Name: development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
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This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

NB: Ciascuna delle seguenti operazioni deve essere eseguita in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare come richiesto per colture cellulari di mammifero. Inoltre, le linee guida generali per la coltivazione ottimale delle cellule sterili si applicano, ad esempio., Scartando consigli ogni volta che possono portare a contaminazione incrociata, riducendo la quantità di cellule di tempo sono esposti all&#39;aria durante l&#39;esecuzione di interi cambiamenti dei media, correttamente, ma con delicatezza mescolando sospensioni cellulari per garantire la loro dispensazione omogeneo, ecc Inoltre, gli inserti sono una sorta di plasticware che richiedono un trattamento speciale. In primo luogo, ogni volta che gli inserti sono manipolati, evitare di toccare la membrana fragile, che strappa facilmente e potrebbe quindi compromettere l&#39;esperimento. Inoltre, non è adatto per eseguire l&#39;aspirazione sotto vuoto del mezzo di coltura cellulare, in quanto vi è il rischio di perforazione della membrana o dissociare cellule aderenti. Successivamente, inserti pendere nella piastra di coltura tissutale pozzetti e, pertanto, deve essere posta attenzione quando moVing il Plasticware o durante la dispensazione per evitare di dissociare cellule aderenti. Inoltre, quando si usano inserti di grandi dimensioni dei pori, c&#39;è una possibilità che il mezzo di coltura cellulare filtra attraverso la membrana e, quindi, è importante monitorare frequentemente il livello del liquido. Infine, si noti che il seguente protocollo è progettato per cellule aderenti e richiede piccole modifiche per essere adatto per cellule in sospensione. 1. Linee guida generali per lo svolgimento di esperimenti di co-coltura di inserimento <ol><li> Semina tipo di cellula # 1 a inserti <ol><li> Scartare gli inserti dalla confezione. </li><li> Posizionare gli inserti in una piastra di coltura tissutale pozzetti vuota della dimensione corretta. Per fare ciò, afferrare il bordo superiore dell&#39;inserto usando pinzette. </li><li> Per migliorare l&#39;attaccamento e la diffusione di cellule aderenti, condizionare gli inserti con terreno di coltura cellulare prima della semina. Per fare ciò, coprire l&#39;intera superficie della membrana con coltura cellulare medium con una micropipetta. NOTA: Fate questo per il maggior numero di inserti, come richiesto. </li><li> Riposizionare il coperchio sulla piastra e incubare per almeno 1 ora o O / N alle stesse condizioni (normalmente 37 ° C, 5-10% CO 2). </li><li> Quando gli inserti sono condizionati, rimuovere tutto il terreno di coltura cellulare utilizzando una micropipetta. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> tipo di cellula Seed # 1 nel terreno di coltura fresco nello stesso modo come in una piastra multipozzetto. Per fare ciò, disegnare un appropriato volume di sospensione cellulare con una micropipetta e dispensare il liquido nell&#39;inserto. NOTA: Preparare come molti inserti come richiesto. </li><li> Dopo la semina tutti gli inserti, oscillare delicatamente la piastra destra e sinistra, poi avanti e indietro in modo da distribuire le cellule in modo uniforme. Evitare di fare movimenti circolari, ciò causerebbe le cellule a accumulano nel centro degli inserti. </li><li> Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare come specificato per i requisiti cellulari (normalmente 37 ° C, 5-10% CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Semina tipo di cellula # 2 in piastre di coltura di tessuti pozzetti <ol><li> tipo di cellula Seed # 2 nel terreno di coltura fresco secondo il punto 1. </li><li> Preparare come molti pozzi come richiesto per il numero di inserti. Oscillare la piastra come al punto 1.1.7), al fine di garantire che le cellule sono equamente distribuiti nei pozzetti. </li><li> Mettere il coperchio sulla piastra e incubare alle stesse condizioni (normalmente 37 ° C, 5-10% CO 2). </li></ol></li><li> media rinfrescante in inserti <ol><li> Usando una micropipetta, rimuovere parte o tutto il mezzo di coltura cellulare, negli inserti contenenti tipo cellulare # 1. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> Disegnare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare fresca. riposare delicatamente la punta sulla parete interna dell&#39;inserto e dispensare lentamente il mezzo di coltura cellulare. </li><li> Posizionare il coperchio sulla piastra e incubare secondo passo 1.1.4. </li></ol></li><li> media rinfrescante in piastre di coltura di tessuti pozzetti <ol><li> Utilizzando un MICROPIpipetta, rimuovere parte o tutto il mezzo di coltura cellulare nei pozzetti contenenti tipo cellulare # 2. Eliminare il mezzo utilizzato. </li><li> Disegnare un volume adeguato di terreno di coltura cellulare fresca. Posizionare la punta sulla parete interna del canale e dispensare lentamente il mezzo di coltura cellulare. </li><li> Mettere il coperchio sulla piastra e incubare secondo protocolli di coltura cellulare precedentemente stabiliti. </li></ol></li><li> Trasferimento di inserti contenenti tipo di cellula # 1 a piastre di coltura tissutale pozzetti contenenti tipo di cellula # 2. NOTA: Eseguire questo passaggio quando entrambi i tipi di cellule hanno raggiunto la fase di crescita adeguato. <ol><li> Prima di trasferire gli inserti nei pozzetti, apportare le necessarie modifiche medie, come precedentemente descritto ai punti 1.3) e 1.4). NOTA: A questo punto, è importante dispensare i volumi appropriati di supporto in entrambi i compartimenti, come specificato da istruzioni del produttore dell&#39;inserto. </li><li> Con una pinzetta, afferrare il bordo superiore di un inserto contenente cellule Tipo 1 # e delicatamente posizionarlo nella appropriata pozzetto contenente tipo di cellula # 2. </li><li> Dopo aver trasferito tutti gli inserti, verificare la presenza di bolle d&#39;aria sotto la membrana di inserti. NOTA: Le bolle d&#39;aria impediscono qualsiasi scambio attraverso la membrana dell&#39;inserto e possono compromettere l&#39;intero esperimento. </li><li> Se le bolle d&#39;aria sono presenti, sollevare molto delicatamente l&#39;inserto dal bene con una pinzetta e immergersi di nuovo nel mezzo di coltura cellulare. Le bolle spariranno. Se sono ancora presenti, provare delicatamente immergendo inserti di nuovo nel mezzo di coltura cellulare in un angolo. NOTA: Non battere o mescolare gli inserti per evitare di dissociare cellule aderenti. </li><li> Dopo aver rimosso tutte le bolle d&#39;aria e controllare che i volumi di media in entrambi i comparti, posizionare il coperchio sulla piastra e incubare. </li></ol></li><li> mezzi rinfrescanti in un sistema di co-coltura NOTA: Anche se la membrana consente facilmente gli scambi multimediali tra inserto e ben, rinfrescante il medium è fatto inentrambi i comparti Poiché il tempo necessario per raggiungere l&#39;equilibrio nei vani superiori e inferiori da sola diffusione possono essere piuttosto lungo. <ol><li> media rinfrescante in inserti contenenti tipo cellulare # 1 viene effettuata nello stesso modo come nel punto 1.3). </li><li> Per aggiornare medie pozzetti contenenti tipo di cellula # 2, far scorrere delicatamente l&#39;inserto di lato per creare uno spazio abbastanza ampio per ospitare una punta della pipetta. Aggiornare il medium come al punto 1.4). </li><li> Controllare la presenza di bolle d&#39;aria e verificare i volumi come per gradini 1.5.3) attraverso 1.5.5). </li></ol></li></ol> 2. Esempio: misurare gli effetti delle citochine secrete da microglia N9 LPS-attivati ​​sulle cellule neuronali PC12 NOTA: Le seguenti operazioni sono progettati per specifiche pallone, bene e dimensioni del piatto. Tuttavia, il protocollo può essere personalizzato per qualsiasi dimensione plasticware. Per i media e la composizione vedi Materiali Tavolo. <ol><li> Semina e differenziazione delle cellule PC12 in multie piastre di coltura tissutale <ol><li> mezzo di coltura cellulare PC12 routine di riscaldamento, PC12 terreno di differenziamento e tripsina-EDTA in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Utilizzare cellule PC12 al 60-80% di confluenza da un 2 pallone 75 cm. </li><li> Con di 15 mm pipetta Pasteur, effettuare l&#39;aspirazione a vuoto dell&#39;intero mezzo di coltura cellulare nel pallone. </li><li> Lavare delicatamente il monostrato cellulare con 5 ml di sterile tampone fosfato e rimuovere il liquido con una pipetta Pasteur. Fare attenzione a non dissociare le cellule in questa fase. </li><li> Coprire il monostrato cellulare con 3 ml di tripsina-EDTA e incubare per 2-3 minuti a 37 ° C. </li><li> Assicurarsi che tutte le cellule sono staccati al microscopio. Se pochissime cellule sono flottanti, incubare per un periodo più lungo per un massimo di 5 min. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura cellulare PC12 di routine al fine di inattivare la tripsina-EDTA. </li><li> Con una pipetta 10 ml, triturare delicatamente facendo in modo che la maggior parte delle cellule sono dissociate dal basso of matraccio. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria nella sospensione cellulare. </li><li> Con la stessa pipetta 10 ml, trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugazione 50 ml. </li><li> Centrifugare per 1 min a 3.200 xg </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta Pasteur facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreno di coltura cellulare PC12 routine con una pipetta 10 ml. NOTA: Questo volume può essere regolato se il pellet è insolitamente piccolo o grande. </li><li> Triturare con la stessa pipetta 10 ml per omogeneizzare il pellet. cellule PC12 spesso si raggruppano in modo almeno il 20 pipettando su e downare necessario. NOTA: Durante la triturazione vigorosa è necessario, evitare di creare bolle d&#39;aria nella sospensione cellulare. </li><li> In una provetta da 1,5 ml, preparare una diluizione appropriata di sospensione cellulare in blu trypan. Contare le cellule utilizzando un emocitometro secondo protocolli stabiliti in precedenza 74. </li><li> In un tubo separato 50 ml, dividere la sospensione cellularecon terreno di differenziamento PC12 per ottenere una sospensione appropriata diluite per semina pozzetti di una piastra da 24 pozzetti (30.000 ¢ / cm 2, 0,6 ml per pozzetto secondo il protocollo del produttore). NOTA: Il 24-pozzetti deve essere preventivamente rivestito con collagene, come specificato dai protocolli stabiliti in precedenza 75. </li><li> Distribuire 0,6 ml della sospensione di cellule per pozzetto con una micropipetta. </li><li> Quando tutti i pozzi sono testa di serie, il rock la piastra come al punto 1.1.7). </li><li> Per consentire il corretto differenziamento delle cellule PC12, incubare le piastre a 24 pozzetti per 7-9 giorni a 37 ° C in atmosfera umida 5% CO 2 in PC12 differenziazione medio 15,16 prima di eseguire esperimenti di co-coltura. </li><li> Eseguire modifiche medie a giorni rimuovendo la metà del liquido e la sua sostituzione con un uguale volume di terreno di differenziamento PC12 fresco. </li></ol></li><li> Semina microglia N9 negli inserti e trattare con LPS <ol><li> Un giorno prima di effettuare degli esperimenti di co-coltura, pre-trattamento di PTFE 0,4 inserti micron-pori con routine di terreno di coltura cellulare N9 per ottimizzare l&#39;aderenza delle cellule, seguendo i punti 1.1.1) attraverso 1.1.4) </li><li> Warm medio di routine N9 coltura cellulare e tripsina-EDTA in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Nel frattempo, pesano circa 10 mg di LPS in una provetta da 1,5 ml per un uso successivo. NOTA: Dal momento che LPS è un potente endotossine pro-infiammatorio e richiede particolari precauzioni di sicurezza, occhiali, guanti, e un respiratore per particolati sono fortemente raccomandato. </li><li> Utilizzare le cellule N9 a 80-90% di confluenza da un 2 pallone 75 cm. </li><li> Seguire i passaggi 2.1.3) a 2.1.14). Usare sempre terreno di coltura cellulare N9 di routine, invece di mezzo di coltura cellulare PC12 di routine. Si noti inoltre che la microglia N9 non si aggregano insieme tanto quanto le cellule PC12 fanno, in modo meno pipettando su e giù possono essere necessarie al punto 2.1.13). </li><li> In un tubo separato 50 ml, dividere la sospensione cellulare con terreno di coltura cellulare N9 per obtain una sospensione cellulare diluita appropriato per la semina inserti progettati per tenere in piastre da 24 pozzetti (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml per inserto secondo il protocollo del produttore, per superficie della membrana vedere le informazioni del produttore). NOTA: Questi inserti sono già rivestiti con collagene dal produttore e sono ottimizzati per l&#39;adesione cellulare. </li><li> Distribuire 0,05 ml della sospensione cellulare per inserto utilizzando una micropipetta. </li><li> Quando tutti gli inserti sono teste di serie, il rock la piastra come al punto 1.1.7). </li><li> Eseguire diluizioni seriali di LPS utilizzando terreno di trattamento N9 per ottenere 4 mg / ml, 2 mg / ml e / ml soluzione di lavoro 1 mg. </li><li> Pipettare 0,05 ml di 4 mg / ml soluzione di lavoro in un set di inserti per produrre una diluizione finale di 2 mg / ml. </li><li> Ripetere il passaggio 2.2.10) per le altre due soluzioni di lavoro in diversi inserti set, ottenendo diluizioni finali di 1 mg / ml e 0,5 mg / ml, rispettivamente. </li><li> Incubate le piastre contenenti gli inserti per 24 ore a 37 ° C in CO 2 ambiente umido 5% per consentire N9 microglia attivazione con LPS prima di eseguire degli esperimenti di co-coltura. </li></ol></li><li> Co-coltivando cellule PC12 neuronali con microglia N9 <ol><li> A 7-9 giorni di differenziazione delle cellule PC12, attivare le microglia N9 dopo 24 ore di incubazione con LPS di terreno di trattamento N9 calda e terreno di trattamento PC12 in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Eseguire un cambio medio totale per microglia N9 come al punto 1.3), sostituendo l&#39;intero mezzo utilizzato da 0,1 ml di terreno di trattamento N9. Fate questo per ogni insert.This è necessario rimuovere tutte le tracce di LPS, lasciando microglia N9 solo attivati ​​negli inserti. </li><li> Eseguire un cambio medio totale per le cellule neuronali PC12 come al punto 1.4). Trasferire gli inserti nelle piastre da 24 pozzetti come al punto 1.5) .Incubate co-colture N9-PC12 per 24 ore o 48 ore a 37 ° C in CO 2 ambiente umido 5%. </li><li> dopo 24hr o 48 hr, raccogliere il surnatante e / o le cellule per la citotossicità, saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), Western Blot, o di altri test. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La fase più critica di esperimenti sistema inserto co-coltura effettivamente abita nello scegliere l&#39;inserto corretto di utilizzare. Dimensione dei pori e materiale della membrana devono essere presi in considerazione approfondita, senza dimenticare di considerare il tipo di cellule che saranno seminate e lo scopo dell&#39;esperimento. Per esempio, saggi chemiotassica possono utilizzare lo stesso tipo di membrana di co-colture cellulari per analizzare modulazioni comportamento cellulare indotta da fattori solubili ...

Lo studio dei tessuti, organi o sistemi in vitro è un tentativo di semplificare le molto complesse relazioni esistenti fra i vari sottotipi cellulari che compongono organismi multicellulari. Infatti, gli studi in vitro permettono di acquisire una comprensione dettagliata delle popolazioni di cellule singole. Ci sono due principali vantaggi di condurre esperimenti in vitro: 1) riduzione interazioni cellulari, e 2) la capacità di manipolare facilmente l&#39;ambiente cellulare. Scienziati Quindi, questi due vantaggi hanno consentito di prevedere il comportamento di specifici tipi cellulari in vivo, che porta alla capacità di regolare risultati delle influenze estrinseche in organismi interi. In questo senso, colture cellulari in vitro spesso funziona come un ponte che collega le scienze di base e applicate vita. Tuttavia, ci sono anche diversi svantaggi di lavorare in vitro, il più importante dei quali è che una certa riserva può dimorare nella fisiologicaAl rilevanza di fenotipi osservati. In effetti, quando un unico tipo di cellula è coltivato in un vaso, la cultura perde, a diversi livelli,, le sue connessioni cellula-cellula con altri tipi di cellule, il suo contributo per l&#39;ambiente umorale dal tessuto e organismo di origine, e le ancore all&#39;interno il tessuto che ha permesso di sostenere una particolare struttura tridimensionale volte cruciale per la funzione delle cellule. La questione dei rapporti cellula-cellula è stato affrontato con lo sviluppo di tecniche di coltura mista. In questo metodo, due o più popolazioni di cellule sono coltivate insieme nello stesso recipiente di coltura. Tuttavia, queste culture miste sopportano disagi importanti. Da un lato, alcuni sottotipi di cellule non fisicamente interagiscono tra loro nei tessuti di origine e si basano esclusivamente sulle comunicazioni paracrini sostenute da fattori solubili secreti e recettori nelle vicinanze. Questo è il caso per diversi processi infiammatori che dipendono prossimale segnalazione di citochine. In misto cultures, interazioni fisiche sono inevitabili e rendono impossibile studiare le comunicazioni paracrini in assenza di contatti cellula-cellula che possono produrre risultati alterati. D&#39;altra parte, ottenendo interpretazioni specifiche delle celle all&#39;interno di una popolazione mista diventa irrealizzabile senza l&#39;uso di tecniche di separazione dure che potrebbero influenzare significativamente i risultati. Per risolvere questi problemi importanti, l&#39;uso dei mezzi condizionati è stata sviluppata come una tecnica che consente culture compartimenti e lo studio di segnalazione paracrina. Questo metodo richiede il trasferimento del surnatante di un tipo di cellula, medio così chiamato condizionata, di pozzetti contenenti un&#39;altra popolazione di cellule. Tuttavia, un importante inconveniente è che le molecole di breve durata non sopravvivono abbastanza a lungo nel mezzo condizionato da trasferire ai pozzetti della seconda popolazione di cellule. Anche le molecole lunghe durata sarà notevolmente diluiti nel tempo a causa di diffusione. Inoltre, sia cellulepopolazioni partecipano solo in comunicazione paracrina unidirezionale, piuttosto che nella comunicazione bidirezionale attiva. Questo porta alla mancanza di segnale di retroazione che è vitale per ricreare rapporti multicellulari accurate come esistono in vivo. Di conseguenza e guidato dalla necessità di meglio simulare l&#39;originale in condizioni in vivo l&#39;ambiente cellulare in vitro, diverse progressi nelle tecniche di coltura cellulare sono stati ottenuti nel corso degli anni. Uno dei progressi più significativi è stato l&#39;uso di supporti permeabili con membrane microporose di compartimentazione colture cellulari, utilizzate per la prima volta da Grobstein nel 1953 1. Tali supporti permeabili sono stati adattati negli anni per ospitare numerosi tipi di cellule e da utilizzare in diverse applicazioni. Oggi, questi supporti esistono inserti come cave che sono progettati per riposare in pozzetti di una piastra di coltura tissutale pozzetti o in circupiatti lar. In un sistema di co-coltura, l&#39;inserto contiene un tipo di cellule che pozzo o piatto contiene l&#39;altra popolazione cellulare, permettendo di studiare il contributo di due differenti popolazioni di cellule sul loro ambiente umorale (Figura 1). Come risultato, la polarità cellulare (basolaterale vs secrezione apicale o ricezione del segnale) è conservato, conferendo sistemi inserto co-coltura un importante vantaggio rispetto colture miste e tecniche mezzo condizionato. Diversi tipi di materiali membrana sono disponibili, i più comuni sono poliestere (PET), policarbonato (PC) o collagene rivestite con politetrafluoroetilene (PTFE), ed esistono in diverse dimensioni dei pori da 0,4 micron a 12,0 micron. Queste varietà di materiali e dimensioni dei pori offrono una gamma di inserti che esercitano funzioni di variabili rilevanti per le proprietà ottiche, spessore della membrana e l&#39;adesione delle cellule che li rendono pratici a livelli diversi per i seguenti usi non limitato a: -studiandola differenziazione delle cellule, lo sviluppo embrionale, metastasi tumorali e la riparazione delle ferite mediante saggi chemiotassica attraverso membrane permeabili; -evaluating penetrazione farmaco, valutando il loro trasporto attraverso monostrati epiteliali o endoteliali in coltura su supporti permeabili, e; -Esecuzione co-colture di cellule di analizzare modulazioni il comportamento delle cellule indotte da fattori solubili secreti in assenza di contatto cellula-cellula. Lo scopo di questo articolo è descrivere orientamenti metodologici generali per compiere la terza funzione sopra indicato, che è di valutare cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secrete in assenza di contatto cellula-cellula con un sistema di inserimento co-coltura. Diversi campi di ricerca fanno uso di sistemi inserto co-coltura per rispondere a domande relative all&#39;effetto di fattori solubili secreti su popolazioni di cellule. Infatti, segnalazione paracrina che modula comportamento cellulare a vari livelli è pertinente in tutti i tessutie sistemi, il che rende i sistemi di co-coltura inserto indispensabile per assicurare progressi in questi campi. Al contrario, l&#39;utilizzo di inserti può confermare che il segnale di trasduzione è attraverso il contatto diretto cellula-cellula e non da fattori secreti. Uno degli usi più importanti di inserti è in studi infiammazione 2-14 in cui l&#39;effetto di citochine secrete viene valutato in vari giocatori cellulari di immunità. In particolare, lo studio di infiammazione nel sistema nervoso centrale (SNC) ha notevolmente beneficiato da studi inserto co-coltura, che hanno permesso di definire meglio i ruoli paracrini distinti di neuroni e microglia nel guidare neuroinfiammazione 15-21. Questi sistemi sono stati concepiti per studiare il potenziale anti-infiammatorio di molecole che si basa sulla loro capacità di ridurre o inibire la secrezione di fattori pro-infiammatori 22-26. La ricerca di pertinenza di cancro 27-31, in particolare i meccanismi alla base dell&#39;angiogenesi 32-34 e inflammatisul 35-42 nella tumorigenesi, beneficia anche di sistemi di inserti co-coltura. Inoltre, fattori solubili sono di primaria importanza nei processi che guidano la differenziazione e diversi studi hanno usato gli inserti di rispondere alle domande in quel particolare settore 43-50. Nel SNC, visto che tessuto neurale ha un potenziale rinnovamento molto limitato, lo studio di neurotrophism e neuroprotezione è fondamentale ed è stato ampiamente garantita dall&#39;uso di cellule staminali in sistemi di co-coltura 51-56. Inoltre, gli inserti sono utilizzati anche in settori diversi come nefrologia 57,58, interazioni endoteliali e l&#39;angiogenesi 59-62, apoptosi segnalazione 63-65, infiammazione di obesità e sindrome metabolica 22,23,66-67, orecchio interno di protezione delle cellule dei capelli 68,69, e anche in funghi virulenza 70,71 e parassitologia 72,73. Questo articolo offre indicazioni metodologiche generali al fine di istituire un sperimento in vista di valutare cambiamenti cellulari mediati da fattori solubili secreti che utilizzano un sistema di inserimento co-coltura. In particolare, ci concentreremo la nostra attenzione su co-colture di cellule nervose e il loro uso nello studio processo neuroinfiammatorio. Data la vasta gamma di esperimenti che inserisce rendere possibile pilota, è insopportabile per coprire ogni aspetto di questa tecnica di coltura cellulare. Come esempio, un protocollo specifico per misurare gli effetti di citochine secrete da lipopolisaccaride (LPS) -activated microglia N9 su cellule PC12 neuronali sarà dettagliato, offrendo una comprensione concreta della metodologia inserto co-coltura.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&amp;ndash;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from&amp;nbsp;Escherichia coli&amp;nbsp;055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Cell culture inserts for use with 24-well plates</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Coat with collagen before use</td></tr><tr><td>Routine PC12 cell culture medium</td><td></td><td></td><td>Routine N9 cell culture medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 85% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 90% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 differentiation medium</td><td></td><td></td><td>N9 treatment medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 50 ng/mL nerve growth factor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 treatment medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

L&#39;utilizzo di sistemi di inserti co-coltura è particolarmente pertinente nello studio dei processi neuroinfiammatori che mettono in risalto le relazioni tra i diversi attori paracrini cellulari del sistema nervoso centrale. Immunità nel sistema nervoso centrale avviene principalmente dalle cellule residenti chiamate microglia che monitorano l&#39;ambiente nel loro riposo stato ramificata (Figura 2A) e sono in grado di disturbi di rilevamento che potrebbero turbare ...

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Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

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Video: Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Bioingegneria

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between colorectal tumor cells and the immune system. Colorectal carcinoma is among the most common type of cancer, typically treated by surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Advantages of radiotherapy in targeting the tumor are well known. However, even limited exposures of healthy tissues are of great concern, particularly regarding the effects on the intestinal barrier and the immune system. The adopted setup allows to study the interplay between two cell populations in a condition more similar to the physiological one, when compared to normal cell cultures. For this purpose, we resort to different techniques and we used an in vitro co-culture model, based on Caco-2 cells differentiated as a monolayer and PBMC, sharing the same culture medium. This protocol has been developed to focus on both macroscopic effects, i.e. cell viability and Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER), and, through western blot, molecular alterations, i.e. the activation of inflammatory pathway in immune cells and the tight junction protein expression in Caco-2 cells. Initial evaluation of radiation effects on Caco-2 cell viability was assessed via the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan blue assays, while TEER was measured at fixed time intervals through an ohmmeter specifically designed for co-culture systems. In this way, the effects due to radiation, the presence of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), and eventually their synergistic effect, can be demonstrated. Through these complementary techniques, we observed a high radio-resistance of Caco-2 within the range of 2 - 10 Gy of X-rays and an increased Caco-2 monolayer permeability when PBMCs were added. In particular, PBMC presence was found to be associated with the variation in the tight junction scaffold proteins expression.

We present a protocol to investigate the crosstalk between X-ray-irradiated Caco-2 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The protocol starts with Caco-2 irradiation and set-up of the co-culture with PBMC; subsequently, trans-epithelial electrical resistance is measured regularly over 48 h and western blot performed in both Caco-2 and PBMC.

Un metodo di co-coltura di indagare il Crosstalk tra raggi x irradiati PBMC e cellule Caco-2

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

Immunologia e infezioni

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Neuroscienze

<meta charset="utf8"></head><body>Sistema avanzato di co-coltura 3D a due strati per cellule epiteliali e fibroblasti

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento dei sistemi di cocoltura 3D con membrane nanofibrose PVA-PCL

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

Un innovativo inserto stampato in 3D progettato per consentire colture cellulari 2D e 3D semplici

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

Riepilogo

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Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

Un metodo di co-coltura di indagare il Crosstalk tra raggi x irradiati PBMC e cellule Caco-2

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Definizione di un modulo di cocoltura tridimensionale di cellule epiteliali utilizzando membrane nanofibrose

Un innovativo inserto stampato in 3D progettato per consentire colture cellulari 2D e 3D semplici