This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

NB는 : 포유류 세포 배양에 필요한 다음 각 단계를 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. 또한, 최적의 무균 세포 배양에 대한 일반적인 가이드 라인, 적용 예., 팁 언제든지 그들이 교차 오염을 초래할 시각 세포의 양을 줄일 수있다 폐기 적절 전체 미디어 변경을 수행하지만 부드럽게 교반 할 때, 공기에 노출 될 세포 현탁액은 또한, 삽입 특수 처리가 필요 plasticware의 친절 등 자신의 균일 한 피펫을 보장합니다. 인서트를 조작 할 때마다 먼저, 쉽게 눈물 때문에 실험을 위태롭게 할 수있는 깨지기 쉬운 멤브레인을 만지지 마십시오. 멤브레인을 관통하거나 부착 세포를 해리 위험이 있으므로 또한, 상기 세포 배양 배지의 진공 흡인을 수행하기에 적합하지 않다. 다음으로, 삽입 따라서,주의 때 모 이용해야는 멀티 웰 조직 배양 판에 느슨하게 걸고plasticware을 ving 또는 부착 세포를 해리 피하기 위해 피펫 팅 할 때. 큰 기공 크기를 갖는 인서트를 사용할 때, 세포 배양 배지 따라서, 빈번하게 액체의 레벨을 모니터하는 것이 중요하다 멤브레인을 통해 스며 가능성이있다. 마지막으로, 다음과 같은 프로토콜이 부착 세포에 대한 설계 및 서스펜션 세포에 적합하기 위해 약간의 수정을 요구된다는 점에 유의. 삽입 공동 배양 실험을 실시 1. 일반 지침 <ol><li> 삽입에 시드 셀 타입 # 1 <ol><li> 자신의 포장에서 삽입을 풀다. </li><li> 적절한 크기의 빈 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 삽입을 배치합니다. 핀셋을 사용하여 삽입물의 맨 가장자리, 그래서 그립을 수행합니다. </li><li> 부착을 개선하고 부착 세포의 확산, 파종 전에 세포 배양 배지로 삽입 상태로. 이를 위해, 세포 배양 mediu과 멤브레인의 전체 표면을 덮마이크로 피펫을 사용하고 있습니다. 참고 : 필요한만큼의 삽입에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 접시에 뚜껑을 교체하고 동일한 조건에서 적어도 1 시간 또는 O / N 부화 (일반적으로 37 ° C, 5 ~ 10 %의 CO 2). </li><li> 삽입물이 조절 될 때, 마이크로 피펫을 사용하여 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오. </li><li> 멀티 웰 플레이트와 같은 방법으로 새​​로운 세포 배양 배지에서 종자 세포 유형 # 1. 이를 위해 마이크로 피펫으로 세포 현탁액의 적절한 양을 그리고 인서트 내의 액체를 분배. 참고 : 필요한만큼 삽입을 준비합니다. </li><li> 모든 인서트를 파종 한 후, 부드럽게 고르게 세포를 분산시키기 위해 앞뒤로 좌우 판 바위. 이것은 셀 인서트의 중심에 증가 할 수있는 바와 같이, 원형 운동을 피한다. </li><li> 접시에 뚜껑을 놓고 셀룰러 요구 사항 (일반적으로 37 ° C 당, 5 ~ 10 %의 CO에 의해 지정된 품다 <suB&gt; 2). </li></ol></li><li> 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 파종 세포 유형 # 2 <ol><li> 제 1 항에있어서, 새로운 세포 배양 배지에서 종자 세포 유형 # 2. </li><li> 인서트의 개수에 필요한만큼의 웰을 준비한다. 세포가 균일하게 우물에 분산되어 있는지 확인하는 단계 1.1.7에서와 같이 플레이트를) 바위. </li><li> 접시에 뚜껑을 놓고 동일한 조건에서 배양 (일반적으로 37 ° C, 5 ~ 10 %의 CO 2). </li></ol></li><li> 삽입에서 새로 고침 매체 <ol><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 세포 유형 # 1을 포함하는 인서트의 일부 또는 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오. </li><li> 새로운 세포 배양 배지의 적당한 양을 그린다. 부드럽게 삽입 체의 내벽에 팁 나머지 서서히 세포 배양 배지를 분배. </li><li> 접시에 뚜껑을 놓고 단계 1.1.4에 따라 품어. </li></ol></li><li> 멀티 웰 조직 배양 플레이트에서 새로 고침 매체 <ol><li> micropi를 사용하여pette는 일부 또는 세포 유형 # 2를 포함하는 웰의 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오. </li><li> 새로운 세포 배양 배지의 적당한 양을 그린다. 웰의 내벽에 팁을 나머지 서서히 세포 배양 배지를 분배. </li><li> 접시에 뚜껑을 배치 이전에 확립 된 세포 배양 프로토콜에 따라 배양한다. </li></ol></li><li> 세포 유형 # 2을 포함하는 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 세포 유형 # 1을 포함한 전송 인서트. 참고 : 두 종류의 세포가 적절한 성장 단계에 도달 한 경우이 단계를 수행합니다. <ol><li> 이전 단계 1.3) 1.4에 설명 된대로 우물에 삽입을 전송하기 전에), 필요한 매체를 변경합니다. 참고 :이 시점에서,이 삽입 제조업체의 지침에 의해 지정된 두 구획 미디어의 적절한 볼륨을 분배하는 것이 중요하다. </li><li> 그립 셀 t를 포함하는 삽입 체의 최상부 에지를 핀셋을 사용하여# 1 타 입 조심스럽게이 해당 잘 포함하는 세포 유형 번호에 넣습니다. </li><li> 모든 인서트를 전송 한 후, 인서트 막 아래에 기포의 존재를 확인한다. 주 : 기포가 인서트의 막을 가로 지르는 모든 교환을 방지하고, 전체 실험을 위태롭게 할 수있다. </li><li> 기포가 존재하는 경우, 아주 부드럽게 웰로부터 핀셋 삽입물을 들어 올리고 다시 세포 배양 배지 급락. 거품이 사라집니다. 그들은 여전히​​ 존재한다면, 비스듬히 위로 세포 배양 배지에 침지 부드럽게 삽입 시도. 참고 : 노크 또는 부착 세포를 해리 방지하기 위해 삽입을 저어하지 마십시오. </li><li> 모든 기포를 제거하고 양쪽 구획 미디어의 볼륨, 접시에 뚜껑을 배치하고 부화 것을 확인한 후. </li></ol></li><li> 공동 배양 시스템에서 새로 고침 미디어 참고 : 막 쉽게 삽입 사이에 미디어 교류를 할 수 있지만 잘, 매체를 새로 고침하는 것은 이루어집니다형 확산에 의해 상부 및 하부 구획실에 평형에 도달하는데 필요한 시간을 보낸 두 구획은 매우 길어질 수있다. <ol><li> 세포 유형 # 1을 포함하는 인서트 상쾌 중간 단계 1.3)와 동일하게 수행된다. </li><li> 세포 유형 # 2를 포함하는 우물에서 매체를 새로 고치려면 부드럽게 피펫 팁을 수용하기에 충분히 넓은 공간을 만들기 위해 측면에 삽입물을 밀어 넣습니다. ) 단계 1.4에서와 같이 매체를 새로 고칩니다. </li><li> ) 기포의 존재를 확인하고 1.5.5 단계의 1.5.3에 따라 볼륨)를 확인합니다. </li></ol></li></ol> 예 2 : PC12 신경 세포에 LPS 활성화 N9의 미세 아교 세포에 의해 분비 된 시토 킨의 효과를 측정 참고 : 다음 단계가 아니라 특정 플라스크와 접시 크기를 위해 설계되었습니다. 그러나, 프로토콜은 plasticware 치수에 맞게 사용자 정의 할 수 있습니다. 미디어 및 구성에 대한 자료 표를 참조하십시오. <ol><li> 시드 및 복수의 PC12 세포 분화잘 조직 배양 플레이트 <ol><li> 따뜻한 루틴 PC12 세포 배양액, 37 ° C의 수욕 PC12 분화 배지와 트립신 EDTA. </li><li> 75 ㎠로 플라스크에서 60~80%의 합류에 PC12 세포를 사용합니다. </li><li> 15mm의 파스퇴르 피펫, 플라스크의 전체 세포 배양 배지의 진공 흡입을 수행한다. </li><li> 부드럽게 멸균 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖의 세포 단층을 씻어 파스퇴르 피펫으로 액체를 제거합니다. 이 단계에서 세포를 떼어 놓다하지 않도록주의하십시오. </li><li> 트립신 EDTA 3 ㎖와 세포 단층을 덮고 37 ℃에서 2 ~ 3 분 동안 품어. </li><li> 모든 세포는 현미경으로 분리되어 있는지 확인합니다. 소수의 세포가 떠있는 경우 5 분의 최대 장기간 배양한다. </li><li> 트립신 - EDTA를 비활성화하기 위해 루틴 PC12 세포 배양액 10 ㎖를 추가한다. </li><li> 대부분의 세포는 O를 바닥에서 해리되어 있는지 확인하는 동안 10 ml를 피펫으로 부드럽게 씹다플라스크 바. 세포 현탁액에 공기 방울을 생성하지 마십시오. </li><li> 동일한 10 ㎖ 피펫, 50 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 3,200 XG에서 1 분 동안 원심 분리기 </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 버린다. </li><li> 10 ml의 피펫 루틴 PC12 세포 배양액 10 ㎖를 추가한다. 참고 : 펠렛이 비정상적으로 작거나 큰 경우이 볼륨을 조정할 수 있습니다. </li><li> 펠렛을 균질화 같은 10 ㎖ 피펫 씹다. PC12 세포는 자주 피펫 팅 적어도 20 있도록 함께 덩어리 필요 downare. 주 : 격렬한 분쇄하여 필요하지만, 세포 현탁액에 기포를 생성하지 않도록. </li><li> 1.5 ㎖의 튜브에 트리 판 블루 세포 현탁액의 적절한 희석액을 준비한다. 이전에 설정된 프로토콜 (74)에 따라 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 별도의 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 분할PC12 분화 배지로 24 웰 플레이트에서 (30,000 ¢ / cm 2, 잘 제조사의 프로토콜에 따라 당 0.6 ml)에 우물을 시드의 희석 세포 현탁액의 적절한을 얻었다. 주 : 미리 설정된 프로토콜 (75)에 의해 규정 된 24 웰 플레이트는 이전 콜라겐으로 코팅되어야한다. </li><li> 웰 마이크로 피펫 당 세포 현탁액 0.6 mL를 배포. </li><li> 모든 우물이 시드되면) 단계 1.1.7에서와 같이 판 바위. </li><li> PC12 세포의 적절한 분화 공동 배양 실험을 수행하기 전에 PC12 분화 배지 (15, 16)의 5 % CO 2 습한 대기 중에서 37 ℃에서 7-9일 대한 24 웰 플레이트를 부화 허용한다. </li><li> 액의 절반을 제거하고 신선한 PC12 분화 배지 동일 부피로 교체하여 매일 매체 변화를 수행한다. </li></ol></li><li> 인서트에 N9 미세 아교 세포를 파종 및 LPS로 처리 <ol><li> 하루 공동 배양 실험을 수행하기 전에, 1.1.4 내지 1.1.1 단계)에 따라 세포 접착 성을 최적화 루틴 N9 세포 배양 배지와 PTFE 0.4 μm의 세공 삽입 전 처리) </li><li> 37 ° C의 물 중탕에서 따뜻한 루틴 N9 세포 배양 배지와 트립신 EDTA. </li><li> 한편, 나중에 사용하기 위해 1.5 ㎖의 튜브에 LPS의 약 10 mg의 무게. 참고 : LPS는 강력한 염증성 독소이며, 특히 안전주의 사항, 안경, 장갑을 필요로하고, 미립자 인공 호흡기를 적극 권장하고 있기 때문에. </li><li> 75 ㎠로 플라스크에서 80-90%의 합류에 N9 세포를 사용합니다. </li><li> ) 2.1.14 스텝 2.1.3)을 따릅니다. 항상 루틴 N9 세포 배양액 대신 루틴 PC12 세포 배양 배지를 사용한다. 또한) N9의 미세 아교 세포가 많은 PC12 세포처럼 함께 그렇게 적은 피펫을 응집하지 않고 아래 단계 2.1.13에서해야 할 수도 있습니다. </li><li> 별도의 50 mL의 튜브, N9 세포 배양 배지에서 세포 현탁액 O로 분할24 웰 플레이트에 개최하도록 설계 삽입 (60,000 ¢ / cm 2, 제조사의 프로토콜에 따라 삽입 당 0.05 ㎖를, 막 표면 영역에 대한 제조업체의 정보를 참조) 시드에 적합한 희석 세포 현탁액 btain. 참고 :이 삽입은 이미 제조 업체 콜라겐으로 코팅하고, 세포 부착에 최적화되어 있습니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 인서트 당 세포 현탁액 0.05 mL를 배포. </li><li> 모든 삽입이 시드되면) 단계 1.1.7에서와 같이 판 바위. </li><li> 4 μg의 2 μg의 / ㎖ / ㎖, 1 μg의가 / ㎖ 작업 용액을 얻었다 N9 처리 매체를 이용하여 LPS의 연속 희석을 수행한다. </li><li> 피펫 0.05 μg의 2 / ㎖의 최종 희석액을 수득하기 위해 하나의 인서트의 세트 내의 4 μg의 / ㎖ 작업 용액의 용액. </li><li> 다른 세트 인서트의 다른 두 작업 솔루션을위한 단계를 반복 2.2.10), / ㎖ 및 0.5 μg의 / 각각 ml로 1 μg의 최종 희석을 얻었다. </li><li> 에서공동 배양 실험을 수행하기 전에 LPS와 N9의 미세 아교 세포의 활성화를 허용하기 위해 5 % CO 2 습한 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 삽입물을 함유하는 판을 cubate. </li></ol></li><li> 공동 배양 된 미세 아교 세포로 N9 PC12 신경 세포 <ol><li> PC12 세포를 분화 7-9일에서 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 N9 처리 매체와 PC12 처리 매체에 의해 LPS와 배양 24 시간 후 N9의 미세 아교 세포를 활성화합니다. </li><li> N9 처리 매체의 0.1 ml로 전체 사용되는 매체를 교체, 단계 1.3)에서와 같이 N9의 미세 아교 세포에 대한 총 매체 변경을 수행합니다. 모든 insert.This에 대해이 작업을 수행하면 삽입 만 활성화 N9의 미세 아교 세포를 떠나, LPS의 모든 흔적을 제거 할 필요가있다. </li><li> ) 단계 1.4에서와 같이 신경 PC12 세포에 대한 총 매체 변경을 수행합니다. 5 % CO 2 습한 분위기에서 37 ℃에서 24 시간 또는 48 시간에 대한 N9-PC12 공동 배양)을 150 단계에서와 같이 24 웰 플레이트에 삽입물을 전송 .Incubate. </li><li> 24 후시간이나 48 시간이 뜨는 및 / 또는 세포 독성, 효소 면역 분석법을위한 세포 (ELISA), 웨스턴 블롯, 또는 기타 분석 수확. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

모든 삽입 공동 문화 시스템 실험의 가장 중요한 단계는 실제로 사용하기에 적합한 인서트를 선택하는 거. 공극 크기 및 막 재료 시드 될 세포 형태 및 실험 목적을 고려 잊지 않고 철저한 고려되어야한다. 예를 들어, chemotaxic 분석은 세포 - 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 행동 변조를 분석하는 세포 공동 배양보다 공막의 동일한 유형을 사용할 수있다. 세포의 이동 및 세?...

시험관 내에서 조직, 기관 또는 시스템의 연구는 다세포 유기체를 포함하는 여러 세포 아형 사이에 존재하는 매우 복잡한 관계를 단순화하기위한 시도이다. 실제로, 시험 관내 연구는 가능한 하나의 세포 집단에 대한 자세한 이해를 취득 할 수 있습니다. 1) 쉽게 휴대 환경을 조작 할 수 2) 능력 세포 상호 작용을 감소하고, : 시험 관내 실험에서 수행의 두 가지 장점이 있습니다. 따라서, 이러한 두 가지 장점이 허용 한 연구진은 전체 유기체 외부 영향의 결과를 조절하는 능력에 이르는, 생체 내에서 특정한 유형의 세포의 행동을 예측한다. 그런 의미에서, 체외 세포 배양은 종종 기초 및 응용 생명 과학을 연결하는 다리로 작동합니다. 그럼에도 불구하고, 시험 관내에서 작동하는 여러 단점도 있는데, 가장 중요한 특정 예약 생리적으로 거하여되는 것을관찰 된 표현형의 알 관련성. 실제로, 하나의 세포 유형은 용기에서 배양하면, 배양은 다양한 범위까지 상실, 다른 세포 유형, 조직과 기원의 유기체 및 앵커 내에서 체액 환경에 기여와의 세포 간 연결 이를 활성화 조직 세포 기능에 중요한 때로 특정 입체 구조를 유지한다. 세포 간 관계의 문제가 혼합 된 배양 기술의 개발에 의해 해결되었다. 이 방법에서, 두 개 이상 세포 집단은 동일한 배양 용기에서 함께 성장시킨다. 그러나 이러한 혼합 문화는 중요한 불편을 부담. 한편, 일부 세포 아형 물리적 기원 조직으로 서로 상호 작용하지 않는 분비 가용성 인자 수용체 근처로 유지 분비 통신에만 의존. 이것은 근위 사이토 카인 신호에 따라 여러 가지 염증 과정의 경우입니다. 혼합 C에서ultures 물리적 상호 작용을 피할 수 있고 불가능 변경된 결과를 얻을 수있는 세포 - 세포 접촉의 부재 분비 통신 연구를 만든다. 한편, 혼합 집단 내에서 세포의 특정 해석을 달성하기 위해서는 상당히 결과에 미치는 영향을 거친 분리 기술의 사용없이 실행할 수 없게된다. 이러한 중요한 문제를 해결하기 위해, 조정 배지를 사용 실형 문화 분비 신호 전달 연구를 허용하는 기술이 개발되고있다. 이 방법은 세포의 다른 집단을 함유 한 웰 세포 유형, 따라서 에어컨 명명 된 배지 상등액의 전송을 요구한다. 그러나 중요한 단점은 단명 한 분자가 셀의 두번째 집단의 웰에 전송되는 조정 된 배지에서 충분히 생존하지 않는다는 것이다. 심지어 수명이 긴 분자는 크게 인해 확산에 시간이 지남에 희석됩니다. 또한, 두 세포인구는 단방향 통신 분비보다는 활성 쌍방향 통신에 참여한다. 이것은 그들이 체내에 존재하는 정확한 다세포 관계를 재현에서 중요한 피드백 신호의 부재로 이끈다. 결과적으로 더 나은 관내 셀룰러 환경에서의 생체 내 조건에서 일본어를 시뮬레이션 할 필요성에 의해 구동 세포 배양 기술의 여러 발전은 수년 동안 실현되어왔다. 가장 중요한 발전 중 하나는 1953 년 Grobstein 의해 처음 사용 된 세포 배양을 구획화를위한 미세 다공성 막과 투과성 지지체의 사용이었다 1. 이러한 투과성 지지체는 다수의 세포 유형을 수용하고 사용하기 년간 맞추어왔다 여러 가지 응용 프로그램입니다. 현재, 이러한 지원은 멀티 웰 조직 배양 접시에서 또는 새로운 Circu에 우물에서 휴식을 설계 속이 빈 삽입 존재LAR 요리. 공동 배양 시스템에서, 삽입이 잘 반면, 하나의 셀 유형을 포함하거나 요리는 체액 환경 (그림 1)에 세포의 서로 다른 두 집단의 기여를 연구 할 수 있도록, 다른 세포 인구를 포함한다. 그 결과, (혀끝의 분비 또는 신호 수신 대 기저) 세포 극성 따라서 혼합 문화와 에어컨 매체 기술을 통해 삽입 공동 문화 시스템에게 중요한 이점을 부여, 보존됩니다. 멤브레인 재료의 몇 가지 유형이 사용할 수있는 가장 일반적인 것 인 폴리 에스테르 (PET), 폴리 카보네이트 (PC) 또는 콜라겐 코팅 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)가 0.4 μm의 12.0 ㎛의 범위의 상이한 기공 크기에 존재. 재료 및 기공 크기의이 품종에 한정되지 사용하는 다음에 대해 서로 다른 수준에서 그들을 실용적 광학 특성, 막 두께 및 세포 부착과 관련된 변수 기능을 발휘 삽입의 스펙트럼을 제공합니다 : -studying세포 분화, 배아 발달, 종양 전이 및 투과 막을 통해 chemotaxic 분석에 의해 상처 수리; 상피 또는 내피 단일 층을 통해 전송을 평가하여 약물의 침투를 -evaluating은 투과성 지원에 배양하고; -performing 세포 공동 배양은 세포 - 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 변조 동작을 분석한다. 이 문서의 목적은 삽입 공 배양 시스템을 이용한 세포 - 세포 접촉이없는 분비 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가하는 상술 한 제 기능을 수행하기 위해 일반적인 방법론 지침을 설명하는 것이다. 연구의 여러 다른 필드는 세포 집단에서 분비 된 가용성 인자의 영향에 관련된 질문에 대답하기 위해 삽입 공 배양 시스템을 사용한다. 다양한 수준에서 세포 행동을 조절 실제로 분비 신호는 모든 조직에서 관련입니다및 삽입 공 배양 시스템을 만드는 시스템은이 분야의 발전을 위해 불가결. 반대로, 그 신호 전달을 확인할 수있는 인서트의 사용은 직접 세포 - 세포 접촉이 아닌 분비 요인이다. 인서트의 가장 중요한 용도 중 하나는 분비 된 사이토 카인의 효과는 다양한 면역 세포에서 평가되는 플레이어 염증 연구 2-14이다. 특히, 중추 신경계 (CNS) 염증의 연구는 더 크게 신경 염증 15-21 구동 뉴런 및 미세 아교 세포의 분비 독특한 역할을 정의 할 수있는 삽입 공 배양 과정에서 이익이있다. 이러한 시스템은 또한 감소 시키거나 염증성 인자 22-26의 분비를 억제하는 능력에 의존하여 분자의 항 염증 가능성을 연구하기 위해 고안되었다. 연구 메커니즘, 특히 암 27-31 관련된 혈관 32-34과 inflammati의 기초종양의 35-42에, 또한 삽입 공동 문화 시스템에서 도움이됩니다. 또한, 수용성 요소는 분화와 여러 연구가 특정 필드 43-50에서 질문에 답 삽입을 사용한 구동 과정에서 가장 중요하다. 중추 신경계에서 신경 조직으로 보는 것은 매우 제한된 갱신 전위 neurotrophism 연구를 가지며, 신경은 근본적인 널리 공존 배양 시스템 51-56 줄기 세포의 사용에 의해 확보되어왔다. 또한, 삽입은 신장 57, 58, 내피 상호 작용과 혈관 신생 59-62, 세포 사멸 비만과 대사 증후군 22,23,66-67에 63 ~ 65, 염증 신호, 내이 머리 세포 보호 등 다양한 분야에 활용된다 68,69, 심지어 곰팡이 독성 (70, 71) 및 기생충학 72, 73입니다. 이 문서에서는 experim을 설정하기 위해 일반적인 방법 론적 지침을 제공합니다삽입 공 배양 시스템을 사용하여 분비 된 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가보기 이비인후과. 특히, 우리는 신경 세포의 공동 문화와 신경 염증성 과정을 공부하고 자신의 용도에 우리의 관심을 초점을 맞출 것이다. 파일럿을 가능하게 삽입 실험의 매우 넓은 스펙트럼을 감안할 때,이 세포 배양 기술의 모든 측면을 다루 견딜 수있다. 예를 들어, 특정 프로토콜은 삽입 공 배양 방법의 구체적인 이해를 제공하는 상세하게 설명 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 분비되는 사이토 카인의 효과 PC12 신경 세포에 대한 N9의 미세 아교 세포를 부활 측정.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8755</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6421</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2040</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;">MultiCell</td>
			<td style="width:119px;">80350</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N0513</td>
			<td style="width:328px;">Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&#8211;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Lipopolysaccharides from&#160;Escherichia coli&#160;055:B5</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2880</td>
			<td style="width:328px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Cell culture inserts for use with 24-well plates</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353095</td>
			<td style="width:328px;">0.4 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">24-well plates</td>
			<td style="width:71px;">TrueLine</td>
			<td style="width:119px;">TR5002</td>
			<td style="width:328px;">Coat with collagen before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Routine PC12 cell culture medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Routine N9 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 85% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 90% DMEM-F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% heat-inactivated horse serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% heat-inactivated horse serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC12 differentiation medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N9 treatment medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% DMEM-F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated horse serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 50 ng/mL nerve growth factor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC12 treatment medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

삽입 공 배양 시스템의 사용은 CNS의 다른 세포 분비 플레이어 사이의 관계를 보여주는 신경 염증성 과정의 연구에 특히 적절하다. 중추 신경계에서 면역은 휴식 분지의 상태 (그림 2A)에서 자신의 환경을 모니터링하고 감지 방해 할 수있는 미세 아교 세포라는 거주자 세포에 의해 주로 수행되는 수 문제가 적절한 신경 기능 76-78에 필요한 매우 귀중한 ?...

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Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K 조회수.  University of Québec. In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

난생의 부재에서 자기 갱신 mESC를 지원하기 위해 SC1 (Pluripotin)의 사용

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

자기편 셀룰러 문화에 대한 산소 삽입 제작 및 운영

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

의 시각화 Caenorhabditis Elegans</emLipophilic 바이탈 염료, DiI를 사용하기> 표피 구조

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

감지 개구리 정자 Chemoattraction에 대한 Assays 두 종류의

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

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