Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
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저자 애비 해리스의 기술 지원을 인정 한다. 그들은 또한 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 프로토콜을 최적화 하는 데 도움에 대 한 폴라 코헨과 김 웨이 인정 합니다. 저자는 또한 중요 한 독서의 카 렌 쉰들러에 의해 원고를 주셔서 감사합니다.
이 작품은 NIH R01 GM106262 K.M.B.에 의해 지원 되었다

쥐를 포함 하는 모든 방법을 활용 높은 윤리 및 복지 표준, 그리고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Drexel 대학 대학의과 대학에 의해 승인 했다.
1입니다. 솔루션 및 필요한 악기의 준비
<ol><li>초순 실험실 급료 물, pH 8.2-8.4 (표 1) 50 mL에 소형 추출 버퍼 (히)를 준비 합니다. 신선한 때마다, 얼음, 유지 하 고 확산; 준비의 2 시간 이내 사용 솔루션 이것은 줄이고 각각 DTT와 PMSF의 활동을 억제 하는 효소를 최적화 해야 합니다. 히의 10 mL를 사용 하 여 마우스 testes의 각 쌍에 대 한.</li>
	<li>학년 물 초순 실험실의 10 mL에 자당의 0.342 g를 추가 하 여 100 mM 자당 솔루션 (신선한 각 시간)을 준비 합니다. 8.2에 pH를 조정</li>
	<li>통 솔루션 준비 (1 %paraformaldehyde (PFA), 0.15% 트라이 톤 X-100, pH 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 조정) 신선한 월별와 스토어 실내 온도에 그것은 빛 으로부터 보호. 작업 사진으로 사용 하기 위해 1 X PBS에서 4%로 16% 상용 PFA 시작 재고 희석 하 고 후-20 ° c.에 4 %aliquots 저장<ol>
<li>통 솔루션을 준비 하려면 추가 4 %PFA 솔루션의 10 mL와 10%의 600 µ L 트라이 톤 X-100 1 X PBS의 30 mL를 섞어 잘, 그리고 9.2 1 N HCl 또는 1 N NaOH로 pH를 조정. (더 이상 4 주)에 대 한 실 온에서 알루미늄 호 일에 싸여 50 mL 원뿔 튜브에 통 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포토 플로 200 세척 솔루션 (해당 되는 동안 슬라이드 마지막 30 분 건조) 준비: 0.4% 포토 플로 200/PBS (320 µ L 포토 플로 200의 1 X PBS의 80 ml에서) 및 0.4% 포토 플로 200/dH2O (160 µ L 포토 플로 200 초순 실험실 급료 물 40 mL에). 가득한 솔루션의 40 mL 50 mL Coplin jar를 사용 하 여 한 번에 10 개 이하의 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>다음 악기를 준비: 1 켤레 (피부 incise)을 수술가 위, 좋은 팁 (incise 복)을 수술가 위의 1 개 쌍 (각 고환 개 해 부)를 바로 좋은 팁 겸, 2 쌍 1 똑 바른 가장자리 면도기 블레이드 (각 고환 incise), 2 쌍의 곡선 (각 고환 고정을 짜 seminiferous tubules) 팁 집게, 50 mL Coplin 항아리, 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드, 크기 11 블레이드, 습도 챔버, 100 x 15 mm 페 트리 접시, 좋은 팁 영구 마커 또는 연필, 1 메스와 플랫폼 회전 통입니다.<ol>
<li>충전된 장소 프리미엄 통 솔루션 사용까지 가득 50 mL Coplin jar에 똑바로 두르고 끝 유리 슬라이드 precleaned. 참고: 연필 슬라이드 에탄올, 형광 제자리에서 교 잡 등을 요구 하는 절차에서 이후에 사용 하는 경우 기본 설정입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. spermatocyte 핵 확산
<ol><li>기관 지침 (또는 CO2 질 없이 예: 자 궁 경부 전위)에 따라 남성 마우스 안락사</li>
	<li>사용 P10-P20 남성 spermatogenesis;의 물결 meiotic 세포 평가 하 우리는 일상적으로 사용 P15-의향 I. 성인 testes 제공의 모든 substages에서 세포를 얻기 위해 P17 남성 의향에서 세포 나도, 하지만 그들은 또한 spermatids와 같은 더 postmeiotic 셀을 얻을 것입니다.</li>
	<li>수확 및 무게 testes (짝된 무게 기록); 그런 다음 그들을 축축한 유지를 추운 히 몇 방울을 포함 하는 배양 접시에 배치 합니다.</li>
	<li>고환 접시의 바닥에 대 한 곡선된 팁 집게로 누른 직선 가장자리 면도기 블레이드는 고환의 캡슐을 통해 작은 수직 중간 절 개를 사용 하 여. 여전히 한 집게와 접시의 바닥에는 고환 잡고, 곡선된 팁 집게 또는 직선 모서리 면도날의 두 번째 집합을 사용 하 여 부드럽게는 고환에서 seminiferous tubules를 짠 다.<ol>
<li>찬 히, 캡슐의 튜브에 않도록 하기 위해 돌의 10 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에는 tubules를 놓습니다. 두 번째 고환이이 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포함 하는 고환의 크기에 따라 30-60 분 동안 얼음에 히 원뿔 튜브에 decapsulated seminiferous tubules를 품 어. 한 쌍의 고환 무게 30 mg에서 seminiferous tubules를 품 어 이하로 30 분, 60 분에 대 한 30-45 분, 그리고 큰 고환에 대 한 31 ~ 50 밀리 그램을 무게 testes의 쌍에서 tubules. 하나의 고환에 대 한 시간을 변경 하지 않습니다. 참고: 최적의 부 화에 실험, 사용, 시 약 및 분석 되는 쥐의 경험에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>Seminiferous tubules 히에 잠복기는, 하는 동안 마커 또는 연필 마우스 precleaned 슬라이드의 서리로 덥은 끝 번호, 슬라이드 번호 및 날짜를 사용 합니다. 다음 통 솔루션이 포함 된 Coplin jar에 미리 청소 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>부 화, 다음 깨끗 한 Petri 접시와 약 3 m m 직경 수 풀에 별도 tubules tubules와 히를 붓는 다. 각 덩어리 생성 2 슬라이드 하 고 굴복 하는 슬라이드 수 고환의 크기에 따라 다릅니다. 참고: 우리는 야생 타입 subfertile Chtf18에서 6 슬라이드에서 8 슬라이드 얻을-P16 testes (있는) meiotic mitotic 세균 세포8의 감소 숫자로 인해 작은 null. 한 성인 고환 100 밀리 그램 이상의 무게 16 슬라이드를 예상 될 것 이다.</li>
	<li>테 플 론의 한 반지로 100mm 자당 솔루션의 장소 23 µ L 인쇄, 3 슬라이드 링 반지 seminiferous tubules의 한 덩어리를 추가.  다음을 사용 하 여 곡선 팁 겸 덩어리를 잡고, 부드럽게 솔루션 흐린 될 때까지 크기 11 면도날으로 tubules를 말하다. 참고:이 조각난된 염색체에 발생 overmince 하지 않습니다. Note 조각난된 염색체 돌연변이 표현 형을 나타내는 수도 수 있습니다.</li>
	<li>이물질 제거, 자당 솔루션의 또 다른 23 µ L을 추가 하 고는 micropipette를 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 혼합물을 위아래로 몇 번 하는 정지에서 세포를 분리 하는 데 도움이.</li>
	<li>포함 된 통 솔루션 Coplin jar에 몸을 담글 슬라이드를 제거 하 고 그 하나의 관대 한 방울 슬라이드의 하단 모서리에서 수집 그래서 항아리에 슬라이드를 기울기.<ol>
<li>피펫으로 20 µ L 프리미엄 통 물방울에 테 플 론 인쇄 3 링 슬라이드의 반지에서 자당 세포 현 탁 액의 젖 빛 유리 슬라이드, 그리고 피펫으로 위아래로 2-서 스 펜 션 3 번. 참고: 통 방울 되어야 합니다 볼륨에 충분히 큰 그래서 그것에 자당 세포 현 탁 액의 20 μ의 추가 허용 범위 전체 슬라이드에 걸쳐 혼합물 (2.11 아래 참조) 전염 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>천천히 기울기 확산 슬라이드의 길이 따라 세포 현 탁 액을 방울 반대 측면에 슬라이드. 다음 슬라이드를 천천히 기울기 다시 완전히 커버 슬라이드의 너비를 따라 세포 현 탁 액을 확산. 슬라이드 보다 더 한 번 그렇지 않으면 셀 서로 겹칠 것의 동일한 지역에 정지를 확산 하지 마십시오.</li>
	<li>즉시 슬라이드 습도 챔버에 평평 하 게 놓고 반복 단계 2.8 2.11 seminiferous tubules의 모든 대단히 짧은 시간까지 슬라이드를 만들기 위해 사용 되었습니다. 그것은 찢 어과 셀 중복을 피하기 위해 건조 과정에서 습도 챔버를 이동 하지 해야 합니다.</li>
	<li>그들은 천천히 하 고 완전히 건조 되도록 2.5 h에 대 한 실 온에서 덮여 습도 챔버에 품 어를 슬라이드 수 있습니다. 높은 습도 및이 단계에서 느린 건조는 chromatin의 적절 한 확산 되도록 중요 하다. 그리고 챔버의 커버를 제거 슬라이드 추가 30 분 완전히 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>슬라이드 (다시 뒤로 또는 지그재그 패턴) 0.4% 포토 플로 200/1 X PBS 솔루션 포함 Coplin jar에 고는 슬라이드를 두 번, 5 분을 세척, 부드럽게는 Coplin agitating, 통을 회전 하는 플랫폼에 항아리. 각 세척에 대 한 신선한 솔루션을 사용 하 고는 세척의 각각에 대해 별도 항아리에 다른 마우스에서 슬라이드를 계속.</li>
	<li>교 반 하면서 한 번 포함 하는 5 분 동안 0.4% 포토 플로 200/dH2O 솔루션 Coplin jar에 슬라이드를 씻어.</li>
	<li>제거 슬라이드는 Coplin jar (마지막 세척), 신중 하 게 하 게 가장자리와 과잉 액체를 제거 하는 슬라이드의 바닥 닦아 하 고 건조 각도, 거의 직 립 위치에 슬라이드를 배치. 이 기술에 능숙 한 실험 자 수 처리 하 고 하루에 4 또는 5 쥐에서 표면 확산 핵을 준비.</li>
	<li>일단 건조 (15-20 분), 즉시 면역 형광 염색 법 또는-80 ° c 최대 3 주에 대 한 빛에서 보호 된 단단히 닫은 슬라이드 상자에서 저장소에 대 한 슬라이드를 처리 (; 평가 대상 단백질에 따라 최적의 결과 얻을 수 있습니다 경우 스테인드 같은 일 또는 2 주 이내).<ol>
<li>-80 ° C에 저장 하는 경우 다음에 실내 온도와 서 얼룩이 지기 전에 5 분 동안 1 Coplin jar에 X PBS 또는 블록 세척 슬라이드 수 있습니다. 참고: 많은 다른 면역 형광 얼룩 프로토콜; 좋은 결과 제공할 것입니다. immunostaining 프로토콜8버코위츠 외.를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

저자는 공개 없다.

잘 확산, 좋은 품질 spermatocyte 핵의 높은 번호를 얻을,이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 히, 적절 한 seminiferous tubules의 닦지 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간을 포함 하 고 기술을 고용 통 코팅된 슬라이드에 자당 세포 현 탁 액 분산. 우리는 testes comparably 세 Chtf18에서 45 분, HEB에서 성인 기에 출생 후 하루 15에서에서 배열 하는 야생 타입 남성의 고환에서 seminiferous tubules를 품 어-null 생쥐...

마우스는 포유류에서 감수 분열을 연구 모델 생물으로 광범위 하 게 사용 됩니다. 정상적인 발달 과정 및 감수 분열 중 발생 하는 결함을 평가할 수 있습니다. 타임 라인 및 의향 어 substages, 하는 동안 발생 하는 돌출 하는 특징의 진행으로 다양 한 특정 단백질 감수 분열의 규칙에 중요 한 프로세스에 관련 된 야생 유형 및 돌연변이 생쥐에서 특징 수 있습니다. 내가 (헨델과 Schimenti1검토) 세부에서 공부 될 수 있다 감수 분열 중 발생 하는 몇 가지 특수 프로세스. DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 형성 및 수리, 재결합, synaptonemal 복잡 한 형성 및 염색체 분리 포함 됩니다.
Meiotic 프로세스의 중요 한 측면은 핵 시각과 광학 해결 되어 더 나은 포함 동종 염색체 구별 하 고 식별 의향 5 substages는 이루어져 I. 의향의 substages를 검사 하는 능력 그 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 형성을 포함 하 여 특정 기능에 의해 특징. 사우스 캐롤라이나는 페어링 있도록 자간 단백질 비 계 및 homologs의 DNA 이중 가닥 브레이크 수리. Leptonema, 동안 homologs는 SC의 축 요소 답니다로 맞춥니다. 다음 zygonema 중 synaptonemal 복잡 한 중앙 요소 첨부 파일 homologs의 쌍 사이 연결 및 물리적 연결을 (synapsis)을 촉진 한다. Pachynema, 동안 homologs의 synapsis 완료 되 고 DNA 크로스 동종 재결합을 통해 DNA 두 배 물가 틈의 선택 인구의 수리에서 형성 된다. 사우스 캐롤라이나 동안에 diplonema, homologs desynapse 하지만 그들의 centromeres, DNA 크로스의 사이트에 연결 된 남아 있도록 디스어셈블 합니다. 마지막으로 동안에 diakinesis, homologs recondense 그리고 분열에 전환1.
역사적으로, 특히 그 의향의 초기 단계에서 몇 가지 핵 나왔고 meiotic chromatin의 표면 확산 나2. 결과적으로, 이러한 방법은 조직 즉 고환 (난소)에서 세포의 분리, 확산 meiotic chromatin의 기술과 높은 품질 meiotic 핵 평가2,3, 의 수확량을 개선 하기 위해 수정 된 4. 또한,이 방법은 핵 보존에 유용 하 게 입증 하 고 chromatin meiotic 핵에서 단백질 바인딩 같이 게시 된 immunolocalization 기법5,,67. 메서드를 처음 피터 스2 로 설명 하 고 시연 여기 수익률 겪고 의향의 leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, 및 diakinesis substages homologs를 포함 하는 많은 별도 버스트 spermatocyte 핵 따라서, 내가.
표면 확산 핵 (chromatin 확산 분석이 라고도 함)을 준비 하는 기술은 감수 분열 생식과 세포 생물학의 분야에서 연구에 널리 사용 됩니다. 표면 확산 핵 포함 된 슬라이드 수 이후에 관심사의 단백질에 항 체와 immunostained 또는 실버 얼룩, 대상이 되며 다음 현미경으로 분석. 메서드는 수정 여성 쥐2에 대 한 설명 되었습니다 비록 둘 다 남성과 여성 쥐에 대 한 유사. 그것은 overmince seminiferous tubules를 하지 중요 합니다. 핵 해야 합니다 또한 잘 확산 될 immunostaining homologs 다음 있도록 하 고 관련된 단백질 현미경으로 명확 하 게 볼 수 있습니다. 표면 확산 핵 불과 몇 시간에 어느 immunostained 즉시 준비 하거나 3 주 전에 해빙 및 immunostaining의 최대-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 그러나, 어떤 단백질에 대 한 최적의 결과 가져옵니다 가장 immunostaining 즉시 또는 표면 확산 핵 준비 2 주 이내에 수행 되는 경우. 슬라이드, 관심사의 단백질에 항 체를 사용 하 여 표준 프로토콜 immunostained 수 뒤에 2 차 항 체에 형광 활용된 단백질 또는 염료, 부 화 후 형광 현미경8군데. 출생 후 하루 15-21에서 6-10 슬라이드를 야생 타입 testes의 쌍 당 충분 한 조직 그리고 더 오래 된 쥐 (성인 포함) 더 많은 슬라이드를 얻을 것입니다. 그러나, 강포한 유형 쥐 6 주 동안 얻을 것입니다 또한 immunostaining 다음 슬라이드에 더 포스트 meiotic 세포 (예: spermatids). 또한, 의향의 모든 substages 내가 관찰할 수 있습니다 청소년과 성인 쥐에서. 출생 후 일 15 10 남성에서 고환 많은 leptotene 및 zygotene 셀을 얻을 것입니다. 쥐 출생 후 하루 14 ~ 15 보다 오래 된 pachytene 및 diplotene 핵을 더 얻을 것입니다.
여기 우리가 설명 하 고 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 널리 사용 방법을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Teflon printed 3 ring slides</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>Premium uncharged frosted end glass slides</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td></tr><tr><td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Straight fine tip forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Curved medium tip forceps</td><td>Fisher</td><td>16100110</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Different brand of a similar type will work</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Use at 1:300</td></tr><tr><td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-234-0001</td><td>Use at 1:50</td></tr><tr><td>Humidified chamber</td><td></td><td></td><td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td></tr><tr><td>Widefield microscope with epifluorescence</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>Any standard model</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Several commercial brands</td><td></td><td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td></tr></tbody></table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

포유류의 감수 분열은 생식 세포에서 발생 하 고 공부 하 고 수 있는 특징 동적 개발 프로세스입니다. 메서드를 사용 하 여 슬라이드의 표면에 핵 확산 (보다는 오히려 그들에서 떨어지는 높이), 마우스 spermatocytes에 1997 년에 처음으로 설명 했다는 최적화 된 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 널리 이용 되는 고품질 핵 겪고 I. Seminiferous 의향의 substages의 과다 생성 때문에 포유류 감수 분열을 공부 하는 실험실에서 tubules 먼저 spermatocytes를 소형 솔루션에 배치 됩니다. 다음 spermatocytes를 만드는 세포 현 탁 액, 자당 솔루션으로 출시 되 고 핵 정착 액 젖 유리 슬라이드에 전파 됩니다. Immunostaining, 다음 meiotic 프로세스에 밀접 한 단백질의 다양성 시험 될 수 있다. 예를 들어 synaptonemal 복잡 한, homologs의 염색체 축/코어를 함께 연결 하는 3 자간 구조의 단백질은 쉽게 구상 될 수 있다. Meiotic 재결합 단백질, 동종 재결합에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 수리에 관련 된, 또한 의향의 진행을 평가 하는 immunostained 수 나. 여기 우리가 설명 하 고 자세하게에서 설명 널리 spermatocytes 청소년 이나 성인 남성 생쥐에서의 포유류 감수 분열을 공부 하는 기술.

많은 수의 표면 그대로 homologs를 포함 하는 핵 확산을 제공 하는이 방법의 능력 세 가지 주요 요인에 따라 달라 집니다: 1) 소형 버퍼 (즉 히)를 적절 하 게에서 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간 부 어 spermatocyte 버스트에서 분해 하지 않는 핵 히, 2 부 화 연장) micropipetting 함께, clumped는 핵 3 분리 중단을 얻기 위해 셀의 자당 방울) 한 번에 한 방향으로 슬라이드 코팅 각 정?...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

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Meiosis

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11.7K 조회수.  Drexel University College of Medicine. 감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

연구

발생학

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Chromatin 확산 마우스 Oocyte 진행 의향에서 분열 II의 분석에 대 한 준비

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

유전학

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

제브라피쉬 정자세포에서 메오틱 염색체 스프레드 의 준비

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotyping를위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 확산 준비

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

생물학

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

표준 실험실 장비를 사용하여 마우스 고환에서 파키텐 정자 세포와 정자의 농축

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

<meta charset="utf8"></head><body>배아 발달을 연구하기 위한 Murine Round Spermatid Injection Procedure

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>마우스 라운드 Spermatid 주입

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

마우스 라운드 Spermatid 주입

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...