Name: development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
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This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

NB：哺乳動物細胞培養のために必要に応じて、以下のステップの各々は、層流フード内で無菌条件下で実施すべきです。また、最適な滅菌細胞培養のための一般的なガイドラインは、適用例 、ヒントいつでも彼らは、交差汚染につながる時間細胞の量を減らすことができるの破棄正しく、メディア全体の変更を行うことなく、静かにすべての攪拌時に空気にさらされていますその均質なピペッティングなどを確保するために細胞懸濁液はまた、インサートは特別な処理を必要とするプラスチック製品の一種です。インサートが操作されたときにまず、簡単に涙ため、実験を危険にさらす可能性が脆弱な膜を、触れないように注意してください。膜を穿孔または接着細胞を解離の危険性があるとしても、細胞培養培地の真空吸引を行うためには適していません。次に、インサートは、マルチウェル組織培養プレートに緩くハングし、したがって、注意が時カ月使用しなければなりませんプラスチック製品をヴィングまたは接着細胞を解離避けるためにピペッティングするとき。大細孔サイズのインサートを使用する場合に加えて、細胞培養培地は、したがって、しばしば液体のレベルを監視することが重要であり、膜を通って浸透し、可能性があります。最後に、以下のプロトコルは、接着細胞用に設計されており、浮遊細胞に適したものにするために若干の変更を必要としていることに注意してください。 インサート共培養実験を行うための1.一般的なガイドライン<ol><li>挿入中の播種細胞型の第1位<ol><li>その梱包からの挿入をアンラップ。 </li><li>適切な大きさの空のマルチウェル組織培養プレートにインサートを配置します。これを行うには、グリップピンセットを用いて、インサートの最上端を。 </li><li>付着細胞の付着及び拡散を向上させるために、播種前に細胞培養培地でインサートを条件付けます。そうするために、細胞培養mediu有する膜の表面全体を覆​​いますマイクロピペットを用いてメートル。 注：必要な数の挿入のためにこれを行います。 </li><li>プレートに蓋を交換し、同じ条件下で、少なくとも1時間またはO / Nインキュベート（通常37℃、5〜10％CO 2）。 </li><li>インサートが調整されるときに、マイクロピペットを用いて細胞培養培地の全てを除去します。使用した培地を捨てます。 </li><li>マルチウェルプレートと同様に、新鮮な細胞培養培地中の種子の細胞型＃1。そうするために、マイクロピペットを用いて細胞懸濁液の適切な量を描き、インサート中の液体を分注します。 注：必要な数の挿入を準備します。 </li><li>すべての挿入を播種した後、静かに細胞を均一に分配するために、次に前後に、左右のプレートを揺らし。これは、細胞がインサートの中心部に蓄積する原因となりますよう、円運動を行わないでください。 </li><li>携帯要件（通常37℃、5〜10％CO通りで指定された板の上に蓋を置き、インキュベート<sub&gt;の2）。 </li></ol></li><li>マルチウェル組織培養プレート中に播種細胞型＃2 <ol><li>項1に記載の新鮮な細胞培養培地中の種の細胞型＃2。 </li><li>挿入の数のために必要な数のウェルを準備します。細胞が均等にウェル中に分布していることを確実にするために）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li>プレートに蓋を置き、同じ条件下でインキュベートする（通常37℃、5〜10％CO 2）。 </li></ol></li><li>インサートで爽やかミディアム<ol><li>マイクロピペットを用いて、細胞型の＃1を含むインサートで、一部または細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。 </li><li>新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ゆっくりインサートの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。 </li><li>プレートに蓋を置き、ステップ1.1.4に従ってインキュベートします。 </li></ol></li><li>マルチウェル組織培養プレート中でさわやかなミディアム<ol><li> micropiを使用しましたpette、一部または細胞型の＃2を含むウェルにおける細胞培養培地のすべてを削除します。使用した培地を捨てます。 </li><li>新鮮な細胞培養培地の適切な量を描画します。ウェルの内壁に先端を休ませ、ゆっくりと細胞培養培地を分注します。 </li><li>プレートに蓋を置き、以前に確立された細胞培養プロトコルに従ってインキュベートします。 </li></ol></li><li>細胞型＃2を含むマルチウェル組織培養プレートに細胞タイプ＃1を含むインサートを移します。 注：両方の細胞型は、適切な成長段階に達したときに、この手順を実行します。 <ol><li> ）をウェルへの挿入を転送する前に、以前の手順で説明するように、任意の必要なメディアの変更を行う1.3）と1.4。 注：この時点で、それはインサートメーカーの指示によって指定された両方の区画内のメディアの適切な量を分注することが重要です。 </li><li>グリップ、セルTを含むインサートの最端をピンセットを用いてYPE＃1と優しくウェル細胞型＃2を含む適切なに配置します。 </li><li>すべての挿入を転送した後、インサートの膜の下に気泡が存在するかどうかを確認。 注：気泡がインサートの膜を横切る任意の交換を防止し、実験全体を危険にさらすことができます。 </li><li>気泡が存在する場合、非常に穏やかによく使用ピンセットからインサートを持ち上げて、細胞培養培地に戻って突入。気泡が消えます。彼らはまだ存在している場合は、角度でバック細胞培養培地への挿入を浸漬優しくしてみてください。 注：ノックや接着細胞を解離回避するために、インサートを攪拌しないでください。 </li><li>すべての気泡を除去し、両方の区画内のメディアのボリュームが、プレートに蓋を配置し、インキュベートすることを確認した後。 </li></ol></li><li>共培養系でリフレッシュメディア 注：この膜は容易にインサートとの間のメディアの交換を可能にし、よく、培地をリフレッシュすることで行われますが、拡散のみによって上下コンパートメントで平衡に達するのに要する時間が非常に長くすることができるので、両方の区画。 <ol><li>セルタイプの＃1を含むインサートで爽やか媒体はステップ1.3）と同様に行われます。 </li><li>セルタイプ＃2を含むウェル中の培地をリフレッシュするには、静かにピペットチップを収容するのに十分な広さのスペースを作成する側に挿入部をスライドさせます。 ）ステップ1.4のようにメディアを更新します。 </li><li> ）気泡の有無を確認し、1.5.5を介して手順1.5.3に従ってボリューム）を確認します。 </li></ol></li></ol> 2.例：神経PC12細胞にLPS活性化N9ミクログリアによって分泌されるサイトカインの効果を測定します注：以下の手順はよく特定のフラスコ、皿のサイズのために設計されています。しかし、このプロトコルは任意のプラスチック製品の寸法に合わせてカスタマイズすることができます。メディアや組成の材料表を参照してください。 <ol><li>マルチでのPC12細胞を播種し、差別化ウェル組織培養プレート<ol><li>暖かいルーチンPC12細胞培養培地、37℃の水浴中でPC12分化培地およびトリプシン-EDTA。 </li><li> 75cm 2のフラスコから60から80までパーセントコンフルエンスでPC12細胞を使用してください。 </li><li> 15 mmのパスツールピペットで、フラスコ中の全細胞培養培地の真空吸引を行います。 </li><li>静かに滅菌リン酸緩衝生理食塩水5mlで細胞単層を洗浄し、パスツールピペットで液体を除去します。この段階で細胞を解離しないように注意してください。 </li><li>トリプシンEDTA 3mlで細胞単層を覆い、37℃で2~3分間インキュベートします。 </li><li>すべての細胞が顕微鏡下で分離されることを確認してください。非常に少数の細胞が浮遊している場合は、5分間の最大のために長い期間インキュベートします。 </li><li>トリプシンEDTAを不活性化するために、ルーチンPC12細胞培養培地10mlを加えます。 </li><li>ほとんどの細胞は、O底から解離していることを確認しながら10ミリリットルピペットで、穏やかに粉砕しますフラスコF。細胞懸濁液中の気泡を作成しないでください。 </li><li>同じ10mLのピ​​ペットを用いて50mlの遠心管に細胞懸濁液を移します。 </li><li> 3200×gで1分間遠心操作</li><li>ペレットを乱さないように注意しながらパスツールピペットで上清を捨てます。 </li><li> 10ミリリットルピペットでルーチンPC12細胞培養培地の10ミリリットルを追加します。 注：ペレットが非常に小さい、または大きい場合には、この量を調整することができます。 </li><li>ペレットを均質化するために、同じ10ミリリットルピペットで粉砕します。 PC12細胞は、多くの場合、ピペッティング少なくとも20ので、一緒に凝集し、必要なdownare。 注：活発摩砕が必要であるが、細胞懸濁液中の気泡を作成しないように。 </li><li> 1.5mlチューブでは、トリパンブルー中の細胞懸濁液の適切な希釈を準備します。以前に確立されたプロトコール74に従って血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li>個別の50mlチューブに、細胞懸濁液を分割PC12分化培地で24ウェルプレートから（3万¢/ cm 2でよく、製造業者のプロトコルに従ってあたり0.6 ml）をウェルに播種するために希釈された細胞懸濁液を適切に得ることができます。 注：以前に確立されたプロトコル75で指定された24ウェルプレートは、以前に、コラーゲンでコーティングされている必要があります。 </li><li>よくマイクロピペットを用いて、あたりの細胞懸濁液0.6ミリリットルを配布します。 </li><li>全てのウェルを播種しているとき、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li> PC12細胞の適切な分化は、共培養実験を行う前に、PC12分化培地15,16の5％CO 2の湿潤雰囲気中で37℃で7-9日間、24ウェルプレートをインキュベートすることを可能にします。 </li><li>液体の半分を除去し、新鮮なPC12分化培地の等量それを置き換えることにより、一日おきに培地交換を行います。 </li></ol></li><li>インサートにN9ミクログリアを播種し、LPSで処理します<ol><li>一日の共培養実験を行う前に、1.1.4からステップ1.1.1）以下、細胞接着を最適化するためにルーチンN9細胞培養培地とPTFE0.4μmの細孔インサートを前処理） </li><li> 37℃の水浴中で暖かいルーチンN9細胞培養培地およびトリプシン-EDTA。 </li><li>一方、後で使用するために1.5mlチューブにLPSの約10mgの重量を量ります。 注：LPSが強力な炎症誘発性内毒素であり、特定の安全上の注意、メガネ、手袋、及び粒子状人工呼吸器を必要とするので、強く推奨されています。 </li><li> 75cm 2のフラスコから80〜90％のコンフルエンスでN9細胞を使用してください。 </li><li> ）2.1.14へのステップ2.1.3）に従います。常にルーチンN9細胞培養培地の代わりに、ルーチンのPC12細胞培養培地を使用します。また、N9ミクログリアが）ので、より少ないピペッティング上下がステップ2.1.13で必要になることがあり、一緒にPC12細胞がそうであるように同じくらいを凝集しないことに注意してください。 </li><li>個別の50mlチューブに、OにN9細胞培養培地で細胞懸濁液を分割24ウェルプレート中で保持するように設計されたインサート（60,000¢/ cm 2で、製造業者のプロトコルに従ってインサートあたりが0.05mL、膜表面積については、メーカーの情報を参照）を播種するための適切な希釈細胞懸濁液btain。 注：これらのインサートは、すでに製造者によって、コラーゲンでコーティングされており、細胞接着のために最適化されます。 </li><li>マイクロピペットを用いて、インサートあたりの細胞懸濁液の0.05ミリリットルを配布します。 </li><li>すべての挿入がシードされている場合、）ステップ1.1.7のようにプレートを揺らし。 </li><li> 4μgの2 / mlの/ mlであり、1μgの/ mlの作業溶液を得るために、N9の処理媒体を用いて、LPSの連続希釈液を実行します。 </li><li>ピペットを2μg/ mlの最終希釈を得るために、インサートの1組で4 / mlのワーキング溶液0.05ミリリットル。 </li><li>それぞれを1μg/ mlおよび0.5μgの/ mLの最終希釈液を得た異なるセットのインサート内の他の2つの作業のソリューションのための手順を繰り返し2.2.10）。 </li><li>に共培養実験を行う前に、LPSとN9ミクログリアの活性化を可能にするために、5％CO 2湿潤雰囲気中で37℃で24時間のインサートを含有するプレートをcubate。 </li></ol></li><li> N9ミクログリアと神経PC12細胞を共培養します<ol><li> PC12細胞を分化の7-9日目に、37℃の水浴中で暖かいN9処理媒体とPC12の処理媒体によって、LPSとのインキュベーションの24時間後N9ミクログリアを活性化させます。 </li><li> N9の処理媒体の0.1ミリリットルによって全体の使用済み培地を交換し、ステップ1.3）のようにN9ミクログリアの総培地交換を行います。すべてのinsert.Thisのためにこれを行うインサートでのみアクティブN9ミクログリアを残して、LPSの痕跡をすべて削除する必要があります。 </li><li>ステップ1.4のように神経PC12細胞の総培地交換を行います）。ステップ1.5のように24ウェルプレートへの挿入を移し）、5％CO 2湿潤雰囲気中で37℃で24時間または48時間N9-PC12の共培養を.Incubate。 </li><li> 24後時間または48時間、細胞毒性、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、または他のアッセイのために上清および/または細胞を回収。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

任意の挿入共培養系の実験の最も重要なステップは、実際に使用するための適切な挿入を選択する際に宿ります。孔径及び膜材料が播種される細胞の種類および実験の目的を考慮し忘れることなく、十分な考慮しなければなりません。例えば、走化性アッセイは、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析するために細胞共培養物よりも膜?...

in vitroでの組織、器官またはシステムの研究では、多細胞生物を構成するいくつかの細胞のサブタイプの間に存在する非常に複雑な関係を簡略化しようとする試みです。実際、in vitro研究により、単一の細胞集団の詳細な理解を獲得することを可能にします。 1）細胞間相互作用を低減し、かつ容易に細胞環境を操作する2）能力：二つの主要なインビトロ実験で行う利点があります。したがって、これらの2つの利点が、科学者は、生物全体に外因性の影響の結果を調節する能力をもたらす、 インビボで特定の細胞型の挙動を予測することができています。その意味で、in vitroでの細胞培養は、多くの場合、基礎および応用生命科学を結ぶブリッジとして動作します。それにもかかわらず、in vitroでの作業のいくつかの欠点もありますが、最も重要なのは、特定の予約は、生理的に住むことがされていること観察された表現型のアルの関連性。実際には、単一の細胞型は、容器内で成長させた場合、培養物は、様々な程度に、失う、他の細胞型、組織および起源の生物、およびアンカー内から体液環境への貢献との細胞間接続細胞機能のために、時には重要な特定の三次元構造を維持することを可能にし、組織。 細胞間の関係の問題は、混合培養技術の開発によって対処されてきました。この方法では、2つ以上の細胞集団は、同一の培養容器中で一緒に増殖させます。しかし、これらの混合培養物は、重要な不具合を負うものとします。一方で、いくつかの細胞サブタイプは、物理的起源の組織で互いに相互作用しないと分泌可溶性因子と近くの受容体によって持続的なパラクリン通信のみに依存しています。これは、近位のサイトカインシグナル伝達に依存するいくつかの炎症過程の場合です。混合Cでultures、物理的な相互作用は不可避であり、それが不可能変更された結果を得ることができ、細胞 - 細胞接触の不在下でパラクリン通信を研究することを可能にします。一方、混合集団内の細胞特異的な解釈を達成することはかなりの結果に影響を与える可能性があり、過酷な分離技術を使用せずに実現不可能となります。 これらの重要な問題を解決するために、馴化培地の使用は、区画の文化とパラクリンシグナル伝達の研究を可能にする技術として開発されてきました。この方法は、細胞の他の集団を含むウェルに、従って培地馴化名前、一つの細胞型の上清の転送を必要とします。しかし、重要な欠点は短命分子が​​細胞の第二集団のウェルに転送する馴化培地中で十分に長く生存しないということです。でも寿命の長い分子が大きく拡散による時間をかけて希釈されます。さらに、両方のセル集団は一方向のみパラクリン通信ではなく、アクティブな双方向通信に参加しています。これは、 生体内に存在したように正確な多の関係を再作成に不可欠であるフィードバックシグナル伝達の欠如につながります。 結果として、より良いインビトロ細胞環境におけるインビボ条件で原稿をシミュレートする必要性によって駆動される、細胞培養技術におけるいくつかの進歩が長年にわたって達成されました。最も重要な進歩の一つは、1953年にGrobsteinによって初めて使用される細胞培養物を区画化するための微多孔膜と通気性支持体の使用であった1。このような透過性の支持体は、多数の細胞型に対応するために、使用することが長年にわたって調整されています複数の異なるアプリケーションインチ今日では、これらの支持体は、マルチウェル組織培養プレートまたはcircuのウェルに載るように設計されているように、中空のインサートを存在しますLAR料理。ウェルまたはディッシュが自分の体液性の環境（ 図1）上の細胞の二つの異なる集団の寄与を研究することができ、他の細胞集団が含まれているのに対し、共培養系では、インサートは、1セルタイプが含まれています。その結果、（頂端分泌または信号受信対側底）の細胞極性は、このように、インサート共培養システムを混合培養し、馴化培地技術より重要な利点を付与する、保存されています。膜材料のいくつかの種類は、ポリエステル（PET）、ポリカーボネート（PC）またはコラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン（PTFE）が最も一般的なもので入手可能であり、それらは0.4ミクロンから12.0ミクロンの範囲の異なる細孔サイズで存在します。材料および細孔サイズのこれらの種類は、これらに限定されない使用し、以下のためのさまざまなレベルで、それらを実用的に光学特性、膜の厚さと細胞接着に関連する変数の機能を発揮するインサートのスペクトルを提供します。 -studying透過膜を介して、走化性アッセイによる細胞分化、胚発生、腫瘍転移および創傷修復。 透過性の支持体上で培養上皮細胞または内皮単層を通ってそれらの輸送​​を評価することによって、薬剤の浸透を-evaluating、と。 -performing細胞の共培養は、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって誘導される細胞挙動の変調を分析します。 この論文の目的は、インサート共培養系を用いて、細胞 - 細胞接触の非存在下で分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価することで、上述した第三の機能を果たすために、一般的な方法論のガイドラインを記述することです。研究のいくつかの異なるフィールドは、細胞の集団に分泌された可溶性因子の影響に関連した質問に答えるために、インサート共培養システムを利用します。実際、さまざまなレベルで細胞の挙動を調節パラクリンシグナル伝達は、全ての組織において適切ですインサート共培養システムを持つシステムでは、これらの分野の進歩を確保するために欠かせません。逆に、そのシグナル伝達を確認することができるインサートの使用は、直接細胞 - 細胞接触によってではなく、分泌された因子によるものです。インサートの最も重要な用途の一つは、炎症の研究分泌されるサイトカインの効果は、免疫の種々の細胞の選手で評価され2-14です。特に、中枢神経系（CNS）の炎症の研究は大きく、より良い神経炎症15-21を駆動におけるニューロンとミクログリアの明確なパラクリン役割を定義することができましたインサート共培養研究から利益を得ています。これらのシステムはまた、炎症誘発因子22〜26の分泌を低減または阻害する能力に依存している分子の抗炎症の可能性を研究するために考案されました。血管新生32-34のメカニズムとinflammati特に癌27-31に関連する研究、腫瘍形成における35-42に、また挿入共培養システムから利益を得ます。また、可溶性因子は、分化を駆動プロセスで最も重要であり、いくつかの研究は、その特定のフィールド43-50で質問に答えるためにインサートを使用しています。 CNSにおいて、神経組織は、非常に限られた再生能力を有しているように見て、neurotrophism及び神経保護の研究は基本的であり、広く共培養システム51-56における幹細胞の使用によって保証されています。また、インサートはまた、腎臓57,58、内皮相互作用及び血管新生59-62、63-65シグナル伝達、アポトーシス、肥満やメタボリックシンドローム22,23,66-67の炎症、内耳有毛細胞の保護といったさまざまな分野で利用されています68,69、さらには菌の病原性70,71と寄生虫72,73インチこの記事では、experimを設定するために一般的な方法論的なガイドラインを提供していますインサート共培養系を用いて、分泌された可溶性因子によって媒介される細胞の変化を評価した図で​​ENT。特に、我々は神経細胞の共培養し、神経炎症過程を研究する上でのそれらの使用上の注意を焦点を当てます。パイロットに可能に挿入された実験の非常に広大なスペクトルを考えると、この細胞培養技術のあらゆる側面をカバーするために耐え難いです。一例として、特定のプロトコルは、インサート共培養方法の具体的な理解を提供し、詳細に説明するリポ多糖（LPS）によって分泌されるサイトカインの効果は神経PC12細胞上N9ミクログリアを付活測定します。

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&amp;ndash;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from&amp;nbsp;Escherichia coli&amp;nbsp;055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Cell culture inserts for use with 24-well plates</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Coat with collagen before use</td></tr><tr><td>Routine PC12 cell culture medium</td><td></td><td></td><td>Routine N9 cell culture medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 85% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 90% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 differentiation medium</td><td></td><td></td><td>N9 treatment medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 50 ng/mL nerve growth factor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 treatment medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

インサート共培養システムの使用は、CNSの異なる細胞プレイヤー間パラクリン関係を披露神経炎症プロセスの研究に特に適切です。 CNSにおける免疫は彼らの安静分岐した状態（ 図2A）でその環境を監視し、検知乱れが可能であるミクログリアと呼ばれる常駐細胞によって主に達成される可能性がトラブルの適切な神経機能76-78のために必要な非常...

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Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

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Research

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Biology

27.7K ビュー.  University of Québec. In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

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A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

がん研究

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living biobanks&#34; of patient derived cell lines. For many types of epithelial cells, various three dimensional (3D) culture approaches have been described that support an improved differentiated state. While CRCs retain their lineage commitment to the tissue from which they are isolated, they fail to express many of the differentiation markers associated with the tissue of origin when grown under normal two dimensional (2D) culture conditions. To enhance the application of patient-derived CRCs for prostate cancer research, a 3D culture format has been defined that enables a rapid (2 weeks total) luminal cell differentiation in both normal and tumor-derived prostate epithelial cells. Herein, a filter insert-based format is described for the culturing and differentiation of both normal and malignant prostate CRCs. A detailed description of the procedures required for cell collection and processing for immunohistochemical and immunofluorescent staining are provided. Collectively the 3D culture format described, combined with the primary CRC lines, provides an important medium- to high- throughput model system for biospecimen-based prostate research.

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between colorectal tumor cells and the immune system. Colorectal carcinoma is among the most common type of cancer, typically treated by surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Advantages of radiotherapy in targeting the tumor are well known. However, even limited exposures of healthy tissues are of great concern, particularly regarding the effects on the intestinal barrier and the immune system. The adopted setup allows to study the interplay between two cell populations in a condition more similar to the physiological one, when compared to normal cell cultures. For this purpose, we resort to different techniques and we used an in vitro co-culture model, based on Caco-2 cells differentiated as a monolayer and PBMC, sharing the same culture medium. This protocol has been developed to focus on both macroscopic effects, i.e. cell viability and Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER), and, through western blot, molecular alterations, i.e. the activation of inflammatory pathway in immune cells and the tight junction protein expression in Caco-2 cells. Initial evaluation of radiation effects on Caco-2 cell viability was assessed via the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan blue assays, while TEER was measured at fixed time intervals through an ohmmeter specifically designed for co-culture systems. In this way, the effects due to radiation, the presence of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), and eventually their synergistic effect, can be demonstrated. Through these complementary techniques, we observed a high radio-resistance of Caco-2 within the range of 2 - 10 Gy of X-rays and an increased Caco-2 monolayer permeability when PBMCs were added. In particular, PBMC presence was found to be associated with the variation in the tight junction scaffold proteins expression.

We present a protocol to investigate the crosstalk between X-ray-irradiated Caco-2 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The protocol starts with Caco-2 irradiation and set-up of the co-culture with PBMC; subsequently, trans-epithelial electrical resistance is measured regularly over 48 h and western blot performed in both Caco-2 and PBMC.

X 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

免疫・感染学

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

生物工学

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

神経科学

<meta charset="utf8"></head><body>上皮細胞および線維芽細胞のための高度な2層3D共培養システム

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:PVA-PCLナノファイバーメンブレンによる3D共培養システムの進歩

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

パラ分泌細胞間シグナル研究に近位の培養法

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

生物学

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

簡単な2Dおよび3D細胞培養を可能にするように設計された革新的な3Dプリントインサート

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

要約

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この動画の章

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単な方法：腫瘍微小環境のミミック

原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

X 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と PBMC

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

パラ分泌細胞間シグナル研究に近位の培養法

簡単な2Dおよび3D細胞培養を可能にするように設計された革新的な3Dプリントインサート

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

要約

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濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単​​な方法：腫瘍微小環境のミミック

原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

X 線間のクロストークを解析のための共培養法照射 caco-2 細胞と PBMC

マイクロ流体チップを使用した決定論的方法で単一細胞ベースの共培養を確立する

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

パラ分泌細胞間シグナル研究に近位の培養法

簡単な2Dおよび3D細胞培養を可能にするように設計された革新的な3Dプリントインサート

濃縮細胞集団を生成し、細胞間コミュニケーションを調べるための簡単な方法：腫瘍微小環境のミミック