This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

注意：実験は、放射性同位元素32 Pの使用を含む、すべての適切な安全条件が満たされるまで何も作業が行われるべきではありません。一般職員は、安全コースに参加し、前に放射性試薬を用いた実験に教師の練習を受けることが必要です。反応を行う際に個人用保護機器着用してください（熱ルミネッセンス線量計、安全眼鏡、手袋、放射線室の白衣、完全長ズボンを、靴、つま先を閉じました）。 アッセイ材料の作製<ol><li>転写アッセイに必要なタンパク質を取得します。 <ol><li>ここで説明する実験では、Eを過剰生産と精製11を説明し、または商業的供給源（物質一覧）から得るように研究室で大腸菌 RNAP。 注：両方とも、同様の結果を提供します。天然または親和性標識RNAPの精製の ​​ための他の方法も12,13を使用することができます。シグマ/ヌサ因子をdとして得ることができます前作14,15に傍接しました。 </li></ol></li><li>ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水の調製 注：また、RNaseフリー水は、商業的供給源（材料リスト）から得ることができます。 <ol><li>精製水1Lに1 mlのジエチルピロカーボネート（DEPC）を追加（0.1％v / v）で、一晩混合します。 </li><li>二回オートクレーブDEPC水とヒント。 </li></ol></li><li> DNAテンプレートの調製<ol><li>製造業者の説明書に従って、プラスミド精製キット（材料リスト）を使用してプラスミドpSG1154 16および/ ​​またはpIA226 17を精製します 。 </li><li>ランオフ転写アッセイのためのテンプレートを増幅するために（P XYLプロモーター領域を含む360 bpの断片）は、25μlの2×PCR混合物（物質一覧）、など、氷上でPCR反応を組み立てる2μlの各プライマー（5μM） ：5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;（フォワード）及び5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39;（リバース）、1μlのpSG1154プラスミドPReparation（250μM）および20μlの精製水）。 <ol><li>または代替的に、単一ラウンドの転写アッセイのために、pIA226 17からλのP Rプロモーター領域を含む447塩基対の断片を増幅します。 25μlの2×PCR混合物を用いて、氷上でPCR反応を設定し、2μlのプライマー（5μM）の各：5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;（フォワード）および5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39;（リバース）、1μlのpIA226 17プラスミド調製物（250μM）および20μlの精製水）。 注意：このテンプレートは、転写開始部位から26 番目のヌクレオチドである26のntの位置までシトシンを欠いています。したがって、転写開始、プロモータークリアランスが可能になります。このテンプレートを使用していて、唯一のATP、UTP及びGTPが反応中に存在しているときに安定した転写伸長複合体（EC）を形成するためのnt 26で失速。 </li></ol></li><li>以下の条件でPCR反応を設定します。95°; 30秒間、50℃30秒、72℃30秒間、30サイクル繰り返します。 </li><li>メーカーの指示に従ってPCRクリーンアップキット（物質一覧）を使用して生成物を精製し、転写アッセイのために100μlの転写バッファーで溶出します。 </li><li>蛍光分光器（物質一覧）を使用して、鋳型DNA濃度を決定します。 </li></ol></li><li> NTPの準備 注：NTPを、異なる商業的供給源（物質一覧）から入手することができます。 <ol><li> -20℃で1.5 mlチューブ（各チューブ内を50μl）とストアに1 Mストック、アリコート溶液1mlを作るためにDEPC処理水で（≥99％純粋）のNTPを溶解させます。 </li><li>実験前に32 P UTP（3000 CI /ミリモル）α-注文。32 Pは14.29日の短い半減期を有します。 注意：アルファ標識UTPを使用して、異なる長さのバンドの強度を比較する避けることができます。 </li></ol></li><li> RNAラダー準備<ol><li>フォローを組み立て0.5μgのRNAテンプレートミックス（物質一覧）、80mMのHEPES緩衝pH7.5の、12のMgCl 2、10mMのNaClを、10mMのDTT、2mMのATP / CTP / GTP、0.5 mMのUTP、2：室温でる反応T7 RNAP（物質一覧）、20μlのにDEPC処理水μlのμlのα-32 P UTP、0.5。 </li><li>反応は37℃で1時間進行させます。すぐに使用するか、-80℃で保存します。 </li></ol></li></ol> RNA配列決定ゲルの調製<ol><li>ジェルの準備<ol><li> 70％エタノール及び精製水で2回配列決定ゲル装置（物質一覧）からプレートをきれいにし、櫛と2つのスペーサでセルを組み立てます。 注：一方のプレートは、ステップ4.2でゲルの除去を容易にするために、シリ試薬（材料リスト）で被覆することができます。 </li><li> 27.5グラムのホウ酸; 1 Mエチレンジアミン四酢酸を10ml（23 mlの水及び5×トリス/ホウ酸塩/ EDTA（TBE）緩衝液（53グラムのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン16.4 ml中に33.6グラムの尿素を溶解マグネチックスターラーを用いてEDTA）、1Lの水のpH 7.4）。 </li><li> （19：1）40％アクリルアミド/ビスアクリルアミド溶液を16ミリリットル追加尿素溶液にをし、0.45μmのフィルターでろ過します。 </li><li> 514μlの10％を追加する（W / V）、濾過した溶液を51.4μlのN、N、N &#39;、N&#39; -Tetramethylethylenediamine（TEMED）、続いて水で新たに調製した過硫酸アンモニウム。 </li><li>静かに過度の通気を回避し、底部注入孔から水平に配置予め充填されたシーケンシングセルにすぐにかつ円滑に注入するためにゲル溶液を反転。注射の間に気泡を避けるように注意してください。 </li><li>ゲルが完全に転写アッセイに使用する前に設定されるまで1〜1.5時間を許可します。ゲルは、配列決定、細胞の上に水湿潤ティッシュで包んだ二、三日間室温で保存することができます。 </li></ol></li></ol> 3.転写反応<ol><li>転写伸長一時停止アッセイ<ol><li>転写伸長複合体の形成<ol><li> 1.5mlチューブにRNAPコア酵素（転写バッファー中で1μMストック）の1μLを加えます。 </li><li> RNAPへとRNAPホロ酵素を形成するために、10分間氷上でインキュベートし、精製されたシグマ70因子（転写バッファーで3μMストック70σ）の1μLを加えます。 </li><li> RNAPホロ酵素に転写バッファーで3μlの500 nMの精製された鋳型DNA（pIA226 PCR産物からλP Rプロモーター）を追加し、オープンな複合体を形成するために5分間37ºCでインキュベートします。 </li><li> DEPC処理400 mMのトリス-HCl、1.6 MのKCl、100mMのMgCl 2を、10mMのDTT、50％グリセロール、pHは7.9：10×転写緩衝液5μl（材料リストを使用して別の1.5mlチューブ中の反応成分の混合物を調製します水）、250μMの各GTPおよびUTP、1 mMのATPの1μlに2μlの、およびα-32 P UTP（3000 CI /ミリモル）の1μlの。 41μlにDEPC処理水を追加します。 いいえTE：RNase阻害剤（材料リスト）のRNaseの混入を最小化するために使用することができます。 </li><li>オープン複合体を含むチューブに混合液を移し、転写伸長複合体を形成するために15分間、37ºCでインキュベートNT 26で停止。 </li><li>室温（〜21℃）への反応を移動および50μg/ mlの最終濃度になるように2.5 mg / mlとリファンピシンの1μlを添加します。 </li><li> 0.1 mMと1μl加え、反応混合物にヌサを精製し、室温で5分間インキュベートします。 </li><li> 50μlの最終容量を作成し、タイマーを使用して、反応時間を測定するために、反応混合物中に250μMのCTPの2μLを加えます。 </li><li> 30、60、120、240、480、1200秒でRNAゲルローディング緩衝液（95％ホルムアミド、0.05％ブロモフェノールブルー、および0.05％キシレンシアノール）2μlの中に反応液の移送5μlの反応を停止します。 </li><li> 32 PのUTPのヒントやチューブは放射性廃棄物の続きで廃棄しますainer。 </li></ol></li></ol></li><li>転写開始アッセイ<ol><li>オープン複合体の形成<ol><li> 70〜0.5μMσ精製した希釈します。 </li><li>手順を繰り返し3.1.1.1 0.5μM（代わりに3μMの）70σ精製し、DNAテンプレート（pSG1154 PCR産物からP XYLプロモーター領域）を使用して3.1.1.3へ。 </li></ol></li><li>転写開始阻害アッセイ<ol><li>阻害剤はホロ酵素形成を破壊することが可能であるかどうかを調べるために、ステップ3.1.1.2と3.1.1.3が続く（ステップ3.1.1.1後）σ70を添加する前にRNAPコア酵素へのRNAPホロ酵素の形成を防止するために設計された阻害剤を、追加します。 </li><li>あるいは、ステップ3.1.1.2後、競合RNAPに結合σ70を阻害することができるかどうかを調べるために阻害剤を加えます。 </li><li>代わりに、阻害剤Sの、DMSO、阻害剤の同量の溶媒を使用し対照反応でトック。 </li></ol></li><li>反応の完了<ol><li> -20℃で1 mg / mlとし、株式のストック濃度に水でヘパリンを溶解させます。 注：ヘパリンが開いて複合体を形成していないRNAPを隔離することができるDNAの競争相手です。開いた複合体が形成されると、ヘパリンはRNAPのDNA結合部位を入力し、予め形成された開いた複合体からの転写を抑制することができません。したがって、ヘパリンは、単一ラウンドのアッセイのために必要とされます。それは、マルチラウンドアッセイに必要とされません。 </li><li> 5μlに10×転写バッファー（物質一覧）、1mg / mlのヘパリン溶液1μl、10mMの各ATP、GTP、およびCTP、2.5 mMのUTPを1μl、およびα-32の1μLを用いて反応混合物を準備しますP UTP（3,000 CI /ミリモル）。 45μlにDEPC処理水を追加します。 </li><li>転写オープン複雑な、パルススピンを有する反応混合物を混合し、37℃で20分間インキュベートします。 </li><li>そのように反応物10μlを移します反応をクエンチするRNAゲルローディング緩衝液（95％ホルムアミド、0.05％ブロモフェノールブルー、および0.05％キシレンシアノール）を5μlにリューション。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4. RNAゲルランニング開発<ol><li>変性ポリアクリルアミドゲルを実行します<ol><li>ゲルとバッファーの温度が50ºCで安定するまで約1.5時間、1×TBE緩衝液中で50ºCと50 Wでゲルを実行します。 </li><li> 30秒90ºCでの熱のサンプルとゲルにアイスロードする前にそれらを移動します。 </li><li> （1：100希釈）2μlのRNAラダーを含む1レーンと一緒に、ゲルの上部のウェルにロードしたサンプル。 </li><li>ブロモフェノールブルー色素がゲルダウン〜2月3日に達するまで、1×TBE緩衝液中で50 W、50ºCでゲルを実行します。 </li></ol></li><li>ジェルトリートメント<ol><li>ゆっくりと開き、慎重にシーケンシングセルから上部プレートを分離します。ゲルを破壊を避けるために、十分に注意してください。 </li><li>カットchromatograpブロモフェノールブルー色素上からゲルのサイズに合わせてHY紙（材料リスト）。放射性標識されたRNA転写物のおおよその位置を確認するためにガイガーカウンターを使用してください。 </li><li>ゲルは濾紙に付着するまで慎重にしっかりとろ紙を用いてゲル、およびプレスをカバーしています。カットオフ取り込まれなかったNTPが非常に熱くなっていることがゲルの底に実行すると放射性廃棄物にゲルの底を捨てます。 </li><li>真空乾燥機の乾燥床にろ紙の同様のサイズのピースを置き、慎重にゲル面を上にしてその上にゲルコート紙を置きます。 </li><li> 1.5時間60℃でラップし、乾燥してゲルをカバーしています。 </li><li>一晩の反応効率に依存するために、1時間ごとに異なる​​ことができ、ラップでゲルコーティングされたろ紙の反対側をラップし、適切な露光時間で、イメージングの場合に輝尽性蛍光体プレート上に置きます。 </li><li>使用した蛍光体プレートの画像製造元の指示に従ってイメージスキャナ。ソフトウェアのマニュアルに従ってImageJソフトウェアを使用して、相対的なバンド強度を決定します。 </li><li> 、作業領域内の放射能汚染を確認した組織と洗浄剤と疑われるアイテムやエリアを拭いて廃棄容器に組織を配置するガイガーカウンターを使用してください。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

全ての生物において、転写は厳密に制御プロセスである。 インビトロ転写アッセイ転写因子、小分子および転写阻害剤の効果を試験するためのプラットフォームを提供するために開発されてきました。この方法の論文では、一般的な細菌の転写のためのアッセイを説明しました。彼らはタイムラインに沿ってすべての転写産物の可視化を可能として転写産物の配列決定ゲル電気泳動と...

転写は、RNAは、特定のDNA鋳型から合成する処理です。真核細胞では三つの異なるRNAPsありますRNAP私はrRNAの前駆体を転写は、RNAP IIは、mRNAおよび特定小核RNAの合成のために責任がある、と5SのrRNAとtRNAの合成は、RNAP IIIによって行われます。細菌では、RNAのすべてのクラスの転写を担当する唯一のRNAPがあります。開始、伸長および終結：転写の3つの段階があります。転写は、細胞の中で最も高度に調節プロセスの一つです。 転写サイクルの各ステージは、遺伝子発現1の調節のためのチェックポイントを表します。開始のため、RNAPはオープンプロモーター複合体を形成するために、プロモーター2と呼ばれる特定の部位に酵素を誘導するように要求される、ホロ酵素を形成するためにシグマ因子に関連付けるました。続いて、転写因子の大きなスイートは、規制Oを担当しています伸びと終了フェーズ時にf RNAP活動。ここで調べた転写因子は、ヌサ高度に保存された必須タンパク質です。これは、rRNAの合成3-5の間に転写停止および終了、ならびに抗終結の調節に関与しています。 インビトロ転写アッセイでは転写6時の複雑な規制の手順を研究するための強力なツールとして開発されてきました。一般的に、プロモーター領域を含むDNAの線状断片は、転写のテンプレートとして必要とされます。 DNAテンプレートは、通常、PCRによって、またはプラスミドを線形化することによって生成されます。 （検出目的のための1つの放射性標識NTPを含む）、精製されたタンパク質とのNTPを添加すると、生成物は、インキュベーションの必要な期間の後に分析しました。適切なテンプレートおよび反応条件を使用して、転写のすべての段階はtranscrの詳細な分子特性解析を可能にしたこのアプローチを用いて検討されています最後の半世紀7オーバーiption。 RNAPの3次元構造に関する情報と組み合わせて、また、抗生物質および抗生物質のリードによる転写抑制の分子機構を精査し、新しい、改善された薬物8-10の開発にこの情報を使用することが可能でした。 本研究で、我々は、転写アッセイ転写伸長/終結因子ヌサによる調節のメカニズムを決定するために使用できる方法の例を提供する方法、および新規な転写開始阻害、リードの作用機序を決定することができます。

<table><tbody><tr><td>Obtain the proteins required for transcription assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of DEPC-treated water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>High Purity rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactive compound</td></tr><tr><td>RNA ladder preparation&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcription Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM Chr Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive decontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

インビトロ転写アッセイが開発され、広く転写に関与する分子メカニズムを研究するために長年使用します。このプロセスは、マルチサブユニットのDNA依存性RNAポリメラーゼ（RNAP）遺伝子発現時RNAPの活性を調節するように作用する転写因子のシリーズを必要とします。放射性標識された転写物の配列決定ゲル電気泳動は、それに影響を与えることができる方法の転写が進行するとどのようなパラメータの詳細な機構的情報を提供するために使用されます。本稿では、本質的な伸長因子ヌサは、転写一時停止、ならびにRNAPホロ酵素形成の阻害を介して転写開始をターゲットに抗菌剤を同定する方法を調整する方法を研究するためのプロトコルについて説明します。これらの方法は、まだ不明である転写因子の作用機序を調査するための追加の方法、ならびに新規な抗菌アーガンを開発するためのプラットフォームとして使用することができますtsが、抗生物質の研究開発における遊休薬物標的である転写をターゲットに。

転写効率は、異なる時点でバンドの放射線のレベルを測定することによって決定することができます。ヌサ係数有効ポーズの可視化、終了、および実行オフ製品（ 図1A）の機能をテストするために一時停止アッセイ。 （ヌサNTD、アミノ酸残基1-137）ヌサのN末端ドメインの存在下では、RNA生成物の外観は著しくヌサを欠く対照実験と比較して遅れていまし?...

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K ビュー.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

生化学

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

がん研究

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

医学

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

免疫・感染学

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

の実装<em&gt;インビトロ</em&gt;薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA polymerase, e.g. T7. Due to the high cost of IVT reagents,&#160; IVT is a critical step in the mRNA drug substance production process and has been the focus of intense optimization in the field. To decrease the cost of mRNA production, reagents must be utilized optimally. Effective optimization necessitates a comprehensive understanding of the impact of individual reagents on reaction kinetics, i.e., the consumption of nucleoside triphosphates (NTPs) and the production of mRNA. Traditionally, low-throughput, end-point analytical techniques have been used for the analysis of mRNA. Though such methods give valuable information on mRNA content, at-line, near real-time analytics is needed to fully understand IVT reaction. We demonstrate how a liquid chromatography analytical method that separates NTPs, as well as pDNA and mRNA, can be used in near real-time to study IVT reaction kinetics. With the knowledge of the influence of different IVT components on kinetics and yield, rapid chromatographic analysis can be used to convert batch IVT reaction into a fed-batch mode that further increases productivity and reduces the overall cost of the reaction.

Optimizing in vitro transcription (IVT) is critical for cost-effective mRNA production. This protocol details an analytical chromatographic method for at-line analysis of IVT reaction, monitoring NTP depletion and mRNA production in batch or fed-batch modes, applicable to various RNA modalities, enhancing productivity and reducing costs.

クロマトグラフィーアットラインモニタリングを用いたmRNA産生のための in vitro 転写反応の最適化

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

生物工学

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

生物学

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

要約

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TRNA イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

の実装

クロマトグラフィーアットラインモニタリングを用いたmRNA産生のための in vitro 転写反応の最適化

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

イン・ビトロ標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

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HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

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イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

TRNA イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

イン・ビトロ標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択