This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Achtung: Die Experimente umfassen die Verwendung des radioaktiven Isotops 32 P und keine Arbeit sollte , bis alle entsprechenden Sicherheitsbedingungen erfüllt sind durchgeführt werden. Im Allgemeinen Personal sind verpflichtet, einen Sicherheitskurs zu besuchen und überwachten Praxis vor den Experimenten mit radioaktiven Reagenzien unterzogen werden. Bitte tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (Thermolumineszenzdosimeter, Schutzbrille, Handschuhe, Bestrahlungsraum Kitteln, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe), wenn die Reaktion durchgeführt wird. 1. Herstellung von Assay Materials <ol><li> Besorgen Sie sich die Proteine ​​Erforderlich für die Transcription-Test. <ol><li> Für die hier beschriebenen Experiment, überproduzieren und E. reinigen coli RNAP im Labor als 11 beschrieben, oder erhalten aus einer kommerziellen Quelle (Materialliste). Hinweis: Beide ähnliche Ergebnisse liefern. Andere Verfahren zur Reinigung von nativen oder Affinität markierten RNAP kann auch 12,13 verwendet werden. Sigma / NusA Faktoren können als d erhalten werdenescribed 14,15 in früheren Arbeiten. </li></ol></li><li> Herstellung von Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser Hinweis: Alternativ RNase-freies Wasser kann aus kommerziellen Quellen (Materialliste) erhalten werden. <ol><li> 1 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC) auf 1 l gereinigtem Wasser (0,1% v / v) und über Nacht mischen. </li><li> Autoklav DEPC Wasser und Tipps zweimal. </li></ol></li><li> DNA-Vorlage Vorbereitung <ol><li> Reinige Plasmid pSG1154 16 und / oder pIA226 17 ein Plasmid - Reinigungskits (Materialliste) unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Um die Vorlage für Run-off - Transkriptionsassays (ein 360 - bp - Fragment umfasst den P xyl - Promotor - Region) zu verstärken, bauen sie zusammen eine PCR - Reaktion auf Eis mit 25 ul 2x PCR - Mix (Materialliste), 2 ul jeweils der Primer (5 uM) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(vorwärts) und 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (rückwärts), 1 ul pSG1154 Plasmid preparation (250 &amp; mgr; M) und 20 &amp; mgr; l gereinigtes Wasser). <ol><li> Oder alternativ, für einzelne Runde Transkriptionsassays, verstärken , um eine 447 - bp - Fragment umfasst die λ P R - Promotorregion von pIA226 17. Richten Sie eine PCR-Reaktion auf Eis unter Verwendung von 25 &amp; mgr; l 2x PCR-Mix, 2 &amp; mgr; l von jedem der Primer (5 uM): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(vorwärts) und 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (rückwärts), 1 ul pIA226 17 Plasmidpräparation (250 &amp; mgr; M) und 20 &amp; mgr; l gereinigtes Wasser). Hinweis: Diese Vorlage Cytosin , bis die 26 nt - Position fehlt, die das 26. Nukleotid von der Transkriptionsstartstelle ist. Daher Transkription unter Verwendung dieser Vorlage Initiierung ermöglichen, Promoter-Clearance und Abwürgen am +26 nt eine stabile Transkriptionselongation-Komplex (EG) zu bilden, wenn nur ATP, UTP und GTP in der Reaktion vorhanden sind. </li></ol></li><li> Stellen Sie eine PCR-Reaktion mit den folgenden Bedingungen auf: 95 °; C für 30 sec, 50 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec, 30 Zyklen wiederholen. </li><li> Reinige das Produkt einer PCR Clean-up Kit (Materialliste) gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren in 100 &amp; mgr; l Transkriptionspuffer für den Transkriptionsassay. </li><li> Bestimmen Sie die Template-DNA-Konzentration unter Verwendung eines Fluorospektrometer (Materialliste). </li></ol></li><li> NTP Vorbereitung Hinweis: NTPs können aus verschiedenen kommerziellen Quellen (Materialliste) erhalten werden. <ol><li> Man löst NTPs (≥99% rein) in DEPC-behandeltem Wasser zum 1 M Lager, aliquoten 1 ml der Lösung in 1,5-ml-Röhrchen (50 &amp; mgr; l in jedes Röhrchen) und bei -20 ° C. </li><li> Um α- 32 P - UTP (3000 Ci / mmol) vor dem Experiment. 32 P hat eine kurze Halbwertszeit von 14,29 Tage. Hinweis: Die Verwendung alpha-markiertem UTP vermeidet die Intensität der Bänder mit unterschiedlicher Länge zu vergleichen. </li></ol></li><li> RNA Ladder Vorbereitung <ol><li> Bauen Sie die Folgeing Reaktion bei Raumtemperatur: 0,5 &amp; mgr; g RNA - Matrize Mix (Materialliste), 80 mM HEPES - Puffer pH 7,5, 12 mM MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 ul T7 RNAP (Materialliste), Wasser auf 20 &amp; mgr; l DEPC-behandelt. </li><li> Erlauben Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde fortschreiten. Verwenden Sie sofort oder lagern bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von RNA-Sequencing Gel <ol><li> Gelzubereitung <ol><li> Reinigen Sie die Platten aus einer Sequenzierungs Gelapparatur (Materialliste) zweimal mit 70% Ethanol und gereinigtem Wasser, und montieren Sie die Zelle mit einem Kamm und zwei Abstandshalter. Hinweis: Eine Platte kann mit Silizierverfahren Reagenz (Materialliste) beschichtet werden, um Gelentfernung in Schritt 4.2 erleichtern. </li><li> Man löst 33,6 g Harnstoff in 22 ml Wasser und 16,4 ml 5x Tris / Borat / EDTA (TBE) -Puffer (54 g Tris (hydroxymethyl) aminomethan, 27,5 g Borsäure, 10 ml 1 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7,4 in 1 l Wasser) mit einem Magnetrührer. </li><li> 16 ml von 40% Acrylamid / Bisacrylamid-Lösung (19: 1) zu der Harnstofflösung und filtriert durch ein 0,45 um-Filter. </li><li> Hinzufügen , 514 &amp; mgr; l 10% (w / v) frisch hergestelltem Ammoniumpersulfat in Wasser , gefolgt von 51,4 ​​ul N, N, N &#39;, N&#39; N&#39; - Tetramethylethylendiamin (TEMED) zu der filtrierten Lösung. </li><li> invertieren vorsichtig die Gel-Lösung zu einer übermäßigen Belüftung vermeiden und injizieren sofort und nahtlos in die horizontal positioniert abgepackten Sequenzierung Zelle aus dem unteren Einspritzloch. Achten Sie darauf, machen Blasen während der Injektion zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie 1-1,5 h, bis das Gel vollständig vor der Verwendung in einer Transkription Assay eingestellt ist. Das Gel kann für zwei oder drei Tage bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie mit wasserfeuchten Gewebe auf der Oberseite der Sequenzierungs Zelle gewickelt. </li></ol></li></ol> 3. Transkriptionsreaktion <ol><li> Transkriptionselongation Pausieren Assay <ol><li> Die Bildung eines Transkriptions Elongationskomplexes <ol><li> 1 ul RNAP Core-Enzym (1 uM Lager in Transkriptionspuffer) in ein 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> 1 &amp; mgr; l gereinigtem Sigma-70 - Faktor (σ 70; 3 &amp; mgr; M Lager in Transkriptionspuffer) an die RNAP und Inkubation auf Eis für 10 min RNAP Holoenzym zu bilden. </li><li> Werden 3 ul 500 nM gereinigtem Templat - DNA (λ P R Promotor aus dem pIA226 PCR - Produkt) in Transkriptionspuffer zum RNAP Holoenzym und Inkubieren bei 37 ºC für 5 min die offene Komplex zu bilden. </li><li> Bereiten einer Mischung von Reaktionskomponenten in einem anderen 1,5 ml - Röhrchen unter Verwendung von 5 ul 10fach Transkriptionspuffer (Materialliste: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 50% Glycerin, pH 7,9 in DEPC behandeltem Wasser), 2 ul 250 uM jedes GTP und UTP, 1 ul 1 mM ATP und 1 ul α- 32 P - UTP (3000 Ci / mmol). In DEPC behandeltem Wasser auf 41 &amp; mgr; l. Neinte: RNase-Inhibitor (Materialliste) kann verwendet werden, um die RNase Kontamination zu minimieren. </li><li> Übertragen Sie die Mischlösung in das Röhrchen des offenen Komplex enthält, und Inkubation bei 37 ° C für 15 min die Transkriptionselongation Komplex zu bilden nt bei +26 gestoppt. </li><li> Bewegen, um die Reaktion auf Raumtemperatur (~ 21 ° C) und füge 1 ul von 2,5 mg / ml Rifampicin zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml. </li><li> 1 ul 0,1 mM NusA dem Reaktionsgemisch gereinigt und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Hinzufügen 2 ul 250 uM CTP in das Reaktionsgemisch ein Endvolumen von 50 ul und zu messen, die Reaktionszeit mit Hilfe eines Timers zu machen. </li><li> Transfer 5 ul der Reaktionslösung in 2 ul Gelladepuffer RNA (95% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol) bei 30, 60, 120, 240, 480 und 1.200 sec die Reaktion zu quenchen. </li><li> Entsorgen Sie die 32 P - UTP - Tipps und Rohre in einem radioaktiven Abfällen Fortsetzungainer. </li></ol></li></ol></li><li> Der Transkriptionsinitiations Assay <ol><li> Die Bildung des Open-Komplex <ol><li> Verdünnter gereinigter σ 70-0,5 uM. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1.1 bis 3.1.1.3 unter Verwendung von 0,5 uM (anstelle von 3 uM) gereinigt σ 70 und die DNA - Matrize (die P xyl - Promotor - Region von pSG1154 PCR - Produkt). </li></ol></li><li> Hemmung der Transkriptionsinitiations Assay <ol><li> Fügen den Inhibitor entwickelt , um RNAP Holoenzym Bildung RNAP Kern Enzym vor der Zugabe von σ 70 (nach Schritt 3.1.1.1), gefolgt von den Schritten 3.1.1.2 und 3.1.1.3 verhindern , zu untersuchen , ob der Inhibitor der Lage ist , Holoenzym Bildung zu stören. </li><li> Alternativ kann nach Schritt 3.1.1.2, fügen Sie den Inhibitor zu prüfen , ob es in der Lage ist zu wettbewerbsfähigen σ 70 hemmen zu RNAP Bindung. </li><li> Verwenden, um die gleiche Menge an DMSO, das Lösungsmittel des Inhibitors, anstelle des Inhibitors stock in Kontrollreaktionen. </li></ol></li><li> Beendigung der Reaktion <ol><li> Man löst Heparin in Wasser zu einer Stammkonzentration von 1 mg / ml und Lager bei -20 ° C. Hinweis: Heparin ist ein Konkurrent von DNA, die RNAP absondern können, die keinen offenen Komplex gebildet hat. Sobald der offenen Komplex gebildet wird, Heparin kann die DNA-Bindungsstelle von RNAP nicht eingeben und hemmen die Transkription von vorgeformten offenen Komplex. Daher wird Heparin nur für Single-Runde Tests erforderlich; es ist nicht für Multi-Runde Assays benötigt. </li><li> Bereiten Sie die Reaktionsmischung unter Verwendung von 5 ul 10fach Transkriptionspuffer (Materialliste), 1 ul 1 mg / ml Heparinlösung, 1 ul 10 mM jeweils ATP, GTP und CTP, 2,5 mM UTP, und 1 ul 32 α- P UTP (3000 Ci / mmol). In DEPC behandeltem Wasser auf 45 &amp; mgr; l. </li><li> Mischen Sie das Reaktionsgemisch mit der Transkription offenen Komplex, Puls Spin und Inkubation bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Übertragung von 10 ul der Reaktions sosung in 5 ul Gelladepuffer RNA (95% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol), um die Reaktion zu quenchen. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. RNA-Gel-Lauf und Entwicklung <ol><li> Das Ausführen des denaturierendes Polyacrylamidgel <ol><li> Laufen um das Gel bei 50 ºC und 50 W in 1x TBE-Puffer für etwa 1,5 Stunden, bis die Temperatur des Gels und der Puffer bei 50 ºC stabil. </li><li> Wärme Proben bei 90 ° C für 30 Sekunden und sie auf Eis auf das Gel vor Belastung zu bewegen. </li><li> Laden Sie die Proben in die Vertiefungen auf der Oberseite des Gels neben einer Spur, die 2 &amp; mgr; l RNA-Leiter (1: 100 Verdünnung). </li><li> Führen Sie das Gel bei 50 W und 50 ºC in 1x TBE-Puffer, bis der Bromphenolblau-Farbstoff erreicht ~ 03.02 durch das Gel. </li></ol></li><li> Gel-Behandlung <ol><li> Öffnen Sie langsam und vorsichtig trennen die obere Platte aus der Sequenzierung Zelle. Achten Sie besonders darauf, das Gel zu brechen zu vermeiden. </li><li> Cut chromatography Papier (Materialliste) von oben nach Bromphenolblau Farbstoff die Gelgröße übereinstimmen. Verwenden Sie einen Geigerzähler die ungefähre Position von radioaktiv markierten RNA-Transkripte zu bestätigen. </li><li> Deckel vorsichtig das Gel mit dem Filterpapier, und drücken Sie sie fest, bis das Gel auf das Filterpapier haftet. Abgeschnitten und die Unterseite des Gels zu radioaktivem Abfall entsorgen, da die nicht eingebauten NTPs an der Unterseite des Gels laufen, die sehr heiß werden kann. </li><li> Legen Sie ein ähnlich großes Stück Filterpapier auf dem Trockenbett eines Vakuum-Trocknungsmaschine und sorgfältig legen Sie das Gel beschichteten Papier auf sie mit dem Gel Seite nach oben. </li><li> Decken Sie das Gel mit einer Plastikfolie und trocken bei 60 ° C für 1,5 Std. </li><li> Wickeln Sie die andere Seite des Gels beschichteten Filterpapier mit Plastikverpackung, und legen Sie auf einer photostimulierbaren Phosphorplatte im Abbildungs ​​Fall mit dem entsprechenden Belichtungszeit, die von 1 Stunde variieren kann über Nacht in Abhängigkeit von der Reaktionseffizienz. </li><li> Bild der Leuchtstoffplatte mitImager Abtaster nach den Anweisungen des Herstellers. Zur Ermittlung der relativen Bandenintensität mit ImageJ Software entsprechend dem Software-Handbuch. </li><li> Verwenden Sie einen Geigerzähler die radioaktive Kontamination im Arbeitsbereich zu überprüfen, reinigen Sie die vermuteten Elemente und Bereich mit Gewebe und Reinigungsmittel und entsorgen das Gewebe in dem Entsorgungsbehälter. </li></ol></li></ol>

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	<li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+by+RNA+polymerase:+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation.">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li><li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does.">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li><li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA:+the+basic+mechanisms.">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li><li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase.">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li><li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA.">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li><li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination.">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li><li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+regulation+at+the+core:+Similarities+among+bacterial,+archaeal,+and+eukaryotic+RNA+polymerases.">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li><li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase?.">Is it easy to stop RNA polymerase?.</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li><li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase.">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development.">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li><li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li><li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase.">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li><li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions.">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li><li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design:+From+in+silico+screening+to+validation.">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li><li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex.">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li><li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis.">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li><li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals.">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li><li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+&#197;+resolution.">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 &#197; resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li><li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp.">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li><li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes.">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li><li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation.">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In allen Organismen ist die Transkription eines stark regulierten Prozess. In vitro Transkriptionsassays eine Plattform zum Testen der Wirkung von Transkriptionsfaktoren, kleine Moleküle und Transkriptionsinhibitoren bereitzustellen , wurden entwickelt. Bei diesem Verfahren wird Papier, wurde ein Test für die allgemeine bakterielle Transkriptions beschrieben. Transkriptionsassays mit Sequenzierung Gelelektrophorese von Transkripten kombiniert sind sehr wichtig für mechanistische Studien, wie sie Visualisieru...

Transcription ist der Prozess, in dem RNA von einer spezifischen DNA-Matrize synthetisiert wird. In eukaryotischen Zellen gibt drei verschiedene RNAPs sind: RNAP I transkribiert rRNA Vorläufern ist RNAP II verantwortlich für die Synthese von mRNA und bestimmte kleine nukleare RNAs, und die Synthese von 5S-rRNA und tRNA wird durch RNAP III durchgeführt. In Bakterien, gibt es nur eine RNAP, die für die Transkription aller Klassen von RNA. Es gibt drei Stufen der Transkription: Initiation, Elongation und Termination. Transcription ist eine der am stärksten regulierten Vorgänge in der Zelle. Jede Stufe in der Transkriptionszyklus stellt einen Prüfpunkt für die Regulation der Genexpression 1. Zur Initiierung hat RNAP mit einem Sigma - Faktor zu assoziieren Holoenzym zu bilden, die das Enzym an spezifische Stellen Promotoren genannt 2 zu leiten erforderlich einen offenen Promotorkomplex zu bilden. Anschließend werden eine große Suite von Transkriptionsfaktoren, die für die Regulierung of RNAP Aktivitäten während der Verlängerung und Beendigung Phasen. Der Transkriptionsfaktor hier untersucht ist die hoch konserviert und essentielles Protein, NusA. Es wird bei der Regulierung der Transkription Pausieren und Beendigung, sowie Anti-Abbruch bei rRNA Synthese 3-5 beteiligt. In - vitro - Transkriptionsassays wurden als leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung der komplexen regulatorischen Schritte während der Transkription 6 entwickelt. Im allgemeinen wird ein lineares Fragment von DNA, die eine Promotorregion wird als Matrize für die Transkription erforderlich. Die DNA-Matrize wird gewöhnlich erzeugt durch PCR oder durch ein Plasmid linearisieren. Gereinigte Proteine ​​und NTPs (einschließlich eines radioaktiv markierten NTP für Detektionszwecke) werden dann zugegeben und Produkt nach der erforderlichen Inkubationszeit analysiert. Unter Verwendung geeigneter Vorlagen und Reaktionsbedingungen, alle Stufen der Transkription wurden mit diesem Ansatz untersucht, die detaillierte molekulare Charakterisierung von transcr ermöglicht hat,iption im letzten halben Jahrhundert 7. In Kombination mit Informationen über die 3-dimensionale Struktur von RNAP ist es auch möglich, den molekularen Mechanismus der Transkriptionshemmung durch Antibiotika und Antibiotika führt zu untersuchen, und diese Informationen in der Entwicklung neuer, verbesserter Arzneimittel 8-10. In dieser Arbeit stellen wir Beispiele für Transkriptionsassays verwendet werden können, um den Mechanismus der Regulierung von Transkription Expansions- / Terminationsfaktor NusA, und wie die Wirkungsweise eines neuartigen Transkriptionsinitiationsinhibitor führen zu bestimmen, bestimmt werden.

<table><tbody><tr><td>Obtain the proteins required for transcription assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of DEPC-treated water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>High Purity rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactive compound</td></tr><tr><td>RNA ladder preparation&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcription Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM Chr Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive decontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

In - vitro - Transkriptionstests wurden seit vielen Jahren zur Untersuchung der molekularen Mechanismen , die in Transkriptions entwickelt und weit verbreitet. Dieses Verfahren erfordert Multi-Untereinheiten-DNA-abhängige RNA-Polymerase (RNAP), und eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die die Aktivität von RNAP während Genexpression zu modulieren wirken. Sequencing-Gelelektrophorese von radiomarkiertem Transkripte wird verwendet, auf detaillierte mechanistische Informationen zu geben, wie die Transkription und welche Parameter können sie beeinflussen. In diesem Dokument beschreiben wir das Protokoll zu untersuchen, wie die wesentliche Elongationsfaktor NusA Transkriptions Pausieren regelt, sowie ein Verfahren, ein antibakterielles Mittel Targeting Transkriptionsinitiations durch Hemmung der RNAP Holoenzym Bildung zu identifizieren. Diese Verfahren können als eine Plattform für die Entwicklung von zusätzlichen Ansätze verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus der Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die noch unklar bleiben, sowie neue antibakterielle agents Targeting Transkription, die ein nicht ausgelastete Medikament Ziel in der Antibiotika-Forschung und Entwicklung ist.

Transkriptionseffizienz kann durch Messen der Strahlungspegel in den Frequenzbändern zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden. Die Pause - Test die Funktion NusA Faktor aktiviert Visualisierung der Pause, Abbruch zu testen und Run-off - Produkte (1A). In der Gegenwart des N-terminalen Domäne von NusA (NusA NTD; Aminosäurereste 1-137), Aussehen der RNA-Produkte war signifikant im Vergleich zu dem Kontrollversuch verzögert fehlt NusA. Deletion der Aminosäurereste ...

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

in-vitro-transcription-assays-and-their-application-in-drug-discovery

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K Aufrufe.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Serie: In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Forschung

Biochemie

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Krebsforschung

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medizin

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Immunologie und Infektion

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementierung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA polymerase, e.g. T7. Due to the high cost of IVT reagents,&#160; IVT is a critical step in the mRNA drug substance production process and has been the focus of intense optimization in the field. To decrease the cost of mRNA production, reagents must be utilized optimally. Effective optimization necessitates a comprehensive understanding of the impact of individual reagents on reaction kinetics, i.e., the consumption of nucleoside triphosphates (NTPs) and the production of mRNA. Traditionally, low-throughput, end-point analytical techniques have been used for the analysis of mRNA. Though such methods give valuable information on mRNA content, at-line, near real-time analytics is needed to fully understand IVT reaction. We demonstrate how a liquid chromatography analytical method that separates NTPs, as well as pDNA and mRNA, can be used in near real-time to study IVT reaction kinetics. With the knowledge of the influence of different IVT components on kinetics and yield, rapid chromatographic analysis can be used to convert batch IVT reaction into a fed-batch mode that further increases productivity and reduces the overall cost of the reaction.

Optimizing in vitro transcription (IVT) is critical for cost-effective mRNA production. This protocol details an analytical chromatographic method for at-line analysis of IVT reaction, monitoring NTP depletion and mRNA production in batch or fed-batch modes, applicable to various RNA modalities, enhancing productivity and reducing costs.

Optimierung der in vitro Transkriptionsreaktion für die mRNA-Produktion mittels chromatographischem At-Line-Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

In Vitro Transcribed RNA-basierter Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infizierten Zellen

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Biotechnik

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Biologie

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...