We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.

הצהרת אתיקה: לפני איסוף תאים בבני אדם, הודיעה הסכמה ואישור אתיקה יש לקבל. 1. כן Stain הערה: כן כתם ביום של ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl Ethidium (או 4 מיקרומטר) ו -5 μl Calcein AM (או 4 מיקרומטר) ל -2.5 מ&quot;ל בופר פוספט (PBS) ב 15 מ&quot;ל צינור צנטריפוגות; לְעַרְבֵּב. עוטפים בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ולאחסן ב RT עד לשימוש. </li></ol> 2. תאים אסופים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מוסיף תרבית תאים מהאריזה שלהם תווית עבור כל עפעף להיות שנדגמו. מארק הכיוון של אוסף תאים בצד של בעל פלסטיק קרום באמצעות סמן קבע. התנהגות ושספה בדיקה מנורה בהגדלה מתונה (כ 20X) כדי לאשר בריאות הולמת של האזור לעבור IC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר טיפה אחת של חומר הרדמה (hydrochloride 0.5% proparacaine) שק הלחמית התחתון של eaעין ch ולהורות משתתף לשמור בעיניים עצומות במשך דקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוורט עליון מכסה עין וחזקה במקום על ידי המלקות; להימנע מכל מגע עם אזור מגב מכסה. אופציונאלי: הסיוע של חוקר משני ייתכן שיידרש לבצע שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל קרום בניצב על החלק המרכזי של אזור מגב המכסה עם לחץ מינימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק קרום במקום במשך 3 - 5 שניות. שים את הממברנה להיות שקוף באזור המגע. בשלב זה, בעדינות להסיר את הקרום ולהתיר את המכסה של המשתתף כדי &quot;להעיף&quot; בחזרה למקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להחיל טיפה אחת של PBS המדגם, כדי למנוע ממנו להתייבש. ממברנה תהפוך שקופה ולא צריך להפוך אטום בכל עת, כמו זו מצביעה על ייבוש. יש החוקר משני להמשיך מיד עם עיבוד של דגימות (סעיף 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל בדיקת עיניים סופית כדי להבטיח שלמות של הלחמית. לוותר סיכה עינית ולהורות משתתפיםכדי למנוע שפשוף העיניים שלהם עד מאלחשים פגים (כ. 15 דק &#39;). </li></ol> עיבוד מדגם 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרו מספריים, לחתוך את הקרום בחצי (מחצית לכל אחד הניתוחים במורד הזרם), בניצב דרך באמצע אוסף תאים. חותכים לאורך השוליים החיצוניים של חצי קרום אחד להפריד אותו מבעל פלסטיק; למנוע אינטראקציה עם תאים שנאספו על הממברנה, ובכלל זה להבטיח כי הקרום אינו מתקפל על עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הממברנה באמצעות פינצטה לפני ניתוק מן בעל לחלוטין. קרום מקום לתוך צינור צנטריפוגות שכותרתו 2 מ&quot;ל המכיל 500 μl של 95% (V / V) אתנול ולהשאיר לתקן למשך תקופה מינימלית של 20 דקות לכל היותר 2 שעות לפני עיבוד (סעיף 4.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד נפרד במחצית השנייה של הממברנה (כמתואר בסעיף 3.2) ומיד להמשיך עם סעיף 4.1. </li></ol> 4. לדוגמא מכתימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunocytochemiקאל מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום קרום תרבות צלחת תחתית זכוכית 35 מ&quot;מ עם צד אוסף פונה כלפי מטה; קרום להבטיח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 μl של רכב כתם immunocytochemical התאסף בסעיף 1 על הממברנה. אם תלתלים מדגמים, משתמשים טיפי פיפטה חד פעמיים כדי לשטח את הקרום בקפידה על ידי לדחוף למטה הקצוות שלה. יש להימנע ממגע עם אזורי אוסף תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לכסות את הממברנה עם תלוש כיסוי זכוכית. הימנע תנועה של מדגם מיותרת. מכסים בצלחת עם מכסה לאטום עם סרט מעבדה מסביב לקצוות. אין לחסום את השקיפות של צלחת (עליון ותחתון) ו נראה של מדגם. לייבל בטוש במעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להמשיך עם הדמיה (סעיף 5.1), ואז לחזור סעיף 4.2 להמשיך עם מכתים ציטולוגיה של החצי השני של הממברנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציטולוגית מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגה מימה קרום ידי הוספת לאט 500 μl של מים מזוקקים אל הצינור used עבור קיבעון בסעיף 3.4. תוכן לשאוב כמה פעמים לתוך קצה פיפטה לערבב, ולאחר מכן להסיר תוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של מים מזוקקים. ולתת לעמוד במשך כמה שניות, ולאחר מכן להסיר. הוסף 500 μl של כתם Alcian כחול ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע 3 ברציפות 500 μl מים מזוקקים מי שטיפת או עד שהנוזלים בשטיפות ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של כתם Hematoxylin # 1 ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע שלושה רצופים 500 μl שטיפות מים מזוקקים או עד שהנוזלים בשטיפות ברור. מייבשים (הפוך סעיף 4.2.1) על ידי aspirating הנוזל השקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של Papanicolaou OG-6 הכתם ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע אחד 500 μl 95% (v / v) שטיפה אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של Papanicolaou EA-65 הכתם ולהשאיר למשך 3 דקות. הסר כתם ולבצע 3 ברציפות 500 μl 95% (V / V) אתנול שטיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי מייבשים באמצעות שלושה רצופים 500 μl 100% שטיפות אתנול. שימוש tweezers, להסיר מדגם מפתרון; להימנע מאזורי אוסף תא נוגעים ללב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קרום בשקופית זכוכית; אוסף להבטיח התא כי הקו הוא גם במקביל או בניצב להחליק שולי עבור יישור קל במהלך ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ירידה של אתנול 100% ומכסים להחליק זכוכית. מיד להמשיך עם הדמיה (סעיף 5.2). </li></ol></li></ol> הדמיה מדגם 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתמי הדמית פלורסנט Immunocytochemical <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM) 11 או הקרינה מיקרוסקופ 12, מצויד במצלמת צבע דיגיטלית, מחובר למחשב מפעיל תוכנת רכישת התמונה. בשל הדגימות להיות כלול בתוך תרבות מנות, מיקרוסקופ הפוכה עשויה להיות נחוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרוסקופ 11,12 פי ספקטרום בליעה ופליטה של 1 homodimer ethidium (528/617 מקסימום Ex / Em ננומטר בנוכחות דנ&quot;א) calcein AM (494/517 E ננומטרx / Em מקסימום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר של מיקרוסקופ (למשל, המטרה פי 2.5) ולהפעיל את מערכת ההדמיה הדיגיטלית; להתבונן המדגם המוצג על צג המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מדגם עבור תכונות הסלולר של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הגדלה במיקרוסקופ רצוי לרכוש תמונות באמצעות תוכנת הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור קבצים או בפורמט מיקרוסקופ קובץ מקורה או פורמט קובץ דחוס (לדוגמא: * .raw, * .tiff). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתמי הדמית ציטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ שדה בהיר מעבדה סטנדרטי ללא מסננים, מצויד במצלמת צבע דיגיטלית, מחובר למחשב מפעיל תוכנת רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום וחלק זכוכית מנעול (משלב 4.2.8) על במת מיקרוסקופ. רעננותם המדגם עם 100% אתנול לפי הצורך, לאורך כל ההליך הדמיה כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ההגדלה הנמוכה ביותר של מיקרוסקופ (למשל, המטרה פי 2.5) ולהפעיל המערכת הדמיה דיגיטלית דואר; להתבונן המדגם המוצג על צג המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא אוסף תא מיושר עם או X או Y ציר שליטה הבמה מיקרוסקופ. התאם במידת הצורך, על ידי הסרת להחליק את המכסה וסיבוב המדגם באמצעות קצה פיפטה או פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת הדמיה, לכידת תמונה (ים) מכלל המדגם עם ההגדלה במיקרוסקופ הנמוך ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Switch to ההגדלה במיקרוסקופ מתונה (למשל, 10 - 20X אובייקטיבי) ולהתאים מקור אור מיקרוסקופ ופרמטרי הדמית תוכנה (חשיפה, ניגודיות, איזון לבן, וכו &#39;), ולהשבית המדידה האוטומטית התוכנה שלהם. שמור הגדרות אלה לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע נקודות התחלה וסיום של סריקה (למשל, בפינה השמאלית עליונה ופינות ימניות תחתונות של אוסף תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת הדמיה, לכידת תמונה (ים) של האזור אוסף התא כולו בתוך נקודות התחלה וסיום. הבטח 20% מצד אל צד מלמעלה כלפי מטה לפי חפיפה between כל התמונות הסמוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור קבצים באמצעות פורמט קובץ מיקרוסקופ יליד או פורמט קובץ דחוס (לדוגמה: * .raw, * .tiff). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תמונת פנורמית סופית באמצעות תוכנת חיבור אוטומטית של בחירה (למשל, Adobe Photoshop אלמנטים). השתמש בתמונות התייחסות נלקחו ב שלב 5.2.5) כדי לאשר את הדיוק של התפרים האוטומטיים בתמונה הסופית. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Barbato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+variation+in+spontaneous+eye-blink+rate.">Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate.</a> Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).</li><li>Korb, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lid-Wiper+Epitheliopathy+and+Dry-Eye+Symptoms+in+Contact+Lens+Wearers.">Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers.</a> Eye &amp; Contact Lens. 28, 211-216 (2002).</li><li>Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+contemporary+contact+lenses+on+contact+lens+discontinuation.">The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation.</a> Eye &amp; Contact Lens. 39, 93-99 (2013).</li><li>Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction+measurements+on+contact+lenses+in+their+operating+environment.">Friction measurements on contact lenses in their operating environment.</a> Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).</li><li>Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIPCOF+and+contact+lens+wearers:+a+new+tool+to+forecast+subjective+dryness+and+degree+of+comfort+of+contact+lens+wearers.">LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers.</a> Contactologia. 22, 74-79 (2000).</li><li>Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+tests+for+successful+contact+lens+wear:+relationship+and+predictive+potential.">Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential.</a> Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).</li><li>Doughty, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+features+of+cells+along+Marx's+line+of+the+marginal+conjunctiva+of+the+human+eyelid.">Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid.</a> Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).</li><li>Jalbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+human+lid+margin+epithelium+using+impression+cytology.">Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology.</a> Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).</li><li>Nelson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology.">Impression cytology.</a> Cornea. 7, 71-81 (1988).</li><li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+conjunctival+biopsy.">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).</li><li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal microscopy. , 1-64 (1990).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+EyePRIM+Device+for+Conjunctival+Impression+for+Flow+Cytometry.">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry.</a> Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li><li>Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lid+margin+is+an+underestimated+structure+for+preservation+of+ocular+surface+health+and+development+of+dry+eye+disease.">The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease.</a> Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).</li><li>Knop, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lid+wiper+and+muco-cutaneous+junction+anatomy+of+the+human+eyelid+margins:+an+in+vivo+confocal+and+histological+study.">The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study.</a> J Anat. 218, 449-461 (2011).</li><li>Christensen, J. A., Skaarland, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+cell+area+measurements+in+the+cytological+evaluation+of+pleural+effusions:+a+study+of+subjective+assessments+and+morphometric+measurements.">Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements.</a> Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).</li></ol>

The authors have no relevant funding or conflicts to disclose.

ציטולוגיה רושמת בדרך כלל מבוצעת על הלחמית bulbar, באמצעות ממברנות אסתר תאיות מעורב. דוגמאות נחתכים לגודל מסדינים חומר בתפזורת, מעוקר, שיושמה להסיר מפני השטח של הלחמית באמצעות מלקחיים. כל שימוש אחר בחומר קרום אותו, מכשיר IC-נשלט בוכנה נועד לאחרונה כדי להתאים את הגיאומטריה...

העפעף העליון האנושי מבצע כ -10,000 מהבהבת מדי יום 1, עם רק 1 - באזור לחמית 2 מ&quot;מ צר מנוגדי העולם העיני. בשל התנועה המנגבת שלה במהלך למצמץ, חלק זה של שולי העפעף זכה לכינוי באזור &quot;מגב מכסה&quot; 2. ההנחה היא כי החיכוך הוא גדל באזור זה במהלך מהבהב הרגיל, בשל המכסה מנגב רחבי הגלובוס. זה עשוי לשחק תפקיד משמעותי בנוחות עינית. עדשות מגע חובשים באי נוחות עינית ניסיון מסוים וזאת אחת הסיבות העיקריות הפסקת עדשה ללבוש 3. כאשר עדשות מגע מושמות על העין, מקדם החיכוך בין חומר העדשה ואת משטח העין הוכח לשנות 4. יש ראיות המצביעות על כך סימפטומים יובש יכולים להיות קשורים חיכוך שונה זו 2,5,6. קשר זה יכול לבוא לידי ביטוי גם תופעות הנצפה קלינית, wi מכסה בעיקרלכל epitheliopathy (LWE), המכונה גם מכתים שולי העפעף העליון (ULMS) 6. LWE הוא סימן מוקדם של גירוי של העין מנבא פוטנציאל המחלה עין יבשה. הוא ציין ומדד ידי מכתים החיוניים של אזורים שולי העפעף העליון והתחתון. בעוד לדירוג זה מערכה 2 והתוקף הקליני שלה (כלומר, מתאם עם סימפטומים סובייקטיבי) עדיין ניטש ויכוח, אי נוחות עינית נותרת חידה עבור קלינאים ומדענים כאחד, והכי חשוב, מטרד עבור חולים. עד כה, מעט מאוד ידוע על וריאציות קליניות-רלוונטיות (תת) האנטומיה הסלולר והפיסיולוגיה של אזור מגב המכסה 7 ורק אחד דיווחים עושים שימוש בשיטות ציטולוגיה 8. ציטולוגית Impression (IC) הועסקה במשך 40 שנים כדי לאסוף תאים מפני השטח האפיתל של bulbar או לחמית tarsal ידי יישום של קרום 9,10. לאחר ההסרה, התאים החסידים לעבור גמכתים ytological והדמיה מיקרוסקופית. בשל ההבדלים אנטומיים הסלולר באזור המגב המכסה, טכניקה זו דורשת אופטימיזציה.

<table><tbody><tr><td>Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid</td><td>Sigma</td><td>B8438-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin, Gill 1</td><td>Sigma</td><td>GHS116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou stain, OG-6</td><td>Sigma</td><td>HT40116-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou stain, Modified EA</td><td>Sigma</td><td>HT40232-1L</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L-3224</td><td>contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes</td></tr><tr><td>Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert, 12&amp;nbsp;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass Bottom Dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

impression cytology of the lid wiper area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

קרום תרבית תאים, השתרע על בעל הפלסטיק הוא כלי נוח לאיסוף כף יד של תאי אפיתל מן לחמית מגב מכסה. שיטה זו מבטלת את הצורך מכשירים מעוקרים נוספים המשמשים בדרך כלל להכין ולטפל ממברנות IC. איור 1 מתאר את IC של האזור מגב המכסה באמצעות להכניס תרבית תאים. ...

Watch this Scientific Journal Video about Impression Cytology of the Lid Wiper Area at JoVE.com

Impression Cytology of the Lid Wiper Area

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

ציטולוגיה רושם של פינת מגב ומכסה

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

impression-cytology-of-the-lid-wiper-area

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Views.  University of Waterloo. We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort. 

Video: Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of tissue samples from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsies has become a key tool for understanding the complexity of tumor immunology and discovering novel predictive biomarkers for cancer immunotherapy. Immunoprofiling analysis of tissues requires the evaluation of combined markers, including inflammatory cell subpopulations and immune checkpoints, in the tumor microenvironment. The advent of novel multiplex immunohistochemical methods allows for a more efficient multiparametric analysis of single tissue sections than does standard monoplex immunohistochemistry (IHC). One commercially available multiplex immunofluorescence (IF) method is based on tyramide-signal amplification and, combined with multispectral microscopic analysis, allows for a better signal separation of diverse markers in tissue. This methodology is compatible with the use of unconjugated primary antibodies that have been optimized for standard IHC on FFPE tissue samples. Herein we describe in detail an automated protocol that allows multiplex IF labeling of carcinoma tissue samples with a six-marker multiplex antibody panel comprising PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67, and AE1/AE3 cytokeratins with 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole as a nuclear cell counterstain. The multiplex panel protocol is optimized in an automated IHC stainer for a staining time that is shorter than that of the manual protocol and can be directly applied and adapted by any laboratory investigator for immuno-oncology studies on human FFPE tissue samples. Also described are several controls and tools, including a drop-control method for fine quality control of a new multiplex IF panel, that are useful for the optimization and validation of the technique.

A detailed protocol for a six-marker multiplex immunofluorescence panel is optimized and performed, using an automated stainer for more consistent results and a shorter procedure time. This approach can be directly adapted by any laboratory for immuno-oncology studies.

לוח Immunofluorescence מולטיפלקס אוטומטיות חיסונית-אונקולוגיה במחקרים על דגימות רקמה קרצינומה פורמלין-קבוע

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Cancer Research

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Neuroscience

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Developmental Biology

הערכת ניאופלזיה קשקשית של משטח העין באמצעות HR-OCT של מקטע קדמי

Anterior High-Resolution Optical Coherence Tomography in the Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Ocular Surface Squamous Neoplasia

Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is the most common tumor of the ocular surface, ranging from mild dysplasia to invasive squamous carcinoma. Traditionally, the diagnosis of OSSN relies on histopathological confirmation followed by a full-thickness biopsy. However, in the past two decades, the therapeutic approach to OSSN has shifted from surgical intervention to topical chemotherapy regimens in clinical settings. This shift emphasizes the need for less invasive or non-invasive methods to diagnose ocular surface pathologies. Among various imaging devices, commercially available high-resolution optical coherence tomography (HR-OCT) has emerged as a powerful tool for the characterization of OSSN. HR-OCT provides an in vivo, cross-sectional view of ocular surface lesions, offering an "optical biopsy" for OSSN with high sensitivity and specificity. It provides valuable information in differentiating intraepithelial or invasive OSSN from other benign lesions. Additionally, HR-OCT can be used to monitor the response to topical chemotherapy and to detect subclinical OSSN during follow-up visits. In this article, the scanning protocol for image acquisition is presented, and image interpretation for OSSN is outlined. This standardized, practical, and reproducible approach is recommended in clinical workflows and is expected to assist clinicians in the management of OSSN.

מחבר זרקור: HR-OCT קדמי ככלי לא פולשני לאפיון ניאופלזיה קשקשית של משטח העין

Anterior segment high-resolution optical coherence tomography (HR-OCT) is a promising non-invasive modality for the diagnosis and therapeutic evaluation of ocular surface squamous neoplasia (OSSN). Here, the system setup, scanning technique, and representative diagnostic results are presented.

טומוגרפיה קוהרנטית אופטית קדמית ברזולוציה גבוהה באבחון וניטור טיפולי של ניאופלזיה קשקשית של משטח העין

Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is the most common tumor of the ocular surface, ranging from mild dysplasia to invasive squamous carcinoma. ...

Engineering

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

Immunology and Infection

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &ndash; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed due to challenges with different diagnostic modalities. Ciliary videomicroscopy, using Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), one of the diagnostic tools for PCD, is considered the optimal method to perform ciliary functional analysis (CFA), comprising of ciliary beat frequency (CBF) and beat pattern (CBP) analysis. However, DHSV lacks standardized, published operating procedure for processing and analyzing samples. It also uses living respiratory epithelium, a significant infection control issue during the COVID-19 pandemic. To continue providing a diagnostic service during this health crisis, the ciliary videomicroscopy protocol has been adapted to include adequate infection control measures.
Here, we describe a revised protocol for sampling and laboratory processing of ciliated respiratory samples, highlighting adaptations made to comply with COVID-19 infection control measures. Representative results of CFA from nasal brushing samples obtained from 16 healthy subjects, processed and analyzed according to this protocol, are described. We also illustrate the importance of obtaining and processing optimal quality epithelial ciliated strips, as samples not meeting quality selection criteria do now allow for CFA, potentially decreasing the diagnostic reliability and the efficiency of this technique.

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &#8211; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

To guarantee a successful and high-quality ciliary functional analysis for PCD diagnosis, a precise and careful method for respiratory epithelium sampling and processing is essential. To continue providing PCD diagnostic service during the COVID-19 pandemic, the ciliary videomicroscopy protocol has been updated to include appropriate infection control measures.

דגימה ועיבוד צחצוח אף באמצעות מיקרוסקופ וידאו ריסני דיגיטלי במהירות גבוהה – התאמה למגפת הקורונה

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

ציטולוגיה רושם של פינת מגב ומכסה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לוח Immunofluorescence מולטיפלקס אוטומטיות חיסונית-אונקולוגיה במחקרים על דגימות רקמה קרצינומה פורמלין-קבוע

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת

הכנה וניתוח מורפולוגי של תרביות תאי צמרת עצביים גולגולתיים של אפרוחים

טומוגרפיה קוהרנטית אופטית קדמית ברזולוציה גבוהה באבחון וניטור טיפולי של ניאופלזיה קשקשית של משטח העין

טומוגרפיה קוהרנטית אופטית קדמית ברזולוציה גבוהה באבחון וניטור טיפולי של ניאופלזיה קשקשית של משטח העין

טומוגרפיה קוהרנטית אופטית קדמית ברזולוציה גבוהה באבחון וניטור טיפולי של ניאופלזיה קשקשית של משטח העין

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

דגימה ועיבוד צחצוח אף באמצעות מיקרוסקופ וידאו ריסני דיגיטלי במהירות גבוהה – התאמה למגפת הקורונה

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה