Name: development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact at JoVE.com

This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

NB는 : 포유류 세포 배양에 필요한 다음 각 단계를 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 수행되어야한다. 또한, 최적의 무균 세포 배양에 대한 일반적인 가이드 라인, 적용 예., 팁 언제든지 그들이 교차 오염을 초래할 시각 세포의 양을 줄일 수있다 폐기 적절 전체 미디어 변경을 수행하지만 부드럽게 교반 할 때, 공기에 노출 될 세포 현탁액은 또한, 삽입 특수 처리가 필요 plasticware의 친절 등 자신의 균일 한 피펫을 보장합니다. 인서트를 조작 할 때마다 먼저, 쉽게 눈물 때문에 실험을 위태롭게 할 수있는 깨지기 쉬운 멤브레인을 만지지 마십시오. 멤브레인을 관통하거나 부착 세포를 해리 위험이 있으므로 또한, 상기 세포 배양 배지의 진공 흡인을 수행하기에 적합하지 않다. 다음으로, 삽입 따라서,주의 때 모 이용해야는 멀티 웰 조직 배양 판에 느슨하게 걸고plasticware을 ving 또는 부착 세포를 해리 피하기 위해 피펫 팅 할 때. 큰 기공 크기를 갖는 인서트를 사용할 때, 세포 배양 배지 따라서, 빈번하게 액체의 레벨을 모니터하는 것이 중요하다 멤브레인을 통해 스며 가능성이있다. 마지막으로, 다음과 같은 프로토콜이 부착 세포에 대한 설계 및 서스펜션 세포에 적합하기 위해 약간의 수정을 요구된다는 점에 유의. 삽입 공동 배양 실험을 실시 1. 일반 지침 <ol><li> 삽입에 시드 셀 타입 # 1 <ol><li> 자신의 포장에서 삽입을 풀다. </li><li> 적절한 크기의 빈 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 삽입을 배치합니다. 핀셋을 사용하여 삽입물의 맨 가장자리, 그래서 그립을 수행합니다. </li><li> 부착을 개선하고 부착 세포의 확산, 파종 전에 세포 배양 배지로 삽입 상태로. 이를 위해, 세포 배양 mediu과 멤브레인의 전체 표면을 덮마이크로 피펫을 사용하고 있습니다. 참고 : 필요한만큼의 삽입에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 접시에 뚜껑을 교체하고 동일한 조건에서 적어도 1 시간 또는 O / N 부화 (일반적으로 37 ° C, 5 ~ 10 %의 CO 2). </li><li> 삽입물이 조절 될 때, 마이크로 피펫을 사용하여 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오. </li><li> 멀티 웰 플레이트와 같은 방법으로 새​​로운 세포 배양 배지에서 종자 세포 유형 # 1. 이를 위해 마이크로 피펫으로 세포 현탁액의 적절한 양을 그리고 인서트 내의 액체를 분배. 참고 : 필요한만큼 삽입을 준비합니다. </li><li> 모든 인서트를 파종 한 후, 부드럽게 고르게 세포를 분산시키기 위해 앞뒤로 좌우 판 바위. 이것은 셀 인서트의 중심에 증가 할 수있는 바와 같이, 원형 운동을 피한다. </li><li> 접시에 뚜껑을 놓고 셀룰러 요구 사항 (일반적으로 37 ° C 당, 5 ~ 10 %의 CO에 의해 지정된 품다 <suB&gt; 2). </li></ol></li><li> 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 파종 세포 유형 # 2 <ol><li> 제 1 항에있어서, 새로운 세포 배양 배지에서 종자 세포 유형 # 2. </li><li> 인서트의 개수에 필요한만큼의 웰을 준비한다. 세포가 균일하게 우물에 분산되어 있는지 확인하는 단계 1.1.7에서와 같이 플레이트를) 바위. </li><li> 접시에 뚜껑을 놓고 동일한 조건에서 배양 (일반적으로 37 ° C, 5 ~ 10 %의 CO 2). </li></ol></li><li> 삽입에서 새로 고침 매체 <ol><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 세포 유형 # 1을 포함하는 인서트의 일부 또는 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오. </li><li> 새로운 세포 배양 배지의 적당한 양을 그린다. 부드럽게 삽입 체의 내벽에 팁 나머지 서서히 세포 배양 배지를 분배. </li><li> 접시에 뚜껑을 놓고 단계 1.1.4에 따라 품어. </li></ol></li><li> 멀티 웰 조직 배양 플레이트에서 새로 고침 매체 <ol><li> micropi를 사용하여pette는 일부 또는 세포 유형 # 2를 포함하는 웰의 세포 배양 배지를 모두 제거한다. 사용 된 매체를 폐기하십시오. </li><li> 새로운 세포 배양 배지의 적당한 양을 그린다. 웰의 내벽에 팁을 나머지 서서히 세포 배양 배지를 분배. </li><li> 접시에 뚜껑을 배치 이전에 확립 된 세포 배양 프로토콜에 따라 배양한다. </li></ol></li><li> 세포 유형 # 2을 포함하는 멀티 웰 조직 배양 플레이트에 세포 유형 # 1을 포함한 전송 인서트. 참고 : 두 종류의 세포가 적절한 성장 단계에 도달 한 경우이 단계를 수행합니다. <ol><li> 이전 단계 1.3) 1.4에 설명 된대로 우물에 삽입을 전송하기 전에), 필요한 매체를 변경합니다. 참고 :이 시점에서,이 삽입 제조업체의 지침에 의해 지정된 두 구획 미디어의 적절한 볼륨을 분배하는 것이 중요하다. </li><li> 그립 셀 t를 포함하는 삽입 체의 최상부 에지를 핀셋을 사용하여# 1 타 입 조심스럽게이 해당 잘 포함하는 세포 유형 번호에 넣습니다. </li><li> 모든 인서트를 전송 한 후, 인서트 막 아래에 기포의 존재를 확인한다. 주 : 기포가 인서트의 막을 가로 지르는 모든 교환을 방지하고, 전체 실험을 위태롭게 할 수있다. </li><li> 기포가 존재하는 경우, 아주 부드럽게 웰로부터 핀셋 삽입물을 들어 올리고 다시 세포 배양 배지 급락. 거품이 사라집니다. 그들은 여전히​​ 존재한다면, 비스듬히 위로 세포 배양 배지에 침지 부드럽게 삽입 시도. 참고 : 노크 또는 부착 세포를 해리 방지하기 위해 삽입을 저어하지 마십시오. </li><li> 모든 기포를 제거하고 양쪽 구획 미디어의 볼륨, 접시에 뚜껑을 배치하고 부화 것을 확인한 후. </li></ol></li><li> 공동 배양 시스템에서 새로 고침 미디어 참고 : 막 쉽게 삽입 사이에 미디어 교류를 할 수 있지만 잘, 매체를 새로 고침하는 것은 이루어집니다형 확산에 의해 상부 및 하부 구획실에 평형에 도달하는데 필요한 시간을 보낸 두 구획은 매우 길어질 수있다. <ol><li> 세포 유형 # 1을 포함하는 인서트 상쾌 중간 단계 1.3)와 동일하게 수행된다. </li><li> 세포 유형 # 2를 포함하는 우물에서 매체를 새로 고치려면 부드럽게 피펫 팁을 수용하기에 충분히 넓은 공간을 만들기 위해 측면에 삽입물을 밀어 넣습니다. ) 단계 1.4에서와 같이 매체를 새로 고칩니다. </li><li> ) 기포의 존재를 확인하고 1.5.5 단계의 1.5.3에 따라 볼륨)를 확인합니다. </li></ol></li></ol> 예 2 : PC12 신경 세포에 LPS 활성화 N9의 미세 아교 세포에 의해 분비 된 시토 킨의 효과를 측정 참고 : 다음 단계가 아니라 특정 플라스크와 접시 크기를 위해 설계되었습니다. 그러나, 프로토콜은 plasticware 치수에 맞게 사용자 정의 할 수 있습니다. 미디어 및 구성에 대한 자료 표를 참조하십시오. <ol><li> 시드 및 복수의 PC12 세포 분화잘 조직 배양 플레이트 <ol><li> 따뜻한 루틴 PC12 세포 배양액, 37 ° C의 수욕 PC12 분화 배지와 트립신 EDTA. </li><li> 75 ㎠로 플라스크에서 60~80%의 합류에 PC12 세포를 사용합니다. </li><li> 15mm의 파스퇴르 피펫, 플라스크의 전체 세포 배양 배지의 진공 흡입을 수행한다. </li><li> 부드럽게 멸균 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖의 세포 단층을 씻어 파스퇴르 피펫으로 액체를 제거합니다. 이 단계에서 세포를 떼어 놓다하지 않도록주의하십시오. </li><li> 트립신 EDTA 3 ㎖와 세포 단층을 덮고 37 ℃에서 2 ~ 3 분 동안 품어. </li><li> 모든 세포는 현미경으로 분리되어 있는지 확인합니다. 소수의 세포가 떠있는 경우 5 분의 최대 장기간 배양한다. </li><li> 트립신 - EDTA를 비활성화하기 위해 루틴 PC12 세포 배양액 10 ㎖를 추가한다. </li><li> 대부분의 세포는 O를 바닥에서 해리되어 있는지 확인하는 동안 10 ml를 피펫으로 부드럽게 씹다플라스크 바. 세포 현탁액에 공기 방울을 생성하지 마십시오. </li><li> 동일한 10 ㎖ 피펫, 50 mL의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 3,200 XG에서 1 분 동안 원심 분리기 </li><li> 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 파스퇴르 피펫으로 상층 액을 버린다. </li><li> 10 ml의 피펫 루틴 PC12 세포 배양액 10 ㎖를 추가한다. 참고 : 펠렛이 비정상적으로 작거나 큰 경우이 볼륨을 조정할 수 있습니다. </li><li> 펠렛을 균질화 같은 10 ㎖ 피펫 씹다. PC12 세포는 자주 피펫 팅 적어도 20 있도록 함께 덩어리 필요 downare. 주 : 격렬한 분쇄하여 필요하지만, 세포 현탁액에 기포를 생성하지 않도록. </li><li> 1.5 ㎖의 튜브에 트리 판 블루 세포 현탁액의 적절한 희석액을 준비한다. 이전에 설정된 프로토콜 (74)에 따라 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 별도의 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 분할PC12 분화 배지로 24 웰 플레이트에서 (30,000 ¢ / cm 2, 잘 제조사의 프로토콜에 따라 당 0.6 ml)에 우물을 시드의 희석 세포 현탁액의 적절한을 얻었다. 주 : 미리 설정된 프로토콜 (75)에 의해 규정 된 24 웰 플레이트는 이전 콜라겐으로 코팅되어야한다. </li><li> 웰 마이크로 피펫 당 세포 현탁액 0.6 mL를 배포. </li><li> 모든 우물이 시드되면) 단계 1.1.7에서와 같이 판 바위. </li><li> PC12 세포의 적절한 분화 공동 배양 실험을 수행하기 전에 PC12 분화 배지 (15, 16)의 5 % CO 2 습한 대기 중에서 37 ℃에서 7-9일 대한 24 웰 플레이트를 부화 허용한다. </li><li> 액의 절반을 제거하고 신선한 PC12 분화 배지 동일 부피로 교체하여 매일 매체 변화를 수행한다. </li></ol></li><li> 인서트에 N9 미세 아교 세포를 파종 및 LPS로 처리 <ol><li> 하루 공동 배양 실험을 수행하기 전에, 1.1.4 내지 1.1.1 단계)에 따라 세포 접착 성을 최적화 루틴 N9 세포 배양 배지와 PTFE 0.4 μm의 세공 삽입 전 처리) </li><li> 37 ° C의 물 중탕에서 따뜻한 루틴 N9 세포 배양 배지와 트립신 EDTA. </li><li> 한편, 나중에 사용하기 위해 1.5 ㎖의 튜브에 LPS의 약 10 mg의 무게. 참고 : LPS는 강력한 염증성 독소이며, 특히 안전주의 사항, 안경, 장갑을 필요로하고, 미립자 인공 호흡기를 적극 권장하고 있기 때문에. </li><li> 75 ㎠로 플라스크에서 80-90%의 합류에 N9 세포를 사용합니다. </li><li> ) 2.1.14 스텝 2.1.3)을 따릅니다. 항상 루틴 N9 세포 배양액 대신 루틴 PC12 세포 배양 배지를 사용한다. 또한) N9의 미세 아교 세포가 많은 PC12 세포처럼 함께 그렇게 적은 피펫을 응집하지 않고 아래 단계 2.1.13에서해야 할 수도 있습니다. </li><li> 별도의 50 mL의 튜브, N9 세포 배양 배지에서 세포 현탁액 O로 분할24 웰 플레이트에 개최하도록 설계 삽입 (60,000 ¢ / cm 2, 제조사의 프로토콜에 따라 삽입 당 0.05 ㎖를, 막 표면 영역에 대한 제조업체의 정보를 참조) 시드에 적합한 희석 세포 현탁액 btain. 참고 :이 삽입은 이미 제조 업체 콜라겐으로 코팅하고, 세포 부착에 최적화되어 있습니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여 인서트 당 세포 현탁액 0.05 mL를 배포. </li><li> 모든 삽입이 시드되면) 단계 1.1.7에서와 같이 판 바위. </li><li> 4 μg의 2 μg의 / ㎖ / ㎖, 1 μg의가 / ㎖ 작업 용액을 얻었다 N9 처리 매체를 이용하여 LPS의 연속 희석을 수행한다. </li><li> 피펫 0.05 μg의 2 / ㎖의 최종 희석액을 수득하기 위해 하나의 인서트의 세트 내의 4 μg의 / ㎖ 작업 용액의 용액. </li><li> 다른 세트 인서트의 다른 두 작업 솔루션을위한 단계를 반복 2.2.10), / ㎖ 및 0.5 μg의 / 각각 ml로 1 μg의 최종 희석을 얻었다. </li><li> 에서공동 배양 실험을 수행하기 전에 LPS와 N9의 미세 아교 세포의 활성화를 허용하기 위해 5 % CO 2 습한 분위기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 삽입물을 함유하는 판을 cubate. </li></ol></li><li> 공동 배양 된 미세 아교 세포로 N9 PC12 신경 세포 <ol><li> PC12 세포를 분화 7-9일에서 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 N9 처리 매체와 PC12 처리 매체에 의해 LPS와 배양 24 시간 후 N9의 미세 아교 세포를 활성화합니다. </li><li> N9 처리 매체의 0.1 ml로 전체 사용되는 매체를 교체, 단계 1.3)에서와 같이 N9의 미세 아교 세포에 대한 총 매체 변경을 수행합니다. 모든 insert.This에 대해이 작업을 수행하면 삽입 만 활성화 N9의 미세 아교 세포를 떠나, LPS의 모든 흔적을 제거 할 필요가있다. </li><li> ) 단계 1.4에서와 같이 신경 PC12 세포에 대한 총 매체 변경을 수행합니다. 5 % CO 2 습한 분위기에서 37 ℃에서 24 시간 또는 48 시간에 대한 N9-PC12 공동 배양)을 150 단계에서와 같이 24 웰 플레이트에 삽입물을 전송 .Incubate. </li><li> 24 후시간이나 48 시간이 뜨는 및 / 또는 세포 독성, 효소 면역 분석법을위한 세포 (ELISA), 웨스턴 블롯, 또는 기타 분석 수확. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

모든 삽입 공동 문화 시스템 실험의 가장 중요한 단계는 실제로 사용하기에 적합한 인서트를 선택하는 거. 공극 크기 및 막 재료 시드 될 세포 형태 및 실험 목적을 고려 잊지 않고 철저한 고려되어야한다. 예를 들어, chemotaxic 분석은 세포 - 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 행동 변조를 분석하는 세포 공동 배양보다 공막의 동일한 유형을 사용할 수있다. 세포의 이동 및 세?...

시험관 내에서 조직, 기관 또는 시스템의 연구는 다세포 유기체를 포함하는 여러 세포 아형 사이에 존재하는 매우 복잡한 관계를 단순화하기위한 시도이다. 실제로, 시험 관내 연구는 가능한 하나의 세포 집단에 대한 자세한 이해를 취득 할 수 있습니다. 1) 쉽게 휴대 환경을 조작 할 수 2) 능력 세포 상호 작용을 감소하고, : 시험 관내 실험에서 수행의 두 가지 장점이 있습니다. 따라서, 이러한 두 가지 장점이 허용 한 연구진은 전체 유기체 외부 영향의 결과를 조절하는 능력에 이르는, 생체 내에서 특정한 유형의 세포의 행동을 예측한다. 그런 의미에서, 체외 세포 배양은 종종 기초 및 응용 생명 과학을 연결하는 다리로 작동합니다. 그럼에도 불구하고, 시험 관내에서 작동하는 여러 단점도 있는데, 가장 중요한 특정 예약 생리적으로 거하여되는 것을관찰 된 표현형의 알 관련성. 실제로, 하나의 세포 유형은 용기에서 배양하면, 배양은 다양한 범위까지 상실, 다른 세포 유형, 조직과 기원의 유기체 및 앵커 내에서 체액 환경에 기여와의 세포 간 연결 이를 활성화 조직 세포 기능에 중요한 때로 특정 입체 구조를 유지한다. 세포 간 관계의 문제가 혼합 된 배양 기술의 개발에 의해 해결되었다. 이 방법에서, 두 개 이상 세포 집단은 동일한 배양 용기에서 함께 성장시킨다. 그러나 이러한 혼합 문화는 중요한 불편을 부담. 한편, 일부 세포 아형 물리적 기원 조직으로 서로 상호 작용하지 않는 분비 가용성 인자 수용체 근처로 유지 분비 통신에만 의존. 이것은 근위 사이토 카인 신호에 따라 여러 가지 염증 과정의 경우입니다. 혼합 C에서ultures 물리적 상호 작용을 피할 수 있고 불가능 변경된 결과를 얻을 수있는 세포 - 세포 접촉의 부재 분비 통신 연구를 만든다. 한편, 혼합 집단 내에서 세포의 특정 해석을 달성하기 위해서는 상당히 결과에 미치는 영향을 거친 분리 기술의 사용없이 실행할 수 없게된다. 이러한 중요한 문제를 해결하기 위해, 조정 배지를 사용 실형 문화 분비 신호 전달 연구를 허용하는 기술이 개발되고있다. 이 방법은 세포의 다른 집단을 함유 한 웰 세포 유형, 따라서 에어컨 명명 된 배지 상등액의 전송을 요구한다. 그러나 중요한 단점은 단명 한 분자가 셀의 두번째 집단의 웰에 전송되는 조정 된 배지에서 충분히 생존하지 않는다는 것이다. 심지어 수명이 긴 분자는 크게 인해 확산에 시간이 지남에 희석됩니다. 또한, 두 세포인구는 단방향 통신 분비보다는 활성 쌍방향 통신에 참여한다. 이것은 그들이 체내에 존재하는 정확한 다세포 관계를 재현에서 중요한 피드백 신호의 부재로 이끈다. 결과적으로 더 나은 관내 셀룰러 환경에서의 생체 내 조건에서 일본어를 시뮬레이션 할 필요성에 의해 구동 세포 배양 기술의 여러 발전은 수년 동안 실현되어왔다. 가장 중요한 발전 중 하나는 1953 년 Grobstein 의해 처음 사용 된 세포 배양을 구획화를위한 미세 다공성 막과 투과성 지지체의 사용이었다 1. 이러한 투과성 지지체는 다수의 세포 유형을 수용하고 사용하기 년간 맞추어왔다 여러 가지 응용 프로그램입니다. 현재, 이러한 지원은 멀티 웰 조직 배양 접시에서 또는 새로운 Circu에 우물에서 휴식을 설계 속이 빈 삽입 존재LAR 요리. 공동 배양 시스템에서, 삽입이 잘 반면, 하나의 셀 유형을 포함하거나 요리는 체액 환경 (그림 1)에 세포의 서로 다른 두 집단의 기여를 연구 할 수 있도록, 다른 세포 인구를 포함한다. 그 결과, (혀끝의 분비 또는 신호 수신 대 기저) 세포 극성 따라서 혼합 문화와 에어컨 매체 기술을 통해 삽입 공동 문화 시스템에게 중요한 이점을 부여, 보존됩니다. 멤브레인 재료의 몇 가지 유형이 사용할 수있는 가장 일반적인 것 인 폴리 에스테르 (PET), 폴리 카보네이트 (PC) 또는 콜라겐 코팅 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)가 0.4 μm의 12.0 ㎛의 범위의 상이한 기공 크기에 존재. 재료 및 기공 크기의이 품종에 한정되지 사용하는 다음에 대해 서로 다른 수준에서 그들을 실용적 광학 특성, 막 두께 및 세포 부착과 관련된 변수 기능을 발휘 삽입의 스펙트럼을 제공합니다 : -studying세포 분화, 배아 발달, 종양 전이 및 투과 막을 통해 chemotaxic 분석에 의해 상처 수리; 상피 또는 내피 단일 층을 통해 전송을 평가하여 약물의 침투를 -evaluating은 투과성 지원에 배양하고; -performing 세포 공동 배양은 세포 - 세포 접촉이없는 수용성 분비 인자에 의해 유도 된 세포 변조 동작을 분석한다. 이 문서의 목적은 삽입 공 배양 시스템을 이용한 세포 - 세포 접촉이없는 분비 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가하는 상술 한 제 기능을 수행하기 위해 일반적인 방법론 지침을 설명하는 것이다. 연구의 여러 다른 필드는 세포 집단에서 분비 된 가용성 인자의 영향에 관련된 질문에 대답하기 위해 삽입 공 배양 시스템을 사용한다. 다양한 수준에서 세포 행동을 조절 실제로 분비 신호는 모든 조직에서 관련입니다및 삽입 공 배양 시스템을 만드는 시스템은이 분야의 발전을 위해 불가결. 반대로, 그 신호 전달을 확인할 수있는 인서트의 사용은 직접 세포 - 세포 접촉이 아닌 분비 요인이다. 인서트의 가장 중요한 용도 중 하나는 분비 된 사이토 카인의 효과는 다양한 면역 세포에서 평가되는 플레이어 염증 연구 2-14이다. 특히, 중추 신경계 (CNS) 염증의 연구는 더 크게 신경 염증 15-21 구동 뉴런 및 미세 아교 세포의 분비 독특한 역할을 정의 할 수있는 삽입 공 배양 과정에서 이익이있다. 이러한 시스템은 또한 감소 시키거나 염증성 인자 22-26의 분비를 억제하는 능력에 의존하여 분자의 항 염증 가능성을 연구하기 위해 고안되었다. 연구 메커니즘, 특히 암 27-31 관련된 혈관 32-34과 inflammati의 기초종양의 35-42에, 또한 삽입 공동 문화 시스템에서 도움이됩니다. 또한, 수용성 요소는 분화와 여러 연구가 특정 필드 43-50에서 질문에 답 삽입을 사용한 구동 과정에서 가장 중요하다. 중추 신경계에서 신경 조직으로 보는 것은 매우 제한된 갱신 전위 neurotrophism 연구를 가지며, 신경은 근본적인 널리 공존 배양 시스템 51-56 줄기 세포의 사용에 의해 확보되어왔다. 또한, 삽입은 신장 57, 58, 내피 상호 작용과 혈관 신생 59-62, 세포 사멸 비만과 대사 증후군 22,23,66-67에 63 ~ 65, 염증 신호, 내이 머리 세포 보호 등 다양한 분야에 활용된다 68,69, 심지어 곰팡이 독성 (70, 71) 및 기생충학 72, 73입니다. 이 문서에서는 experim을 설정하기 위해 일반적인 방법 론적 지침을 제공합니다삽입 공 배양 시스템을 사용하여 분비 된 가용성 인자에 의해 매개되는 세포 변화를 평가보기 이비인후과. 특히, 우리는 신경 세포의 공동 문화와 신경 염증성 과정을 공부하고 자신의 용도에 우리의 관심을 초점을 맞출 것이다. 파일럿을 가능하게 삽입 실험의 매우 넓은 스펙트럼을 감안할 때,이 세포 배양 기술의 모든 측면을 다루 견딜 수있다. 예를 들어, 특정 프로토콜은 삽입 공 배양 방법의 구체적인 이해를 제공하는 상세하게 설명 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 분비되는 사이토 카인의 효과 PC12 신경 세포에 대한 N9의 미세 아교 세포를 부활 측정.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&amp;ndash;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from&amp;nbsp;Escherichia coli&amp;nbsp;055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Cell culture inserts for use with 24-well plates</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Coat with collagen before use</td></tr><tr><td>Routine PC12 cell culture medium</td><td></td><td></td><td>Routine N9 cell culture medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 85% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 90% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 differentiation medium</td><td></td><td></td><td>N9 treatment medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 50 ng/mL nerve growth factor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 treatment medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

삽입 공 배양 시스템의 사용은 CNS의 다른 세포 분비 플레이어 사이의 관계를 보여주는 신경 염증성 과정의 연구에 특히 적절하다. 중추 신경계에서 면역은 휴식 분지의 상태 (그림 2A)에서 자신의 환경을 모니터링하고 감지 방해 할 수있는 미세 아교 세포라는 거주자 세포에 의해 주로 수행되는 수 문제가 적절한 신경 기능 76-78에 필요한 매우 귀중한 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact at JoVE.com

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K 조회수.  University of Québec. In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

비디오: Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

연구

암 연구학

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

생체공학

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between colorectal tumor cells and the immune system. Colorectal carcinoma is among the most common type of cancer, typically treated by surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Advantages of radiotherapy in targeting the tumor are well known. However, even limited exposures of healthy tissues are of great concern, particularly regarding the effects on the intestinal barrier and the immune system. The adopted setup allows to study the interplay between two cell populations in a condition more similar to the physiological one, when compared to normal cell cultures. For this purpose, we resort to different techniques and we used an in vitro co-culture model, based on Caco-2 cells differentiated as a monolayer and PBMC, sharing the same culture medium. This protocol has been developed to focus on both macroscopic effects, i.e. cell viability and Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER), and, through western blot, molecular alterations, i.e. the activation of inflammatory pathway in immune cells and the tight junction protein expression in Caco-2 cells. Initial evaluation of radiation effects on Caco-2 cell viability was assessed via the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan blue assays, while TEER was measured at fixed time intervals through an ohmmeter specifically designed for co-culture systems. In this way, the effects due to radiation, the presence of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), and eventually their synergistic effect, can be demonstrated. Through these complementary techniques, we observed a high radio-resistance of Caco-2 within the range of 2 - 10 Gy of X-rays and an increased Caco-2 monolayer permeability when PBMCs were added. In particular, PBMC presence was found to be associated with the variation in the tight junction scaffold proteins expression.

We present a protocol to investigate the crosstalk between X-ray-irradiated Caco-2 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The protocol starts with Caco-2 irradiation and set-up of the co-culture with PBMC; subsequently, trans-epithelial electrical resistance is measured regularly over 48 h and western blot performed in both Caco-2 and PBMC.

X-선 사이 누화를 조사 하는 공동 문화 방법을 반구 Caco-2 셀 및 PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

면역학 및 감염병학

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

신경과학

<meta charset="utf8"></head><body>상피 세포와 섬유아세포 세포를 위한 첨단 2층 3D 공동 배양 시스템

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: PVA-PCL 나노섬유막을 사용한 3D 공동배양 시스템 발전

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

간단한 2D 및 3D 세포 배양이 가능하도록 설계된 혁신적인 3D 프린팅 인서트

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

듀얼에 대 한 생체 모방 지하실 멤브레인으로 ultrathin Porated 탄성 Hydrogels 세포 배양

X-선 사이 누화를 조사 하는 공동 문화 방법을 반구 Caco-2 셀 및 PBMC

미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

나노섬유막(Nanofibrous membranes)을 이용한 상피세포의 3차원 공동배양 모듈 구축

간단한 2D 및 3D 세포 배양이 가능하도록 설계된 혁신적인 3D 프린팅 인서트