This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

NB: Chacune des étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire tel que requis pour la culture cellulaire de mammifère. En outre, les lignes directrices générales pour la culture optimale des cellules stériles appliquent, par exemple., En écartant des conseils chaque fois qu&#39;ils peuvent conduire à la contamination croisée, ce qui réduit la quantité de cellules de temps sont exposés à l&#39;air lors de l&#39; exécution des changements de médias entiers, correctement , mais en remuant doucement tout suspensions cellulaires pour assurer leur pipetage homogène, etc. de plus, les inserts sont une sorte de plasticware qui nécessitent un traitement spécial. Tout d&#39;abord, chaque fois que les inserts sont manipulés, évitez de toucher la membrane fragile, qui se déchire facilement et pourrait donc compromettre l&#39;expérience. En outre, il ne convient pas pour effectuer l&#39;aspiration du milieu de culture cellulaire, car il existe un risque de perforation de la membrane ou dissociant les cellules adhérentes. Ensuite, inserts pendre dans la plaque de culture tissulaire multipuits et, par conséquent, la prudence doit être employée lorsque moVing l&#39;plasticware ou lors du pipetage pour éviter dissociant des cellules adhérentes. En outre, quand on utilise des inserts avec de grandes tailles de pores, il est possible que le milieu de culture cellulaire suinte à travers la membrane et, par conséquent, il est important de contrôler fréquemment le niveau de liquide. Enfin, notez que le protocole suivant est conçu pour les cellules adhérentes et nécessite des modifications mineures afin d&#39;être adapté pour des cellules en suspension. 1. Lignes directrices générales pour la conduite insertion des expériences de co-culture <ol><li> Semis type de cellule n ° 1 à inserts <ol><li> Déballer les inserts de leur emballage. </li><li> Placer les inserts dans un multipuits plaque de culture de tissu vide de la bonne dimension. Pour ce faire, saisir le bord supérieur de l&#39;insert en utilisant des pinces. </li><li> Pour améliorer la fixation et la propagation des cellules adhérentes, conditionner les plaquettes avec un milieu de culture cellulaire avant l&#39;ensemencement. Pour ce faire, couvrir toute la surface de la membrane avec culture cellulaire medium à l&#39;aide d&#39;une micropipette. NOTE: Pour ce faire, pour autant inserts au besoin. </li><li> Replacer le couvercle sur la plaque et incuber pendant au moins 1 heure ou O / N dans les mêmes conditions (généralement 37 ° C, 5 à 10% de CO 2). </li><li> Lorsque les inserts sont conditionnés, retirer la totalité du milieu de culture cellulaire en utilisant une micropipette. Jeter le moyen utilisé. </li><li> Graine type cellulaire # 1 dans du milieu frais de culture cellulaire de la même manière que dans une plaque multipuits. Pour ce faire, tirer un volume approprié de la suspension cellulaire avec une micropipette et distribuer le liquide dans l&#39;insert. NOTE: Préparer autant inserts au besoin. </li><li> Après l&#39;ensemencement tous les inserts, secouez légèrement la plaque à gauche et à droite, puis en arrière afin de répartir les cellules uniformément. Évitez de faire des mouvements circulaires, car cela provoquerait des cellules d&#39;accumuler dans le centre des inserts. </li><li> Placer le couvercle sur la plaque et incuber comme indiqué par conformément aux exigences cellulaires (habituellement 37 ° C, 5-10% de CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Semis type de cellule n ° 2 dans des plaques de culture tissulaire multipuits <ol><li> Seed type de cellule # 2 dans un milieu de culture cellulaire frais conformément à la section 1. </li><li> Préparer autant de puits selon les besoins pour le nombre d&#39;insertions. Balancer la plaque comme dans l&#39;étape 1.1.7) pour faire en sorte que les cellules sont réparties de façon uniforme dans les puits. </li><li> Placer le couvercle sur la plaque et incuber dans les mêmes conditions (généralement 37 ° C, 5 à 10% de CO 2). </li></ol></li><li> moyen Rafraîchissant dans des inserts <ol><li> À l&#39;aide d&#39;une micropipette, retirer une partie ou la totalité du milieu de culture cellulaire, dans les inserts contenant du type de cellule n ° 1. Jeter le moyen utilisé. </li><li> Dessinez un volume approprié de milieu de culture de cellules fraîches. reposer doucement la pointe sur la paroi interne de l&#39;insert et passer lentement le milieu de culture cellulaire. </li><li> Placez le couvercle sur la plaque et incuber comme à l&#39;étape 1.1.4. </li></ol></li><li> moyen Rafraîchissant dans des plaques de culture tissulaire multipuits <ol><li> En utilisant un Micropipette, retirer une partie ou la totalité du milieu de culture cellulaire dans les puits contenant des cellules de type N ° 2. Jeter le moyen utilisé. </li><li> Dessinez un volume approprié de milieu de culture de cellules fraîches. Reste la pointe sur la paroi intérieure du puits et distribuer lentement le milieu de culture cellulaire. </li><li> Placer le couvercle sur la plaque et incuber selon les protocoles de culture de cellules préalablement établies. </li></ol></li><li> Transférer des inserts contenant le type de la cellule n ° 1 sur des plaques de culture tissulaire multipuits contenant du type de cellule # 2. REMARQUE: Effectuez cette étape lorsque les deux types de cellules ont atteint le stade de croissance approprié. <ol><li> Avant de transférer les inserts dans les puits, apporter des modifications moyennes nécessaires, comme décrit précédemment dans les étapes 1.3) et 1.4). NOTE: A ce stade, il est important de distribuer les volumes appropriés de médias dans les deux compartiments tel que spécifié par les instructions du fabricant d&#39;insertion. </li><li> En utilisant des pinces, saisir le bord supérieur d&#39;un insert contenant des cellules Type # 1 et placez-le doucement dans le puits approprié contenant un type de cellule 2 #. </li><li> Après le transfert de tous les inserts, vérifier la présence de bulles d&#39;air sous la membrane des inserts. NOTE: Les bulles d&#39;air empêchent tout échange à travers la membrane de l&#39;insert et peuvent mettre en péril l&#39;ensemble de l&#39;expérience. </li><li> Si des bulles d&#39;air sont présentes, soulever très doucement l&#39;insert des puits à l&#39;aide de pinces et de replonger dans le milieu de culture cellulaire. Les bulles vont disparaître. Si elles sont encore présentes, essayez doucement plongeant inserts retour dans le milieu de culture cellulaire à un angle. NOTE: Ne pas frapper ou remuer des inserts pour éviter dissociant des cellules adhérentes. </li><li> Après avoir retiré toutes les bulles d&#39;air et de vérifier que les volumes des médias dans les deux compartiments, placez le couvercle sur la plaque et incuber. </li></ol></li><li> médias rafraîchissantes dans un système de co-culture NOTE: Bien que la membrane permet facilement les échanges de médias entre l&#39;insert et le bien, rafraîchissant le moyen se fait enles deux compartiments puisque le temps nécessaire pour atteindre l&#39;équilibre dans les compartiments supérieur et inférieur par diffusion seul peut être assez long. <ol><li> moyen Rafraîchissant dans des inserts contenant type de cellule # 1 se fait de la même manière que dans l&#39;étape 1.3). </li><li> Pour rafraîchir dans les puits contenant type de cellule # 2 moyen, faites glisser doucement l&#39;insert sur le côté pour créer un espace suffisamment large pour accueillir une pointe de pipette. Actualiser le moyen comme à l&#39;étape 1.4). </li><li> Vérifier la présence de bulles d&#39;air et vérifier les volumes que par étapes 1.5.3) par 1.5.5). </li></ol></li></ol> Exemple 2: mesurer les effets des cytokines sécrétées par les cellules microgliales activées par le LPS N9 sur les cellules PC12 neuronales REMARQUE: Les étapes suivantes sont conçues pour flacon spécifique, bien et tailles plat. Toutefois, le protocole peut être personnalisé pour toutes les dimensions de plasticware. Pour les médias et la composition voir tableau Matériaux. <ol><li> Ensemencement et la différenciation des cellules PC12 en multides plaques de culture tissulaire <ol><li> Milieu de culture cellulaire PC12 routine chaud, PC12 milieu de différenciation et de la trypsine-EDTA dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Utiliser les cellules PC12 à 60-80% de confluence d&#39;un 2 flacon de 75 cm. </li><li> 15 mm avec une pipette Pasteur, effectuer l&#39;aspiration de la totalité du milieu de culture cellulaire dans le flacon. </li><li> Rincer délicatement la monocouche cellulaire avec 5 ml de tampon phosphate salin stérile et éliminer le liquide avec une pipette Pasteur. Veillez à ne pas dissocier les cellules à cette étape. </li><li> Recouvrir la monocouche de cellules avec 3 ml de trypsine-EDTA et laisser incuber pendant 2-3 minutes à 37 ° C. </li><li> Veiller à ce que toutes les cellules sont décollées sous un microscope. Si très peu de cellules sont flottantes, incuber pendant une période plus longue pour un maximum de 5 min. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules PC12 de routine afin d&#39;inactiver la trypsine-EDTA. </li><li> Avec une pipette de 10 ml, triturer doucement tout en veillant à ce que la plupart des cellules sont dissociées du fond of flacon. Évitez de créer des bulles d&#39;air dans la suspension cellulaire. </li><li> Avec la même pipette de 10 ml, transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugation de 50 ml. </li><li> Centrifuger pendant 1 min à 3.200 xg </li><li> Jeter le surnageant avec une pipette Pasteur tout en prenant soin de ne pas perturber le culot. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu de culture de cellules PC12 routine avec une pipette de 10 ml. NOTE: Ce volume peut être ajusté si le culot est anormalement petite ou grande. </li><li> Triturer avec la même pipette de 10 ml pour homogénéiser la pastille. Les cellules PC12 agglutiner souvent ensemble pour au moins 20 pipetage et downare nécessaire. NOTE: Bien que trituration vigoureuse est nécessaire, éviter de créer des bulles d&#39;air dans la suspension cellulaire. </li><li> Dans un tube de 1,5 ml, préparer une dilution appropriée de la suspension cellulaire en bleu trypan. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre selon des protocoles établis précédemment 74. </li><li> Dans un tube de 50 ml séparée, séparer la suspension cellulaireavec un milieu de différenciation PC12 pour obtenir une suspension cellulaire diluée appropriée pour l&#39; ensemencement des puits d&#39;une plaque à 24 puits (30 000 ¢ / cm2, 0,6 ml par puits selon le protocole du fabricant). NOTE: La plaque de 24 puits doit être préalablement revêtu avec du collagène tel que spécifié par des protocoles déjà établis 75. </li><li> Distribuer 0,6 ml de la suspension cellulaire par puits à l&#39;aide d&#39;une micropipette. </li><li> Lorsque tous les puits sont ensemencées, la roche la plaque comme à l&#39;étape 1.1.7). </li><li> Pour permettre une bonne différenciation des cellules PC12, incuber les plaques à 24 puits pendant 7-9 jours à 37 ° C en atmosphère humide 5% de CO2 dans un milieu de différenciation CP12 15,16 avant d&#39; effectuer des expériences de co-culture. </li><li> Effectuer des changements de milieu tous les deux jours en enlevant la moitié du liquide et en le remplaçant par un volume égal de milieu de différenciation PC12 frais. </li></ol></li><li> Ensemencement microglie N9 dans les inserts et le traitement avec le LPS <ol><li> Un jour avant d&#39;effectuer les expériences de co-culture, pré-traiter PTFE 0,4 inserts um-pores avec un milieu de culture cellulaire de routine N9 pour optimiser l&#39;adhérence des cellules, en suivant les étapes 1.1.1) par le biais de 1.1.4) </li><li> N9 milieu chaud routine de culture cellulaire et de la trypsine-EDTA dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Pendant ce temps, peser environ 10 mg de LPS dans un tube de 1,5 ml pour une utilisation ultérieure. NOTE: Depuis LPS est une endotoxine pro-inflammatoire puissant et exige des précautions particulières de sécurité, des lunettes, des gants et un respirateur de particules sont fortement recommandés. </li><li> Utiliser des cellules N9 à 80-90% de confluence d&#39;un 2 flacon de 75 cm. </li><li> Suivez les étapes 2.1.3) à 2.1.14). Toujours utiliser la routine du milieu de culture cellulaire N9 à la place du milieu de culture des cellules PC12 de routine. A noter également que la microglie N9 n&#39;agglutinent pas ensemble autant que les cellules PC12 font, donc moins pipetage de haut en bas peut être nécessaire à l&#39;étape 2.1.13). </li><li> Dans un tube de 50 ml séparée, séparer la suspension cellulaire avec un milieu de culture cellulaire à N9 obtenir une suspension cellulaire diluée appropriée pour l&#39; ensemencement des inserts destinés à contenir dans des plaques à 24 puits (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml par insert selon le protocole du fabricant, pour la membrane de surface voir les informations du fabricant). NOTE: Ces inserts sont déjà revêtus de collagène par le fabricant et sont optimisés pour l&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Distribuer 0,05 ml de la suspension cellulaire par insertion à l&#39;aide d&#39;une micropipette. </li><li> Lorsque tous les inserts sont ensemencées, basculez la plaque comme à l&#39;étape 1.1.7). </li><li> Effectuer des dilutions en série de LPS en utilisant un milieu de traitement N9 pour obtenir 4 pg / ml, 2 pg / ml et / ml de solutions de travail 1 ug. </li><li> Pipette 0,05 ml de la / ml solution de travail 4 pg dans l&#39;un de l&#39;ensemble des inserts afin de produire une dilution finale de 2 pg / ml. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.2.10) pour les deux autres solutions de travail dans différents inserts ensembles, ce qui donne des dilutions finales de 1 pg / ml et 0,5 pg / ml, respectivement. </li><li> Danscubate les plaques contenant les inserts de 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% d&#39; humidité pour permettre l&#39; activation des microglies N9 avec du LPS avant d&#39; effectuer les expériences de co-culture. </li></ol></li><li> Co-culture de cellules PC12 neuronales avec microglie N9 <ol><li> 7-9 jours de différenciation des cellules PC12, activer les microglies N9 après 24 heures d&#39;incubation avec du LPS par un milieu de traitement chaud et N9 milieu de traitement PC12 dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Effectuer un changement de milieu total des microglies N9 comme dans l&#39;étape 1.3), le remplacement de la totalité du support utilisé par 0,1 ml de milieu de traitement N9. Pour ce faire, pour chaque insert.This est nécessaire pour éliminer toute trace de LPS, laissant microglie N9 seulement activés dans les inserts. </li><li> Effectuer un changement de milieu total des cellules PC12 neuronales comme dans l&#39;étape 1.4). Transférer les inserts dans les plaques à 24 puits comme dans l&#39; étape 1.5) .Incubate la N9-PC12 co-cultures pendant 24 heures ou 48 heures à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% humide. </li><li> après 24h ou 48 h, récolte le surnageant et / ou les cellules pour la cytotoxicité, dosage immuno-enzymatique (ELISA), Western blot, ou d&#39;autres essais. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;étape la plus critique de toute expérience du système insert co-culture réside effectivement dans le choix de l&#39;insert approprié à utiliser. La taille des pores et le matériau de la membrane doivent être prises en compte en profondeur, sans oublier de considérer le type de cellules qui seront ensemencées et le but de l&#39;expérience. Par exemple, des dosages chimiotactiques peuvent utiliser le même type de membrane que les co-cultures cellulaires pour analyser les modulations du comportement cellu...

L&#39;étude des tissus, des organes ou des systèmes in vitro est un essai de simplifier les relations complexes qui existent entre les sous - types cellulaires différents qui comprennent des organismes multicellulaires. En effet, des études in vitro permettent d&#39;acquérir une compréhension détaillée des populations de cellules isolées. Il y a deux principaux avantages de la conduite des expériences in vitro: 1) réduit les interactions cellulaires, et 2) la capacité de manipuler facilement l&#39;environnement cellulaire. Par conséquent, ces deux avantages ont permis aux scientifiques de prédire le comportement des types cellulaires spécifiques in vivo, conduisant à la capacité de réguler les résultats des influences extrinsèques dans des organismes entiers. En ce sens, la culture in vitro de cellules dans fonctionne souvent comme un pont reliant les sciences fondamentales et appliquées vie. Néanmoins, il y a aussi plusieurs inconvénients du travail in vitro, le plus important étant qu&#39;une certaine réserve peut demeurer dans le physiologiqueal pertinence des phénotypes observés. En effet, quand un seul type de cellule est cultivée dans un récipient, la culture perd, à des degrés divers, ses connexions cellule-cellule avec d&#39;autres types de cellules, sa contribution à l&#39;environnement humorale du tissu et de l&#39;organisme d&#39;origine, et les ancres au sein le tissu qui lui a permis de faire respecter une structure tridimensionnelle particulière, parfois crucial pour la fonction cellulaire. La question des relations cellule-cellule a été adressée par le développement des techniques de culture mixtes. Dans ce procédé, deux ou plusieurs populations de cellules sont cultivées dans le même récipient de culture. Cependant, ces cultures mixtes portent des inconvénients importants. D&#39;une part, certains sous-types de cellules n&#39;interagissent pas physiquement avec l&#39;autre dans le tissu d&#39;origine et reposent uniquement sur les communications paracrines soutenues par des facteurs solubles sécrétés et récepteurs à proximité. Tel est le cas pour plusieurs processus inflammatoires qui dépendent de la signalisation des cytokines proximale. Dans mixte cULTURES, les interactions physiques sont inévitables et il est impossible d&#39;étudier les communications paracrines en l&#39;absence de contacts cellule-cellule qui peut donner des résultats modifiés. D&#39;autre part, la réalisation des interprétations spécifiques de cellules à partir d&#39;une population mixte devient impossible sans l&#39;utilisation de techniques de séparation difficiles qui pourraient affecter de manière significative les résultats. Pour résoudre ces questions importantes, l&#39;utilisation des médias conditionnés a été développé comme une technique permettant des cultures compartimentées et l&#39;étude de la signalisation paracrine. Cette méthode nécessite le transfert du surnageant d&#39;un type de cellule, le milieu conditionné ainsi nommé, aux puits contenant une autre population de cellules. Mais un inconvénient important est que les molécules de courte durée ne survivent pas assez longtemps dans le milieu conditionné à être transféré dans les puits de la seconde population de cellules. Même les molécules longue durée de vie sera grandement dilué au fil du temps en raison de la diffusion. En outre, les deux cellulespopulations ne participent à la communication paracrine unidirectionnel plutôt que dans une communication bidirectionnelle active. Cela conduit à l&#39;absence de signaux de rétroaction qui est essentielle pour recréer les relations exactes pluricellulaires tels qu&#39;ils existent in vivo. En conséquence , et entraînée par la nécessité de mieux simuler l&#39;original dans des conditions in vivo dans l&#39;environnement cellulaire in vitro, de nombreux progrès dans les techniques de culture cellulaire ont été réalisées au cours des années. L&#39; un des progrès les plus significatifs a été l&#39;utilisation de supports perméables avec des membranes microporeuses pour compartimenter des cultures de cellules, utilisées pour la première fois par Grobstein en 1953 1. De tels supports perméables ont été adaptés au fil des ans pour accueillir de nombreux types de cellules et à utiliser dans plusieurs applications différentes. Aujourd&#39;hui, ces supports existent comme des inserts creux qui sont conçus pour reposer dans les puits d&#39;une plaque de culture tissulaire multipuits ou circuplats lar. Dans un système de co-culture, l&#39;insert contient un type de cellule tandis que le puits ou l&#39;autre plat contient population cellulaire, ce qui permet d&#39;étudier la contribution de deux populations différentes de cellules de leur environnement humorale (figure 1). En conséquence, la polarité cellulaire (basolatérale ou apicale contre la sécrétion réception du signal) est conservé, ce qui confère ainsi des systèmes de co-culture insérer un avantage important par rapport aux cultures mixtes et des techniques milieu conditionné. Plusieurs types de matériaux de membrane sont disponibles, les plus courantes étant du polyester (PET), le polycarbonate (PC) ou du collagène revêtu de polytétrafluoroéthylène (PTFE), et ils existent en différentes tailles de pores allant de 0,4 um à 12,0 um. Ces variétés de matériaux et de tailles des pores offrent un spectre d&#39;inserts exerçant des caractéristiques variables pertinentes aux propriétés optiques, l&#39;épaisseur de la membrane et l&#39;adhérence des cellules qui les rendent pratiques à différents niveaux pour les utilisations suivantes sans s&#39;y limiter: -étudierla différenciation cellulaire, le développement embryonnaire, la métastase tumorale et la réparation des plaies par des dosages chimiotactiques à travers des membranes perméables; -evaluating la pénétration du médicament en évaluant leur transport à travers des monocouches épithéliales ou endothéliales cultivées sur des supports perméables, et; cellules co-cultures -Exécution pour analyser les modulations du comportement cellulaire induite par des facteurs solubles sécrétés en l&#39;absence de contact cellule-cellule. Le but de cet article est de décrire les lignes directrices méthodologiques générales pour remplir la troisième fonction indiquée ci-dessus, qui est d&#39;évaluer les changements cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en l&#39;absence de contact cellule-cellule en utilisant un système de co-culture insert. Plusieurs domaines de recherche différents utilisent des systèmes insert de co-culture, afin de répondre à des questions pertinentes à l&#39;effet de facteurs solubles sécrétés sur les populations de cellules. En effet, la signalisation paracrine qui module le comportement cellulaire à différents niveaux est pertinent dans tous les tissuset les systèmes, ce qui rend les systèmes de co-culture insertion indispensable pour assurer des progrès dans ces domaines. A l&#39;inverse, l&#39;utilisation d&#39;inserts peut confirmer que la transduction du signal se fait par le contact direct de cellule à cellule, et non par des facteurs sécrétés. L&#39; une des utilisations les plus importantes des inserts est dans les études de l&#39; inflammation 2-14 où l&#39;effet de cytokines sécrétées est évaluée à différents acteurs cellulaires de l&#39; immunité. En particulier, l&#39;étude de l&#39; inflammation dans le système nerveux central (SNC) a grandement profité des études insert de co-culture, qui ont permis de mieux définir les rôles paracrines distincts de neurones et les microglies dans neuroinflammation 15-21 conduite. Ces systèmes ont été conçus aussi pour étudier le potentiel anti-inflammatoire des molécules repose sur leur capacité à réduire ou à inhiber la sécrétion de facteurs pro-inflammatoires 22-26. La recherche portant sur ​​le cancer 27-31, en ​​particulier les mécanismes sous - jacents de l&#39; angiogenèse 32-34 et inflammatisur 35-42 dans la tumorigenèse, bénéficie également de systèmes insert de co-culture. En outre, des facteurs solubles sont de première importance dans les processus qui conduisent la différenciation et plusieurs études ont utilisé des inserts pour répondre aux questions dans ce domaine particulier 43-50. Dans le SNC, car le tissu neural possède un potentiel de renouvellement très limité, l&#39;étude de la neuroprotection et neurotrophism est fondamental et a été largement assurée par l&#39;utilisation de cellules souches dans des systèmes de co-culture 51-56. En outre, les inserts sont également utilisés dans les domaines aussi variés que la néphrologie 57,58, les interactions endothéliales et l&#39; angiogénèse 59-62, 63-65 signalisation de l&#39; apoptose, l&#39; inflammation dans l&#39; obésité et le syndrome métabolique 22,23,66-67, l&#39; oreille interne de protection des cellules ciliées 68,69, et même dans la virulence des champignons 70,71 et parasitologie 72,73. Cet article propose des lignes directrices méthodologiques générales afin de mettre en place un expériment en vue d&#39;évaluer les modifications cellulaires médiées par des facteurs solubles sécrétés en utilisant un système de co-culture insert. En particulier, nous allons nous concentrer notre attention sur cellules nerveuses co-cultures et leurs utilisations dans l&#39;étude de processus de neuroinflammatoire. Compte tenu de la très vaste éventail d&#39;expériences qui insère permettre au pilote, il est insupportable pour couvrir tous les aspects de cette technique de culture cellulaire. A titre d&#39;exemple, un protocole spécifique pour mesurer les effets des cytokines sécrétées par le lipopolysaccharide (LPS) -activated microglie N9 sur les cellules PC12 neuronales seront détaillées, offrant une compréhension concrète de la méthodologie insert co-culture.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="750">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R8755</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:232px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6421</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">30-2040</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;">MultiCell</td>
			<td style="width:119px;">80350</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:232px;">Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N0513</td>
			<td style="width:328px;">Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&#8211;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td style="width:328px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Lipopolysaccharides from&#160;Escherichia coli&#160;055:B5</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2880</td>
			<td style="width:328px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Cell culture inserts for use with 24-well plates</td>
			<td style="width:71px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353095</td>
			<td style="width:328px;">0.4 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">24-well plates</td>
			<td style="width:71px;">TrueLine</td>
			<td style="width:119px;">TR5002</td>
			<td style="width:328px;">Coat with collagen before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Routine PC12 cell culture medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Routine N9 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 85% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 90% DMEM-F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% heat-inactivated horse serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10% heat-inactivated horse serum</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC12 differentiation medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>N9 treatment medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% DMEM-F12 medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated horse serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 50 ng/mL nerve growth factor</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC12 treatment medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 99% RPMI medium</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

L&#39;utilisation de systèmes de co-culture insert est particulièrement pertinente dans l&#39;étude des processus neuro-inflammatoires qui mettent en valeur les relations paracrines entre les différents acteurs cellulaires du système nerveux central. Immunité dans le SNC est réalisée principalement par les cellules résidentes appelées microglies qui surveillent leur environnement dans leur état ​​de repos ramifiées (Figure 2A) et sont capables de perturba...

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Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Développement d&#39;un système d&#39;insertion Co-culture de deux types cellulaires en l&#39;absence de Cell-Cell Contactez

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Research

JoVE Journal

Biology

27.7K vues.  University of Québec. In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Vidéo: Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Recherche

Biologie

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

Fabrication et fonctionnement d&#39;un insert d&#39;oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualisation des Caenorhabditis elegans</emOuvrages cuticules> Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de culture à étudier la thyroïde développement

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Développement d'un système d'insertion Co-culture de deux types cellulaires en l'absence de Cell-Cell Contactez

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Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l'analyse du contenu haute de la neurotoxicité

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Fabrication et fonctionnement d'un insert d'oxygène pour les adhérents des cultures cellulaires

Visualisation des Caenorhabditis elegans Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

Deux types de tests pour la chimio-attraction Frog sperme Détection

Un système d'

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d'embryons sans sérum

Un

Mise en place d’un pH extracellulaire acide système de Culture