저자 애비 해리스의 기술 지원을 인정 한다. 그들은 또한 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 프로토콜을 최적화 하는 데 도움에 대 한 폴라 코헨과 김 웨이 인정 합니다. 저자는 또한 중요 한 독서의 카 렌 쉰들러에 의해 원고를 주셔서 감사합니다.
이 작품은 NIH R01 GM106262 K.M.B.에 의해 지원 되었다

쥐를 포함 하는 모든 방법을 활용 높은 윤리 및 복지 표준, 그리고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Drexel 대학 대학의과 대학에 의해 승인 했다.
1입니다. 솔루션 및 필요한 악기의 준비
<ol><li>초순 실험실 급료 물, pH 8.2-8.4 (표 1) 50 mL에 소형 추출 버퍼 (히)를 준비 합니다. 신선한 때마다, 얼음, 유지 하 고 확산; 준비의 2 시간 이내 사용 솔루션 이것은 줄이고 각각 DTT와 PMSF의 활동을 억제 하는 효소를 최적화 해야 합니다. 히의 10 mL를 사용 하 여 마우스 testes의 각 쌍에 대 한.</li>
	<li>학년 물 초순 실험실의 10 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 100 mM 자당 솔루션 (신선한 각 시간)을 준비 합니다. 8.2에 pH를 조정</li>
	<li>통 솔루션 준비 (1 %paraformaldehyde (PFA), 0.15% 트라이 톤 X-100, pH 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 조정) 신선한 월별와 스토어 실내 온도에 그것은 빛 으로부터 보호. 작업 사진으로 사용 하기 위해 1 X PBS에서 4%로 16% 상용 PFA 시작 재고 희석 하 고 후-20 ° c.에 4 %aliquots 저장<ol>
<li>통 솔루션을 준비 하려면 추가 4 %PFA 솔루션의 10 mL와 10%의 600 µ L 트라이 톤 X-100 1 X PBS의 30 mL를 섞어 잘, 그리고 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 pH를 조정. (더 이상 4 주)에 대 한 실 온에서 알루미늄 호 일에 싸여 50 mL 원뿔 튜브에 통 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포토 플로 200 세척 솔루션 (해당 되는 동안 슬라이드 마지막 30 분 건조) 준비: 0.4% 포토 플로 200/PBS (320 µ L 포토 플로 200의 1 X PBS의 80 ml에서) 및 0.4% 포토 플로 200/dH2O (160 µ L 포토 플로 200 초순 실험실 급료 물 40 mL에). 가득한 솔루션의 40 mL 50 mL Coplin jar를 사용 하 여 한 번에 10 개 이하의 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>다음 악기를 준비: 1 켤레 (피부 incise)을 수술가 위, 좋은 팁 (incise 복)을 수술가 위의 1 개 쌍 (각 고환 개 해 부)를 바로 좋은 팁 겸, 2 쌍 1 똑 바른 가장자리 면도기 블레이드 (각 고환 incise), 2 쌍의 곡선 (각 고환 고정을 짜 seminiferous tubules) 팁 집게, 50 mL Coplin 항아리, 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드, 크기 11 블레이드, 습도 챔버, 100 x 15 mm 페 트리 접시, 좋은 팁 영구 마커 또는 연필, 1 메스와 플랫폼 회전 통입니다.<ol>
<li>충전된 장소 프리미엄 통 솔루션 사용까지 가득 50 mL Coplin jar에 똑바로 두르고 끝 유리 슬라이드 precleaned. 참고: 연필 슬라이드 에탄올, 형광 제자리에서 교 잡 등을 요구 하는 절차에서 이후에 사용 하는 경우 기본 설정입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. spermatocyte 핵 확산
<ol><li>기관 지침 (또는 CO2 질 없이 예: 자 궁 경부 전위)에 따라 남성 마우스 안락사</li>
	<li>사용 P10-P20 남성 spermatogenesis;의 물결 meiotic 세포 평가 하 우리는 일상적으로 사용 P15-의향 I. 성인 testes 제공의 모든 substages에서 세포를 얻기 위해 P17 남성 의향에서 세포 나도, 하지만 그들은 또한 spermatids와 같은 더 postmeiotic 셀을 얻을 것입니다.</li>
	<li>수확 및 무게 testes (짝된 무게 기록); 그런 다음 그들을 축축한 유지를 추운 히 몇 방울을 포함 하는 배양 접시에 배치 합니다.</li>
	<li>고환 접시의 바닥에 대 한 곡선된 팁 집게로 누른 직선 가장자리 면도기 블레이드는 고환의 캡슐을 통해 작은 수직 중간 절 개를 사용 하 여. 여전히 한 집게와 접시의 바닥에는 고환 잡고, 곡선된 팁 집게 또는 직선 모서리 면도날의 두 번째 집합을 사용 하 여 부드럽게는 고환에서 seminiferous tubules를 짠 다.<ol>
<li>찬 히, 캡슐의 튜브에 않도록 하기 위해 돌의 10 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에는 tubules를 놓습니다. 두 번째 고환이이 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포함 하는 고환의 크기에 따라 30-60 분 동안 얼음에 히 원뿔 튜브에 decapsulated seminiferous tubules를 품 어. 한 쌍의 고환 무게 30 mg에서 seminiferous tubules를 품 어 이하로 30 분, 60 분에 대 한 30-45 분, 그리고 큰 고환에 대 한 31 ~ 50 밀리 그램을 무게 testes의 쌍에서 tubules. 하나의 고환에 대 한 시간을 변경 하지 않습니다. 참고: 최적의 부 화에 실험, 사용, 시 약 및 분석 되는 쥐의 경험에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>Seminiferous tubules 히에 잠복기는, 하는 동안 마커 또는 연필 마우스 precleaned 슬라이드의 서리로 덥은 끝 번호, 슬라이드 번호 및 날짜를 사용 합니다. 다음 통 솔루션이 포함 된 Coplin jar에 미리 청소 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>부 화, 다음 깨끗 한 Petri 접시와 약 3 m m 직경 수 풀에 별도 tubules tubules와 히를 붓는 다. 각 덩어리 생성 2 슬라이드 하 고 굴복 하는 슬라이드 수 고환의 크기에 따라 다릅니다. 참고: 우리는 야생 타입 subfertile Chtf18에서 6 슬라이드에서 8 슬라이드 얻을-P16 testes (있는) meiotic mitotic 세균 세포8의 감소 숫자로 인해 작은 null. 한 성인 고환 100 밀리 그램 이상의 무게 16 슬라이드를 예상 될 것 이다.</li>
	<li>테 플 론의 한 반지로 100mm 자당 솔루션의 장소 23 µ L 인쇄, 3 슬라이드 링 반지 seminiferous tubules의 한 덩어리를 추가.  다음을 사용 하 여 곡선 팁 겸 덩어리를 잡고, 부드럽게 솔루션 흐린 될 때까지 크기 11 면도날으로 tubules를 말하다. 참고:이 조각난된 염색체에 발생 overmince 하지 않습니다. Note 조각난된 염색체 돌연변이 표현 형을 나타내는 수도 수 있습니다.</li>
	<li>이물질 제거, 자당 솔루션의 또 다른 23 µ L을 추가 하 고는 micropipette를 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 혼합물을 위아래로 몇 번 하는 정지에서 세포를 분리 하는 데 도움이.</li>
	<li>포함 된 통 솔루션 Coplin jar에 몸을 담글 슬라이드를 제거 하 고 그 하나의 관대 한 방울 슬라이드의 하단 모서리에서 수집 그래서 항아리에 슬라이드를 기울기.<ol>
<li>피펫으로 20 µ L 프리미엄 통 물방울에 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드의 반지에서 자당 세포 현 탁 액의 젖 빛 유리 슬라이드, 그리고 피펫으로 위아래로 2-서 스 펜 션 3 번. 참고: 통 방울 되어야 합니다 볼륨에 충분히 큰 그래서 그것에 자당 세포 현 탁 액의 20 μ의 추가 허용 범위 전체 슬라이드에 걸쳐 혼합물 (2.11 아래 참조) 전염 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>천천히 기울기 확산 슬라이드의 길이 따라 세포 현 탁 액을 방울 반대 측면에 슬라이드. 다음 슬라이드를 천천히 기울기 다시 완전히 커버 슬라이드의 너비를 따라 세포 현 탁 액을 확산. 슬라이드 보다 더 한 번 그렇지 않으면 셀 서로 겹칠 것의 동일한 지역에 정지를 확산 하지 마십시오.</li>
	<li>즉시 슬라이드 습도 챔버에 평평 하 게 놓고 반복 단계 2.8 2.11 seminiferous tubules의 모든 대단히 짧은 시간까지 슬라이드를 만들기 위해 사용 되었습니다. 그것은 찢 어과 셀 중복을 피하기 위해 건조 과정에서 습도 챔버를 이동 하지 해야 합니다.</li>
	<li>그들은 천천히 하 고 완전히 건조 되도록 2.5 h에 대 한 실 온에서 덮여 습도 챔버에 품 어를 슬라이드 수 있습니다. 높은 습도 및이 단계에서 느린 건조는 chromatin의 적절 한 확산 되도록 중요 하다. 그리고 챔버의 커버를 제거 슬라이드 추가 30 분 완전히 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>슬라이드 (다시 뒤로 또는 지그재그 패턴) 0.4% 포토 플로 200/1 X PBS 솔루션 포함 Coplin jar에 고는 슬라이드를 두 번, 5 분을 세척, 부드럽게는 Coplin agitating, 통을 회전 하는 플랫폼에 항아리. 각 세척에 대 한 신선한 솔루션을 사용 하 고는 세척의 각각에 대해 별도 항아리에 다른 마우스에서 슬라이드를 계속.</li>
	<li>교 반 하면서 한 번 포함 하는 5 분 동안 0.4% 포토 플로 200/dH2O 솔루션 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>제거 슬라이드는 Coplin jar (마지막 세척), 신중 하 게 하 게 가장자리와 과잉 액체를 제거 하는 슬라이드의 바닥 닦아 하 고 건조 각도, 거의 직 립 위치에 슬라이드를 배치. 이 기술에 능숙 한 실험 자 수 처리 하 고 하루에 4 또는 5 쥐에서 표면 확산 핵을 준비.</li>
	<li>일단 건조 (15-20 분), 즉시 면역 형광 염색 법 또는-80 ° c 최대 3 주에 대 한 빛에서 보호 된 단단히 닫은 슬라이드 상자에서 저장소에 대 한 슬라이드를 처리 (; 평가 대상 단백질에 따라 최적의 결과 얻을 수 있습니다 경우 스테인드 같은 일 또는 2 주 이내).<ol>
<li>-80 ° C에 저장 하는 경우 다음에 실내 온도와 서 얼룩이 지기 전에 5 분 동안 1 Coplin jar에 X PBS 또는 블록 세척 슬라이드 수 있습니다. 참고: 많은 다른 면역 형광 얼룩 프로토콜; 좋은 결과 제공할 것입니다. immunostaining 프로토콜8버코위츠 외.를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

저자는 공개 없다.

잘 확산, 좋은 품질 spermatocyte 핵의 높은 번호를 얻을,이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 히, 적절 한 seminiferous tubules의 닦지 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간을 포함 하 고 기술을 고용 통 코팅된 슬라이드에 자당 세포 현 탁 액 분산. 우리는 testes comparably 세 Chtf18에서 45 분, HEB에서 성인 기에 출생 후 하루 15에서에서 배열 하는 야생 타입 남성의 고환에서 seminiferous tubules를 품 어-null 생쥐...

마우스는 포유류에서 감수 분열을 연구 모델 생물으로 광범위 하 게 사용 됩니다. 정상적인 발달 과정 및 감수 분열 중 발생 하는 결함을 평가할 수 있습니다. 타임 라인 및 의향 어 substages, 하는 동안 발생 하는 돌출 하는 특징의 진행으로 다양 한 특정 단백질 감수 분열의 규칙에 중요 한 프로세스에 관련 된 야생 유형 및 돌연변이 생쥐에서 특징 수 있습니다. 내가 (헨델과 Schimenti1검토) 세부에서 공부 될 수 있다 감수 분열 중 발생 하는 몇 가지 특수 프로세스. DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 형성 및 수리, 재결합, synaptonemal 복잡 한 형성 및 염색체 분리 포함 됩니다.
Meiotic 프로세스의 중요 한 측면은 핵 시각과 광학 해결 되어 더 나은 포함 동종 염색체 구별 하 고 식별 의향 5 substages는 이루어져 I. 의향의 substages를 검사 하는 능력 그 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 형성을 포함 하 여 특정 기능에 의해 특징. 사우스 캐롤라이나는 페어링 있도록 자간 단백질 비 계 및 homologs의 DNA 이중 가닥 브레이크 수리. Leptonema, 동안 homologs는 SC의 축 요소 답니다로 맞춥니다. 다음 zygonema 중 synaptonemal 복잡 한 중앙 요소 첨부 파일 homologs의 쌍 사이 연결 및 물리적 연결을 (synapsis)을 촉진 한다. Pachynema, 동안 homologs의 synapsis 완료 되 고 DNA 크로스 동종 재결합을 통해 DNA 두 배 물가 틈의 선택 인구의 수리에서 형성 된다. 사우스 캐롤라이나 동안에 diplonema, homologs desynapse 하지만 그들의 centromeres, DNA 크로스의 사이트에 연결 된 남아 있도록 디스어셈블 합니다. 마지막으로 동안에 diakinesis, homologs recondense 그리고 분열에 전환1.
역사적으로, 특히 그 의향의 초기 단계에서 몇 가지 핵 나왔고 meiotic chromatin의 표면 확산 나2. 결과적으로, 이러한 방법은 조직 즉 고환 (난소)에서 세포의 분리, 확산 meiotic chromatin의 기술과 높은 품질 meiotic 핵 평가2,3, 의 수확량을 개선 하기 위해 수정 된 4. 또한,이 방법은 핵 보존에 유용 하 게 입증 하 고 chromatin meiotic 핵에서 단백질 바인딩 같이 게시 된 immunolocalization 기법5,,67. 메서드를 처음 피터 스2 로 설명 하 고 시연 여기 수익률 겪고 의향의 leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, 및 diakinesis substages homologs를 포함 하는 많은 별도 버스트 spermatocyte 핵 따라서, 내가.
표면 확산 핵 (chromatin 확산 분석이 라고도 함)을 준비 하는 기술은 감수 분열 생식과 세포 생물학의 분야에서 연구에 널리 사용 됩니다. 표면 확산 핵 포함 된 슬라이드 수 이후에 관심사의 단백질에 항 체와 immunostained 또는 실버 얼룩, 대상이 되며 다음 현미경으로 분석. 메서드는 수정 여성 쥐2에 대 한 설명 되었습니다 비록 둘 다 남성과 여성 쥐에 대 한 유사. 그것은 overmince seminiferous tubules를 하지 중요 합니다. 핵 해야 합니다 또한 잘 확산 될 immunostaining homologs 다음 있도록 하 고 관련된 단백질 현미경으로 명확 하 게 볼 수 있습니다. 표면 확산 핵 불과 몇 시간에 어느 immunostained 즉시 준비 하거나 3 주 전에 해빙 및 immunostaining의 최대-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 그러나, 어떤 단백질에 대 한 최적의 결과 가져옵니다 가장 immunostaining 즉시 또는 표면 확산 핵 준비 2 주 이내에 수행 되는 경우. 슬라이드, 관심사의 단백질에 항 체를 사용 하 여 표준 프로토콜 immunostained 수 뒤에 2 차 항 체에 형광 활용된 단백질 또는 염료, 부 화 후 형광 현미경8군데. 출생 후 하루 15-21에서 6-10 슬라이드를 야생 타입 testes의 쌍 당 충분 한 조직 그리고 더 오래 된 쥐 (성인 포함) 더 많은 슬라이드를 얻을 것입니다. 그러나, 강포한 유형 쥐 6 주 동안 얻을 것입니다 또한 immunostaining 다음 슬라이드에 더 포스트 meiotic 세포 (예: spermatids). 또한, 의향의 모든 substages 내가 관찰할 수 있습니다 청소년과 성인 쥐에서. 출생 후 일 15 10 남성에서 고환 많은 leptotene 및 zygotene 셀을 얻을 것입니다. 쥐 출생 후 하루 14 ~ 15 보다 오래 된 pachytene 및 diplotene 핵을 더 얻을 것입니다.
여기 우리가 설명 하 고 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 널리 사용 방법을 보여 줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

포유류의 감수 분열은 생식 세포에서 발생 하 고 공부 하 고 수 있는 특징 동적 개발 프로세스입니다. 메서드를 사용 하 여 슬라이드의 표면에 핵 확산 (보다는 오히려 그들에서 떨어지는 높이), 마우스 spermatocytes에 1997 년에 처음으로 설명 했다는 최적화 된 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 널리 이용 되는 고품질 핵 겪고 I. Seminiferous 의향의 substages의 과다 생성 때문에 포유류 감수 분열을 공부 하는 실험실에서 tubules 먼저 spermatocytes를 소형 솔루션에 배치 됩니다. 다음 spermatocytes를 만드는 세포 현 탁 액, 자당 솔루션으로 출시 되 고 핵 정착 액 젖 유리 슬라이드에 전파 됩니다. Immunostaining, 다음 meiotic 프로세스에 밀접 한 단백질의 다양성 시험 될 수 있다. 예를 들어 synaptonemal 복잡 한, homologs의 염색체 축/코어를 함께 연결 하는 3 자간 구조의 단백질은 쉽게 구상 될 수 있다. Meiotic 재결합 단백질, 동종 재결합에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 수리에 관련 된, 또한 의향의 진행을 평가 하는 immunostained 수 나. 여기 우리가 설명 하 고 자세하게에서 설명 널리 spermatocytes 청소년 이나 성인 남성 생쥐에서의 포유류 감수 분열을 공부 하는 기술.

많은 수의 표면 그대로 homologs를 포함 하는 핵 확산을 제공 하는이 방법의 능력 세 가지 주요 요인에 따라 달라 집니다: 1) 소형 버퍼 (즉 히)를 적절 하 게에서 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간 부 어 spermatocyte 버스트에서 분해 하지 않는 핵 히, 2 부 화 연장) micropipetting 함께, clumped는 핵 3 분리 중단을 얻기 위해 셀의 자당 방울) 한 번에 한 방향으로 슬라이드 코팅 각 정?...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

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11.7K 조회수.  Drexel University College of Medicine. 감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

연구

생물학

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

항체 라벨링에 대한 Drosophila Polytene의 염색체 Squashes의 준비

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

배양 세포에서 염색체 준비

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

식물에서 물고기에 적합한 빠른 공기 건조 떨어 뜨리 염색체 제조 방법

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.