This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Precaución: Los experimentos implican el uso del isótopo radiactivo 32P y no debe iniciarse el trabajo hasta que se cumplan todas las condiciones de seguridad adecuadas. Generalmente se requiere personal para asistir a un curso de seguridad y se someten a la práctica supervisada antes de los experimentos utilizando reactivos radiactivos. Por favor, llevar equipo de protección personal (dosímetro de termoluminiscencia, gafas de seguridad, guantes, batas de laboratorio de las habitaciones de radiación, pantalones largos, zapatos cerrados-dedo del pie), al realizar la reacción. 1. Preparación de Materiales de ensayo <ol><li> Obtener las proteínas requeridas para el ensayo de transcripción. <ol><li> Para el experimento se describe aquí, la sobreproducción y purificar E. coli RNAP en el laboratorio como se describe 11, u obtener de una fuente comercial (Lista de Materiales). Nota: Ambos proporcionan resultados similares. Otros métodos para la purificación de RNAP nativo o de afinidad marcada también se pueden utilizar 12,13. / factores NusA Sigma se pueden obtener como described en trabajos anteriores 14,15. </li></ol></li><li> Agua Preparación de pirocarbonato de dietilo (DEPC) tratados Nota: Como alternativa, RNasa libre de agua se puede obtener a partir de fuentes comerciales (Lista de Materiales). <ol><li> Añadir 1 ml de dietil pirocarbonato (DEPC) a 1 L de agua purificada (0,1% v / v) y se mezcla durante la noche. </li><li> agua DEPC autoclave y consejos dos veces. </li></ol></li><li> Patrón de ADN Preparación <ol><li> Se purifica el plásmido pSG1154 16 y / o 17 pIA226 usando un kit de purificación de plásmido (Lista de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Para amplificar la plantilla para los ensayos de transcripción run-off (un fragmento de 360 pb que abarca la región promotora Xil P), montar una reacción de PCR en hielo incluyendo 25 l mezcla 2x PCR (Lista de Materiales), 2 l cada uno de los cebadores (5 M) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(hacia delante) y 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (hacia atrás), 1 l plásmido pSG1154 preparation (250 M) y 20 l de agua purificada). <ol><li> O, alternativamente, para los ensayos de transcripción individuales redondos, amplificar un fragmento de 447 pb que abarca la región del promotor λ P R de pIA226 17. Configurar una reacción de PCR en hielo usando 25 l de mezcla de PCR 2x, 2 l cada uno de los cebadores (5 M): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(hacia delante) y 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (hacia atrás), pIA226 1 l 17 preparación de plásmido (250 M) y 20 l de agua purificada). Nota: Esta plantilla carece de citosina hasta la posición 26 nt, que es el 26 de nucleótidos desde el sitio de inicio de la transcripción. Por lo tanto, la transcripción usando esta plantilla permitirá la iniciación, el despacho de promotor y estancamiento en el 26 nt para formar un complejo estable elongación de la transcripción (CE) cuando solamente ATP, UTP y GTP están presentes en la reacción. </li></ol></li><li> Configurar una reacción de PCR con las siguientes condiciones: 95 °; C durante 30 s, 50 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 segundos, y se repite durante 30 ciclos. </li><li> Se purifica el producto usando un kit de PCR de limpieza (Lista de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluye en 100 l de tampón de transcripción para el ensayo de transcripción. </li><li> Determinar la concentración de ADN molde utilizando un fluorospectrometer (Lista de Materiales). </li></ol></li><li> Preparación NTP Nota: NTP se pueden obtener de diferentes fuentes comerciales (Lista de Materiales). <ol><li> Disolver los PNT (≥99% de pureza) en agua tratada con DEPC para hacer reserva 1 M, alícuota de 1 ml de la solución en tubos de 1,5 ml (50 l en cada tubo) y se almacena a -20 ° C. </li><li> Orden α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) antes del experimento. 32 P tiene una corta vida media de 14,29 días. Nota: El uso de UTP marcado con alfa evita la comparación de la intensidad de las bandas con diferente longitud. </li></ol></li><li> Preparación de ARN de escalera <ol><li> Montar el seguimientoreacción ing a temperatura ambiente: 0,5 g de ARN de plantilla Mix (Lista de Materiales), 80 mM HEPES pH 7,5 tampón, 12 mM MgCl 2, NaCl 10 mM, DTT 10 mM, 2 mM ATP / CTP / GTP, UTP 0,5 mM, 2 l-32P UTP, 0,5 l de T7 RNAP (Lista de Materiales), el agua tratada con DEPC a 20 l. </li><li> Permitir reacción a 37 ° C durante 1 hr. Utilizar inmediatamente o almacenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de RNA Gel de secuenciación <ol><li> Preparación del gel <ol><li> Limpiar las placas de un aparato de gel de secuenciación (Lista de Materiales) dos veces con 70% de etanol y agua purificada, y montar la célula con un peine y dos espaciadores. Nota: Una placa se puede recubrir con el reactivo siliconado (Lista de Materiales) para facilitar la extracción de gel en el paso 4.2. </li><li> Disolver 33,6 g de urea en 22 ml de agua y 16,4 ml de / EDTA (TBE) borato (54 g de tris (hidroximetil) aminometano / 5x Tris; 27,5 g de ácido bórico; 10 ml de ácido etilendiaminotetraacético 1 M (EDTA), pH 7,4 en 1 L de agua) utilizando un agitador magnético. </li><li> Añadir 16 ml de bis-acrilamida solución al 40% de acrilamida / (19: 1) a la solución de urea y filtrar a través de un filtro de 0,45 micras. </li><li> Añadir 514 l 10% (w / v) de persulfato amónico recién preparada en agua, seguido de 51,4 ​​l N, N, N &#39;, N&#39; tetrametiletilendiamina (TEMED) a la solución filtrada. </li><li> Invertir suavemente la solución de gel para evitar la aireación excesiva e inyectar inmediatamente y sin problemas en la célula secuenciación preenvasados ​​horizontalmente desde la parte inferior del agujero de inyección. Tenga cuidado de no hacer burbujas durante la inyección. </li><li> Permitir 1-1,5 horas hasta que el gel está completamente ajustado antes de su uso en un ensayo de transcripción. El gel se puede almacenar a temperatura ambiente durante dos o tres días cuando se envuelve con el tejido húmedo de agua en la parte superior de la célula de la secuenciación. </li></ol></li></ol> Reacción 3. Transcripción <ol><li> Transcripción Alargamiento Ensayo Pausa <ol><li> La formación de un complejo de elongación de la transcripción <ol><li> Añadir 1 l de enzima núcleo RNAP (1 M de valores de tampón de transcripción) a un tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir 1 l de purificado sigma-70 de los factores (σ 70; 3 mM de stock en tampón de transcripción) para la RNAP e incubar en hielo durante 10 min para formar la holoenzima RNAP. </li><li> Añadir 3 l 500 nM de ADN plantilla purificado (λ P R promotor a partir del producto pIA226 PCR) en tampón de transcripción a la holoenzima RNAP y se incuba a 37 ºC durante 5 minutos para formar el complejo abierto. </li><li> Preparar una mezcla de componentes de la reacción en otro tubo de 1.5 ml con 5 l de 10x tampón de transcripción (Lista de Materiales: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM de MgCl 2 mM, DTT 10, 50% de glicerol, pH 7,9 en DEPC tratado agua), 2 l de 250 mM cada uno de GTP y UTP, 1 l de ATP 1 mM, y 1 l de α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Añadir agua tratada con DEPC a 41 l. Note: inhibidor de RNasa (Lista de Materiales) se puede utilizar para reducir al mínimo la contaminación de ARNasa. </li><li> Transferir la solución de la mezcla al tubo que contiene el complejo abierto y se incuba a 37 ºC durante 15 minutos para formar el complejo de elongación de la transcripción se detuvo en 26 nt. </li><li> Mover la reacción a temperatura ambiente (~ 21 ° C) y se añade 1 l de 2,5 mg / ml de rifampicina a una concentración final de 50 mg / ml. </li><li> Añadir 1 l de 0,1 mM purificados NusA a la mezcla de reacción y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 2 l de 250 mM CTP en la mezcla de reacción para hacer un volumen final de 50 l y medir el tiempo de reacción usando un temporizador. </li><li> Transferencia de 5 l de la solución de reacción en 2 l de tampón de ARN gel de carga (95% de formamida, 0,05% de azul de bromofenol y 0,05% xileno cianol) en 30, 60, 120, 240, 480, y 1200 seg para apagar la reacción. </li><li> Desechar las puntas 32P UTP y tubos en un cont residuos radiactivosainer. </li></ol></li></ol></li><li> Ensayo de transcripción iniciación <ol><li> La formación del complejo abierto <ol><li> Diluir purificada σ 70-0,5 M. </li><li> Repita los pasos 3.1.1.1 a 3.1.1.3 usando 0,5 M (en lugar de 3 M) purificada σ 70, y la plantilla de ADN (la región del promotor P Xil del producto pSG1154 PCR). </li></ol></li><li> La inhibición de ensayo de iniciación de la transcripción <ol><li> Añadir el inhibidor diseñado para evitar la formación de holoenzima RNAP a enzima núcleo RNAP antes de la adición de σ 70 (después de la etapa 3.1.1.1), seguido por pasos 3.1.1.2 y 3.1.1.3 examinar si el inhibidor es capaz de interrumpir la formación de la holoenzima. </li><li> Alternativamente, después del paso 3.1.1.2, añadir el inhibidor de examinar si es capaz de inhibir competitivamente la unión a σ 70 RNAP. </li><li> Usar la misma cantidad de DMSO, el disolvente del inhibidor, en lugar del inhibidor de la stac en las reacciones de control. </li></ol></li><li> La finalización de la reacción <ol><li> Disolver la heparina en agua a una concentración madre de 1 mg / ml y el inventario en -20 ° C. Nota: La heparina es un competidor de ADN que puede secuestrar RNAP que no ha formado un complejo abierto. Una vez se forma el complejo abierto, la heparina no puede entrar en el sitio de unión a ADN de RNAP e inhibir la transcripción a partir de complejo abierto pre-formado. Por lo tanto, la heparina sólo es necesario para los ensayos de una sola ronda de; no es necesario para los ensayos multi-redondas. </li><li> Preparar la mezcla de reacción usando 5 l de 10x tampón de transcripción (Lista de Materiales), 1 l de 1 mg solución de heparina / ml, 1 l de 10 mM de cada uno de ATP, GTP, CTP y, UTP 2,5 mM, y 1 l de α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Añadir agua tratada con DEPC a 45 l. </li><li> Mezclar la mezcla de reacción con el complejo abierto transcripción, dar un pulso y se incuba a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Transferir 10 l de la reacción por lolución en 5 l de tampón de ARN gel de carga (95% de formamida, 0,05% de azul de bromofenol y 0,05% xileno cianol) para inactivar la reacción. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Ejecución y Desarrollo de ARN del gel <ol><li> La ejecución de la operación de desnaturalización en gel de poliacrilamida <ol><li> Correr el gel a 50 ºC y 50 W en tampón 1x TBE durante aproximadamente 1,5 h hasta que la temperatura del gel y el tampón es estable a 50 ºC. </li><li> muestras de calor a 90 ° C durante 30 segundos y moverlos sobre hielo de carga previa en el gel. </li><li> Cargar las muestras en los pocillos en la parte superior del gel junto con un carril que contiene 2 l de escalera de ARN (dilución 1: 100). </li><li> Correr el gel a 50 W y 50 ° C en tampón TBE 1x hasta que el colorante azul de bromofenol alcanza ~ 2/3 por el gel. </li></ol></li><li> Tratamiento Gel <ol><li> Abrir separar lentamente y con cuidado la placa superior de la celda de secuenciación. Tener mucho cuidado para evitar romper el gel. </li><li> chromatograp cortepapel HY (Lista de Materiales) para que coincida con el tamaño del gel a partir de la parte superior para el colorante azul de bromofenol. Utilice un contador Geiger para confirmar la posición aproximada de los transcritos de ARN marcados radiactivamente. </li><li> cubrir con cuidado el gel con el papel de filtro, y presione firmemente hasta que el gel se adhiere al papel de filtro. Corte y deseche la parte inferior del gel a los residuos radiactivos como los PNT no incorporadas correr a la parte inferior del gel, que puede ser muy caliente. </li><li> Colocar un trozo de tamaño similar de papel de filtro en el lecho de secado de una máquina de secado al vacío, y coloque cuidadosamente el papel recubiertas de gel sobre ella con la cara hacia arriba en gel. </li><li> Cubrir el gel con una envoltura de plástico y seco a 60 ° C durante 1,5 horas. </li><li> Envolver el otro lado del papel de filtro recubierto de gel con una envoltura de plástico y colocar en una placa de fósforo fotoestimulable en el caso de imágenes, con el tiempo de exposición adecuado, que puede variar entre 1 hr y dependiendo noche a la mañana en la eficacia de la reacción. </li><li> La imagen de la placa de fósforo usandoun escáner de imágenes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar la intensidad de la banda relativa utilizando el software ImageJ de acuerdo con el manual del software. </li><li> Utilizar un contador Geiger para comprobar la contaminación radiactiva en el área de trabajo, limpie los elementos sospechosos y el área con el tejido y un agente de limpieza y disponer el tejido en el contenedor de residuos. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

En todos los organismos, la transcripción es un proceso estrechamente regulado. Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado para proporcionar una plataforma para probar los efectos de los factores de transcripción, moléculas pequeñas e inhibidores de transcripción. En este trabajo el método, se describe un ensayo para la transcripción bacteriana general. los ensayos de transcripción en combinación con electroforesis en gel de secuenciación de transcritos son muy importantes par...

La transcripción es el proceso en el que el ARN se sintetiza a partir de un molde de ADN específico. En las células eucariotas hay tres RNAPs distintas: RNAP I transcribe precursores rRNA, RNAP II es responsable de la síntesis de mRNA y ciertos pequeños ARN nucleares, y la síntesis de 5S rRNA y tRNA se realiza por RNAP III. En las bacterias, sólo hay un RNAP responsable de la transcripción de todas las clases de ARN. Hay tres etapas de la transcripción: iniciación, elongación y terminación. La transcripción es uno de los procesos más altamente regulados en la célula. Cada etapa del ciclo de la transcripción representa un punto de control para la regulación de la expresión génica 1. Para la iniciación, RNAP tiene que asociar con un factor sigma para formar la holoenzima, que se requiere para dirigir la enzima a sitios específicos llamados promotores 2 para formar un complejo promotor abierta. Posteriormente, un gran conjunto de factores de transcripción son responsables de la regulación of RNAP actividades durante las fases de elongación y terminación. El factor de transcripción se examinan aquí es la proteína altamente conservada y esencial, Nusa. Está implicado en la regulación de pausa de la transcripción y de terminación, así como anti-terminación durante la síntesis de rRNA 3-5. Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado como herramientas poderosas para estudiar las medidas reguladoras complejas durante la transcripción 6. En general, se requiere un fragmento lineal de ADN que incluye una región promotora como la plantilla para la transcripción. La plantilla de ADN es usualmente generado por PCR o linealizando un plásmido. A continuación se añaden proteínas y los PNT (incluyendo una NTP radiomarcado con fines de detección) purificadas y productos analizados tras el período requerido de incubación. El uso de plantillas adecuadas y condiciones de reacción, todas las etapas de la transcripción se han examinado el uso de este enfoque que ha permitido la caracterización molecular detallada de transcription durante el último medio siglo 7. En combinación con la información sobre la estructura 3-dimensional de RNAP también ha sido posible investigar el mecanismo molecular de la inhibición de la transcripción por los antibióticos y los cables de antibióticos, y utilizar esta información en el desarrollo de nuevos medicamentos, la mejora de 8-10. En este trabajo se proporcionan ejemplos de cómo los ensayos de transcripción se pueden utilizar para determinar el mecanismo de regulación por elongación de la transcripción / factor de terminación de NusA, y cómo el mecanismo de acción de una novela de plomo inhibidor de iniciación de la transcripción puede ser determinada.

<table><tbody><tr><td>Obtain the proteins required for transcription assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of DEPC-treated water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>High Purity rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactive compound</td></tr><tr><td>RNA ladder preparation&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcription Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM Chr Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive decontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

Los ensayos in vitro de transcripción se han desarrollado y utilizado ampliamente durante muchos años para estudiar los mecanismos moleculares implicados en la transcripción. Este proceso requiere de múltiples subunidades de ADN-polimerasa dependiente de ARN (RNAP) y una serie de factores de transcripción que actúan para modular la actividad de RNAP durante la expresión génica. electroforesis en gel de secuenciación de transcritos radiomarcados se utiliza para proporcionar información sobre el mecanismo de transcripción detallada sobre cómo avanza y los parámetros que pueden afectarlo. En este trabajo se describe el protocolo para estudiar cómo el factor de elongación esencial Nusa regula pausa transcripcional, así como un método para identificar un agente antibacteriano de orientación iniciación de la transcripción a través de la inhibición de la formación de RNAP holoenzima. Estos métodos se pueden utilizar como una plataforma para el desarrollo de enfoques adicionales para explorar el mecanismo de acción de los factores de transcripción que aún siguen sin estar claros, así como nueva agen antibacterianots la orientación de la transcripción que es una diana farmacológica infrautilizado en la investigación y el desarrollo de antibióticos.

eficacia de la transcripción puede determinarse midiendo el nivel de radiación en las bandas en diferentes puntos temporales. El ensayo haciendo una pausa para probar la función del factor de Nusa visualización de la pausa, la terminación activada, y la escorrentía productos (Figura 1A). En presencia del dominio N-terminal de NusA (NusA NTD; residuos de aminoácidos 1-137), la apariencia de los productos de ARN se retrasó significativamente en comparación con el ...

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K vistas.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Investigación

Bioquímica

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

Identificación de reguladores de factores de transcripción mediante la proyección de rendimiento medio de bibliotecas de matriz y un reportero basado en la doble luciferasa

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Investigación sobre el cáncer

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medicina

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Inmunología e Infección

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementación de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga Resistencia Ensayos: Maximizar el Potencial de Descubrimiento clínicamente relevantes mecanismos de resistencia

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA polymerase, e.g. T7. Due to the high cost of IVT reagents,&#160; IVT is a critical step in the mRNA drug substance production process and has been the focus of intense optimization in the field. To decrease the cost of mRNA production, reagents must be utilized optimally. Effective optimization necessitates a comprehensive understanding of the impact of individual reagents on reaction kinetics, i.e., the consumption of nucleoside triphosphates (NTPs) and the production of mRNA. Traditionally, low-throughput, end-point analytical techniques have been used for the analysis of mRNA. Though such methods give valuable information on mRNA content, at-line, near real-time analytics is needed to fully understand IVT reaction. We demonstrate how a liquid chromatography analytical method that separates NTPs, as well as pDNA and mRNA, can be used in near real-time to study IVT reaction kinetics. With the knowledge of the influence of different IVT components on kinetics and yield, rapid chromatographic analysis can be used to convert batch IVT reaction into a fed-batch mode that further increases productivity and reduces the overall cost of the reaction.

Optimizing in vitro transcription (IVT) is critical for cost-effective mRNA production. This protocol details an analytical chromatographic method for at-line analysis of IVT reaction, monitoring NTP depletion and mRNA production in batch or fed-batch modes, applicable to various RNA modalities, enhancing productivity and reducing costs.

Optimización de la reacción de transcripción in vitro para la producción de ARNm mediante la monitorización cromatográfica en línea

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioingeniería

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Biología

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...