontando l&#39;intensità delle bande di diversa lunghezza. </li></ol></li><li> Preparazione RNA Ladder <ol><li> Montare il followreazione ing a temperatura ambiente: 0,5 mg di RNA Template Mix (Materials List), 80 mm tampone HEPES pH7.5, 12 mm MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 microlitri T7 RNAP (Elenco materiali), acqua DEPC trattati a 20 ml. </li><li> Lasciare reazione di procedere a 37 ° C per 1 ora. Utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di RNA Sequencing Gel <ol><li> Gel di Preparazione <ol><li> Pulire le piastre da un apparato gel di sequenziamento (Materials List) due volte con etanolo al 70% e acqua purificata, e assemblare la cella con un pettine e due distanziatori. Nota: Un piatto può essere rivestito con siliconatura reagente (Materials List) per facilitare la rimozione di gel nel passaggio 4.2. </li><li> Sciogliere 33,6 g di urea in 22 ml di acqua e 16,4 ml di borato EDTA (TBE) tampone / (54 g tris (idrossimetil) aminomethane / 5x Tris; acido borico 27,5 g; 10 ml di 1 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 7,4 in 1 L di acqua) con un agitatore magnetico. </li><li> Aggiungere 16 ml di 40% / soluzione acrilamide bis-acrilamide (19: 1) per la soluzione di urea e filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. </li><li> Aggiungere 514 microlitri al 10% (w / v) di persolfato di ammonio appena preparato in acqua seguita da 51,4 ​​microlitri N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethylethylenediamine (TEMED) alla soluzione filtrata. </li><li> Capovolgere delicatamente la soluzione di gel al fine di evitare un eccessivo aerazione e iniettare immediatamente e senza intoppi nella cella di sequenziamento preconfezionata posizionato orizzontalmente dal foro di iniezione fondo. Fare attenzione a evitare di fare le bolle durante l&#39;iniezione. </li><li> Consentire 1-1,5 ore finché il gel sia completamente indurito prima dell&#39;uso in un test di trascrizione. Il gel può essere conservato a temperatura ambiente per due o tre giorni, quando avvolto con tessuto bagnato acqua sulla parte superiore della cella sequenziamento. </li></ol></li></ol> 3. Trascrizione di reazione <ol><li> Trascrizione Allungamento Assay Pausa <ol><li> Formazione di un complesso di allungamento trascrizione <ol><li> Aggiungere 1 ml di RNAP nucleo dell&#39;enzima (1 mM magazzino in tampone trascrizione) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di purificato sigma-70 fattore (σ 70; 3 micron magazzino nel buffer di trascrizione) per la RNAP e incubare in ghiaccio per 10 minuti in modo da formare RNAP oloenzima. </li><li> Aggiungere 3 ml 500 nM template purificato DNA (λ P R promotore dal prodotto pIA226 PCR) in tampone di trascrizione alla holoenzyme RNAP e incubare a 37 ° C per 5 minuti per formare il complesso aperto. </li><li> Preparare una miscela di componenti di reazione in un&#39;altra provetta da 1,5 ml con 5 ml di 10x tampone di trascrizione (Elenco materiali: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 50% glicerolo, pH 7,9 a DEPC trattati acqua), 2 ml di 250 micron ciascuna GTP e UTP, 1 ml di 1 mm ATP, e 1 ml di α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Aggiungere acqua trattata DEPC a 41 ml. Note: inibitore RNasi (Materials List) può essere usato per ridurre la contaminazione RNasi. </li><li> Trasferire la soluzione della miscela nella provetta contenente il complesso aperto e incubare a 37 ° C per 15 minuti per formare il complesso di trascrizione allungamento fermato a +26 nt. </li><li> Spostare la reazione a temperatura ambiente (~ 21 ° C) e aggiungere 1 ml di 2,5 mg / ml rifampicina ad una concentrazione finale di 50 pg / ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,1 mM purificati Nusa alla miscela di reazione e incubare per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2 ml di 250 mM CTP nella miscela di reazione per fare un volume finale di 50 microlitri e misurare il tempo di reazione usando un timer. </li><li> Trasferimento 5 ml di soluzione di reazione in 2 ml di tampone RNA gel di carico (95% formammide, 0,05% blu di bromofenolo e lo 0,05% xilene cianolo) a 30, 60, 120, 240, 480 e 1.200 sec per placare la reazione. </li><li> Smaltire le punte 32 P UTP e tubi in un cont rifiuti radioattiviAiner. </li></ol></li></ol></li><li> Trascrizione iniziazione Assay <ol><li> La formazione della Open Complex <ol><li> Diluire purificato σ 70-0,5 micron. </li><li> Ripetere i punti 3.1.1.1 al 3.1.1.3 utilizzando 0,5 micron (invece di 3 micron) purificato σ 70, e il modello di DNA (la regione xyl promotore P dal prodotto pSG1154 PCR). </li></ol></li><li> L&#39;inibizione di test iniziazione di trascrizione <ol><li> Aggiungere l&#39;inibitore progettato per impedire la formazione di RNAP oloenzima di enzima nucleo RNAP prima dell&#39;aggiunta σ 70 (dopo il passo 3.1.1.1), seguita da passi 3.1.1.2 e 3.1.1.3 di esaminare se l&#39;inibitore è in grado di interrompere oloenzima formazione. </li><li> In alternativa, dopo la fase 3.1.1.2, aggiungere l&#39;inibitore di esaminare se sia in grado di inibire in modo competitivo σ 70 legame RNAP. </li><li> Utilizzare la stessa quantità di DMSO, il solvente dell&#39;inibitore, invece dell&#39;inibitore stock nelle reazioni di controllo. </li></ol></li><li> Il completamento della reazione <ol><li> Sciogliere eparina in acqua ad una concentrazione stock di 1 mg / ml e magazzino a -20 ° C. Nota: L&#39;eparina è un concorrente di DNA che può sequestrare RNAP che non ha formato un complesso aperto. Una volta che il complesso aperto è formato, eparina non può entrare nel sito di legame al DNA di RNAP e inibire la trascrizione dal complesso aperto preformato. Pertanto, l&#39;eparina è richiesta solo per i dosaggi turno unico; non è necessario per le analisi multi-rotonde. </li><li> Preparare la miscela di reazione con 5 ml di 10x tampone di trascrizione (Elenco materiali), 1 ml di 1 mg / ml di soluzione di eparina, 1 ml di 10 mm ciascuna ATP, GTP, e CTP, 2,5 mM UTP, e 1 ml di α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Aggiungere acqua trattata DEPC a 45 ml. </li><li> Mescolare la miscela di reazione con la trascrizione complesso aperto, rotazione impulso e incubare a 37 ° C per 20 min. </li><li> Trasferire 10 microlitri della reazione cosìluzione in 5 ml di tampone RNA gel di carico (95% formammide, 0,05% blu di bromofenolo e lo 0,05% xilene cianolo) per placare la reazione. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Esecuzione e sviluppo RNA Gel <ol><li> L&#39;esecuzione del gel poliacrilammide denaturazione <ol><li> Attivare il gel a 50 ° C e 50 W in 1x tampone TBE per circa 1,5 ore fino a quando la temperatura del gel e il buffer è stabile a 50 ° C. </li><li> campioni di calore a 90 ° C per 30 sec e spostarli sul ghiaccio prima di carico sul gel. </li><li> Caricare i campioni nei pozzetti sulla parte superiore del gel fianco una corsia contenente 2 microlitri scaletta RNA (diluizione 1: 100). </li><li> Attivare il gel a 50 W e 50 ° C in 1x tampone TBE fino a quando il colorante blu bromofenolo raggiunge ~ 2/3 verso il basso il gel. </li></ol></li><li> Trattamento Gel <ol><li> Aprire lentamente e con attenzione separare la piastra superiore dalla cella sequenziamento. Fare molta attenzione per evitare di rompere il gel. </li><li> Cut chromatography carta (Materials List) in base alle dimensioni del gel dall&#39;alto verso il colorante blu di bromofenolo. Utilizzare un contatore Geiger per confermare la posizione approssimativa di trascritti di RNA marcati radioattivamente. </li><li> coprire con cura il gel con la carta da filtro, e premere con decisione fino a quando il gel aderisce alla carta da filtro. Tagliare e gettare il fondo del gel di rifiuti radioattivi come PTR non costituite corrono al fondo del gel, che può essere molto caldo. </li><li> Posizionare un pezzo di dimensioni simili di carta da filtro sul letto di essiccazione di una macchina per essiccamento sotto vuoto, e adagiare il foglio gel rivestito su di esso con il gel verso l&#39;alto. </li><li> Coprire il gel con una pellicola trasparente e asciutto a 60 ° C per 1,5 ore. </li><li> Avvolgere l&#39;altro lato della carta da filtro rivestito gel di involucro di plastica e posizionare su un piatto fosforo fotostimolabile nel caso di imaging, con il tempo di esposizione appropriata, che può variare da 1 ora a seconda overnight sull&#39;efficienza reazione. </li><li> Immagine la piastra di fosforo conuno scanner imager in base alle istruzioni del produttore. Determinare l&#39;intensità della banda relativa utilizzando il software ImageJ secondo il manuale del software. </li><li> Utilizzare un contatore Geiger per controllare la contaminazione radioattiva nella zona di lavoro, pulire gli elementi sospetti e la zona con il tessuto e un detergente e smaltire il tessuto nel contenitore di smaltimento. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In tutti gli organismi, la trascrizione è un processo strettamente regolata. In vitro di trascrizione sono stati sviluppati per fornire una piattaforma per testare gli effetti dei fattori di trascrizione, piccole molecole e gli inibitori della trascrizione. In questo lavoro metodo, un saggio per la trascrizione batterica generale è stato descritto. saggi di trascrizione in combinazione con il sequenziamento elettroforesi su gel di trascrizioni sono molto importanti per gli studi meccanicistici in quanto conse...

La trascrizione è il processo in cui l&#39;RNA è sintetizzato da un modello di DNA specifico. Nelle cellule eucariotiche sono tre RNAPs distinte: RNAP che trascrive rRNA precursori, RNAP II è responsabile della sintesi di mRNA e di alcuni piccoli RNA nucleari, e la sintesi di rRNA 5S e tRNA viene eseguita da RNAP III. Nei batteri, c&#39;è solo un RNAP responsabile della trascrizione di tutte le classi di RNA. Ci sono tre fasi di trascrizione: inizio, allungamento e terminazione. La trascrizione è uno dei processi più altamente regolamentati nella cellula. Ogni fase del ciclo di trascrizione rappresenta un punto di controllo per la regolazione dell&#39;espressione genica 1. Per l&#39;inizio, RNAP deve associare a un fattore sigma per formare holoenzyme, che è necessario per dirigere l&#39;enzima a siti specifici chiamato promoters 2 per formare un complesso promotore aperta. Successivamente, una grande suite di fattori di trascrizione sono responsabili per la regolamentazione oattività f RNAP durante le fasi di allungamento e di terminazione. Il fattore di trascrizione qui esaminato è la proteina altamente conservata ed essenziale, Nusa. Esso è coinvolto nella regolazione della trascrizione pausa e risoluzione, così come anti-terminazione durante rRNA sintesi 3-5. In vitro di trascrizione sono stati sviluppati come potenti strumenti per studiare le fasi complesse di regolazione durante la trascrizione 6. In generale, un frammento lineare di DNA comprendente un promotore è richiesto come modello per la trascrizione. Il DNA templato è solitamente generato mediante PCR o linearizzazione un plasmide. proteine ​​purificate e PTR (tra cui uno radioattivo NTP a fini di rilevazione) sono poi aggiunti e dei prodotti analizzati dopo il periodo di incubazione richiesto. Utilizzando i modelli appropriati e condizioni di reazione, tutte le fasi della trascrizione sono stati esaminati utilizzando questo approccio che ha permesso la caratterizzazione molecolare dettagliato della trascription nel corso dell&#39;ultimo mezzo secolo 7. In combinazione con le informazioni sulla struttura 3-dimensionale delle RNAP è stato anche possibile sondare il meccanismo molecolare di inibizione della trascrizione da antibiotici e lead antibiotico, e utilizzare queste informazioni per lo sviluppo di nuovi farmaci migliorati 8-10. In questo lavoro fornendo esempi di come saggi di trascrizione possono essere utilizzati per determinare il meccanismo di regolazione mediante trascrizione allungamento / fattore di terminazione Nusa, e come il meccanismo di azione di un romanzo piombo inibitore inizio della trascrizione può essere determinato.

<table><tbody><tr><td>Obtain the proteins required for transcription assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of DEPC-treated water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>High Purity rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactive compound</td></tr><tr><td>RNA ladder preparation&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcription Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM Chr Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive decontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

In vitro trascrizione sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per molti anni per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella trascrizione. Questo processo richiede multi-subunità DNA-dipendente RNA polimerasi (RNAP) e una serie di fattori di trascrizione che agiscono per modulare l&#39;attività di RNAP durante genica. gel elettroforesi sequenziamento dei trascritti radiomarcati viene utilizzato per fornire informazioni meccanicistica dettagliate su come procede trascrizione e quali parametri possono incidere su di essa. In questo lavoro descriviamo il protocollo per studiare come il fattore di allungamento essenziale Nusa regola la pausa di trascrizione, così come un metodo per identificare un agente antibatterico mira trascrizione iniziazione attraverso l&#39;inibizione della formazione di oloenzima RNAP. Questi metodi possono essere utilizzati come una piattaforma per lo sviluppo di approcci aggiuntivi per esplorare il meccanismo di azione dei fattori di trascrizione che rimangono ancora chiaro, così come nuovi agen antibattericots mira trascrizione che è un obiettivo sottoutilizzato della droga in ricerca e sviluppo di antibiotici.

efficienza della trascrizione può essere determinata misurando il livello di radiazione nelle bande in diversi momenti. Il saggio pausa per testare la funzione di fattore di Nusa visualizzazione della pausa, terminazione attivata, e prodotti (Figura 1A) run-off. Alla presenza del dominio N-terminale di Nusa (Nusa NTD; residui di aminoacidi 1-137), l&#39;aspetto dei prodotti di RNA è stato significativamente ritardato rispetto al esperimento di controllo manca NUSA. Sop...

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K Views.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Ricerca

Biochimica

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

Identificazione dei regolatori dei fattori di trascrizione mediante lo screening a media velocità di lettura di librerie in serie e un reporter basato su Dual-Luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Ricerca sul cancro

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Una piattaforma di screening Luciferase basata multiplex per interrogare il cancro-associata trasduzione del segnale in cellule in coltura

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medicina

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Immunologia e infezioni

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA polymerase, e.g. T7. Due to the high cost of IVT reagents,&#160; IVT is a critical step in the mRNA drug substance production process and has been the focus of intense optimization in the field. To decrease the cost of mRNA production, reagents must be utilized optimally. Effective optimization necessitates a comprehensive understanding of the impact of individual reagents on reaction kinetics, i.e., the consumption of nucleoside triphosphates (NTPs) and the production of mRNA. Traditionally, low-throughput, end-point analytical techniques have been used for the analysis of mRNA. Though such methods give valuable information on mRNA content, at-line, near real-time analytics is needed to fully understand IVT reaction. We demonstrate how a liquid chromatography analytical method that separates NTPs, as well as pDNA and mRNA, can be used in near real-time to study IVT reaction kinetics. With the knowledge of the influence of different IVT components on kinetics and yield, rapid chromatographic analysis can be used to convert batch IVT reaction into a fed-batch mode that further increases productivity and reduces the overall cost of the reaction.

Optimizing in vitro transcription (IVT) is critical for cost-effective mRNA production. This protocol details an analytical chromatographic method for at-line analysis of IVT reaction, monitoring NTP depletion and mRNA production in batch or fed-batch modes, applicable to various RNA modalities, enhancing productivity and reducing costs.

Ottimizzazione della reazione di trascrizione in vitro per la produzione di mRNA mediante monitoraggio cromatografico in linea

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioingegneria

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell&#39;espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Biologia

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

Riepilogo

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