Los autores reconocen la asistencia técnica de Abigail Harris. También reconoce Paula Cohen y Kim Holloway para ayudar a optimizar el protocolo de preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón. Los autores también aprecian la lectura crítica del manuscrito por Karen Schindler.
Este trabajo fue financiado por los NIH R01 GM106262 a K.M.B.

Todos los métodos de ratones utilizaron alta ética y estándares de bienestar y fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en Drexel University College of Medicine.
1. preparación de soluciones y de instrumentos necesarios
<ol><li>Preparación de Buffer de extracción hipotónica (HEB) en 50 mL de agua de laboratorio ultrapura grado, pH 8.2-8.4 (tabla 1). Hacer la solución fresca cada vez, mantener en hielo y usar dentro de 2 h de la preparación de extensiones; Esto es necesario para optimizar la reducción y la proteasa inhibidora actividades de TDT y PMSF, respectivamente. Utilizar 10 mL de HEB para cada par de testículos de ratón.</li>
	<li>Preparar una solución de sacarosa 100 mM (fresco cada vez) mediante la adición de 0,342 g de sacarosa por 10 mL de laboratorio ultrapura grado agua. Ajustar el pH a 8.2</li>
	<li>Preparar solución de fijación (1% paraformaldehido (PFA), 0.15% Tritón X-100, pH ajustado a 9.2 con 1 N HCl o NaOH N 1) mensuales frescos y almacenar a temperatura ambiente protegido de la luz. Diluir un stock inicial de comercialmente disponible 16% PFA al 4% de 1 X PBS para el uso como un trabajo y luego guardar alícuotas de 4% a-20 ° C.<ol>
<li>Para preparar la solución fijadora, añadir 10 mL de solución 4% de la PFA y 600 μl de 10% Tritón X-100 a 30 mL de 1 X PBS, mezclar bien y ajustar el pH a 9.2 con 1 N HCl o NaOH N 1. Almacenar la solución fijadora en un tubo cónico de 50 mL, envuelto en papel de aluminio a temperatura ambiente (de no más de 4 semanas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar soluciones de lavado (mientras que las diapositivas están secando los últimos 30 minutos) con foto-Flo 200: 0,4% foto-Flo 200/PBS (320 μl de Photo-Flo 200 en 80 mL de 1 X PBS) y 0.4% foto-Flo 200/dH2O (160 μl de Photo-Flo 200 en 40 mL de agua de laboratorio ultrapura grado). Use una jarra de Coplin de 50 mL con 40 mL de soluciones para lavar 10 o menos diapositivas a la vez.</li>
	<li>Preparar los siguientes instrumentos: 1 par de tijeras quirúrgicas (que haga una incisión en la piel), 1 par de tijeras quirúrgicas de punta fina (al incidir el peritoneo), 2 pares de pinzas de punta fina recta (a diseccionar a cada testículo), 1 borde recto hoja de afeitar (para incidir cada testículo), curva de 2 pares de pinzas de punta (para inmovilizar cada testículo y exprimir hacia fuera de los túbulos seminíferos), 50 mL frascos Coplin, Teflon imprime diapositivas de anillo 3, 1 bisturí con hoja de tamaño 11, cámara humidificado, platos de Petri 100 x 15 mm, marcador permanente de punta fina o un lápiz y una agitador rotatorio de la plataforma.<ol>
<li>Premium de lugar sin cargar prefiltrado portaobjetos esmerilado final vertical en un frasco de Coplin 50 mL llenada con solución fijadora hasta su uso. Nota: El lápiz es preferible si diapositivas se utilizará posteriormente en los procedimientos que requieren etanol, tales como hibridación en situ de la fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. núcleos de espermatocito separarse
<ol><li>Eutanasia a un ratón macho según las pautas (por ejemplo, la dislocación cervical con o sin CO2 asfixia).</li>
	<li>Uso P10 - P20 machos para evaluar células meióticas en la primera onda de la espermatogénesis; rutinariamente utilizamos P15 - P17 los machos para obtener las células de los subestadios de profase I. proporcionarán los testículos adultos células de profase I demasiado, pero también producirá células más postmeiotic, como espermátides.</li>
	<li>Cosecha y pesan los testículos (registrar los pesos pares); luego colocarlos en una placa Petri que contenga unas gotas de frío HEB para mantenerlos húmedos.</li>
	<li>Sostenga el testículo contra el fondo del plato con unas pinzas de punta curva y utilizar una cuchilla de filo recto para hacer una incisión del midline vertical pequeño a través de la cápsula del testículo. Manteniendo todavía los testículos contra el fondo del plato con una pinzas, utilice un segundo conjunto de pinzas de punta curva o cuchilla de filo recto para apretar suavemente los túbulos seminíferos del testículo.<ol>
<li>Coloque los tubos en un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de HEB fría, teniendo cuidado con poner piezas de la cápsula en el tubo. Repita estos pasos con el segundo testículo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar los túbulos seminíferos decapsulated en el tubo cónico que contenga HEB en hielo por 30-60 min, dependiendo del tamaño de los testículos. Incubar los tubos seminíferos de un par de testículos pesa 30 mg o menos por 30 min, los túbulos de un par de testículos, peso de 31 a 50 mg de 30-45 minutos y los testículos más grandes durante 60 minutos. No alteran los tiempos de un solo testículo. Nota: El tiempo de incubación óptimo puede variar dependiendo de la experiencia del experimentador, los reactivos usados y los ratones se analiza.</li>
	<li>Mientras que los túbulos seminíferos están incubando en HEB, utilice un lápiz o marcador para etiquetar los extremos helados de prefiltrado diapositivas con el ratón, número de diapositiva y fecha. Luego coloque las diapositivas previamente limpiadas en una jarra de Coplin conteniendo la solución fijadora.</li>
	<li>Tras incubación, vierta los túbulos y HEB en una caja de Petri limpia y túbulos separados en unos grupos de diámetro de 3 mm. Cada grupo da 2 toboganes, y el número de diapositivas dado depende del tamaño de los testículos. Nota: Obtenemos 8 diapositivas de tipo salvaje y las 6 diapositivas de subfertilidad Chtf18-null P16 testículos (que son más pequeños debido a disminución de las células germinales meióticas y mitóticas8). Testículo adulto un peso de 100 mg o más se espera para producir 16 diapositivas.</li>
	<li>Lugar 23 μl de solución de sacarosa 100 mM en un anillo de un Teflon impreso, 3 anillo de la diapositiva y agregar un grupo de túbulos seminíferos con el anillo.  Entonces usando curva Punta pinzas para sujetar la masa, picar suavemente los túbulos con una cuchilla de afeitar 11 de tamaño hasta que la solución se vuelva turbia. Nota: No overmince como resultado cromosomas fragmentados. Tenga en cuenta que los cromosomas fragmentados también podrían ser indicativos de un fenotipo mutante.</li>
	<li>Eliminar los residuos, añadir otro 23 μl de solución de sacarosa y utilice una micropipeta para suavemente pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para ayudar a separar las células en la suspensión.</li>
	<li>Eliminar una diapositiva en la jarra de Coplin conteniendo solución de fijación e inclinar el portaobjetos sobre la jarra para una gota generosa se recoge en la parte inferior de la diapositiva.<ol>
<li>Pipetear 20 μl de la suspensión celular de sacarosa del anillo de la diapositiva de impresos 3 anillo de teflón a la gota fijadora en un premium mate portaobjetos de vidrio y pipetear la suspensión hacia arriba y abajo 2 - 3 veces. Nota: Debe ser lo suficientemente grande en volumen la gota fijadora para que además de 20 μL de la suspensión de células de sacarosa permite cobertura en toda la diapositiva entera cuando la mezcla se extiende (ver 2.11 abajo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lentamente incline la diapositiva al lado opuesto de la gota para extender la suspensión de células a lo largo de la longitud de la diapositiva. Luego lentamente incline la corredera atrás para extender la suspensión de células a lo largo de la anchura de la corredera para cubrirlo totalmente. Evitar la propagación de la suspensión sobre la misma área de la diapositiva más de una vez lo contrario, que las células se superpondrán entre sí.</li>
	<li>Inmediatamente Coloque el portaobjetos en una cámara humidificada y repetir pasos 2.8 a 2.11 hasta los grupos de los túbulos seminíferos se han utilizado para hacer diapositivas. Es importante no mover la cámara humidificada durante el proceso de secado para evitar desgarro y superposición de las células.</li>
	<li>Deje que los portaobjetos se incuban en una cámara humidificada cubierta a temperatura ambiente durante 2,5 h para que seque lentamente y no totalmente. Alta humedad y secado lento en este paso están importantes para asegurar la difusión adecuada de la cromatina. Luego retire la tapa de la cámara y permita que el portaobjetos se seque al aire completamente un adicional 30 minutos.</li>
	<li>Diapositivas (espalda con espalda o en forma de zigzag) en una jarra de Coplin que contenga 0,4% foto-Flo 200/1 X PBS solución y lave el portaobjetos dos veces, 5 minutos cada uno, por agitar suavemente el recipiente del tarro en una plataforma giratoria coctelera. Utilizar solución fresca para cada colada y diapositivas de diferentes ratones en frascos separados para cada uno de los lavados.</li>
	<li>Lave los portaobjetos en una jarra de Coplin conteniendo 0.4% foto-Flo 200/dH2O solución durante 5 minutos una vez cuando agitándola.</li>
	<li>Retirar los portaobjetos del Coplin jar (último lavado), con cuidado Limpie los bordes y fondos de las diapositivas a eliminar el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en posición inclinada, casi vertical, para secar. Un experimentador que domina esta técnica puede procesar y preparar superficie propagación núcleos de 4 o 5 ratones en un día.</li>
	<li>Una vez seco (15-20 min), proceso de diapositivas inmediatamente para tinción de inmunofluorescencia o tienda a-80 ° C en una caja de diapositivas bien cerrados protegida de la luz para un máximo de 3 semanas (dependiendo de las proteínas blanco evaluadas; resultados óptimos se pueden obtener si mancharon el mismo día o dentro de 2 semanas).<ol>
<li>Si se almacenan a-80 ° C, luego deje que el portaobjetos se llegue a temperatura ambiente y lavado en un frasco de Coplin conteniendo 1 X PBS o bloque 5 min antes de la tinción. Nota: Muchos protocolos de tinción de inmunofluorescencia diferentes proporcionará buenos resultados; Consulte a Berkowitz et al. de immunostaining protocolo8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para obtener un número elevado de núcleos de espermatocito bien extendidas, buena calidad, los pasos más críticos de este protocolo incluyen el tiempo de incubación apropiados de los túbulos seminíferos en HEB, apropiado picado de túbulos seminíferos, y la técnica empleada para distribuyen la suspensión de células de sacarosa en el fijador diapositivas revestido. Incuban los túbulos seminíferos de los testículos de los machos de tipo salvaje desde día postnatal 15 a la edad adulta en HEB por 45 min, mient...

Ratones se utilizan extensivamente como un organismo modelo para el estudio de meiosis en mamíferos. Pueden evaluar los procesos de desarrollo normales y defectos que ocurren durante la meiosis. El cronograma y la progresión de las características salientes que ocurren durante la profase I y subetapas, así como una multitud de proteínas específicas implicadas en procesos cruciales para la regulación de la meiosis se caracteriza en el tipo salvaje y mutantes ratones. Varios procesos especializados que ocurren durante la meiosis que puedo estudiarse en detalle (revisado en Handel y Schimenti1). Estos incluyen formación de rotura de doble cadena (DSB) de DNA y reparación, recombinación, formación del Complejo Sinaptonémico y segregación cromosómica.
Un aspecto importante del estudio de procesos meióticas es la capacidad de examinar los núcleos que contienen cromosomas homólogos que son visualmente y ópticamente decidieron mejor distinguieran e identifican las subetapas de la profase I. profase se compone de 5 subestadios se caracterizan por rasgos específicos incluyendo la formación del Complejo Sinaptonémico (SC). El SC es un andamio de proteína tripartita que permite sincronización y reparación de rotura de doble cadena de ADN de homólogos. Durante leptonema, homólogos alinean elementos axiales de la SC están establecidas. Entonces fijación de elementos centrales del Complejo Sinaptonémico durante zygonema facilita la sincronización y física conexión (sinapsis) entre pares de homólogos. Durante pachynema, synapsis de homólogos se convierte completo y cruces de ADN están formadas por reparación de una población selecta de roturas de doble cadena de DNA mediante recombinación homóloga. La SC se desarma en diplonema, permitiendo homólogos desynapse pero permanecer unido en sus centrómeros y en sitios de cruces de ADN. Finalmente durante la diacinesis, homólogos recondensen y la transición a la metafase produce1.
Históricamente, superficie-que se separa de la cromatina meiótica rindió pocos núcleos, especialmente los de las primeras etapas de la profase I2. Como resultado, estos métodos fueron modificados para mejorar la separación de las células de los tejidos (ovario o testículo), la técnica de la que se separa la cromatina meiótica y la producción de núcleos meiótica de alta calidad para evaluación2,3, 4. Además, este método demostró para ser útil en la preservación de nuclear y la cromatina encuadernado proteínas en núcleos meióticas según lo demostrado por técnicas de inmunolocalización publicado5,6,7. Por lo tanto, el método inicialmente descrito por Peters2 y demostrado aquí rendimientos muchos núcleos de espermatocito ráfaga separadas con homólogos en el leptoteno, anfiteno, paquiteno, diploteno y diacinesis subetapas de la profase I.
La técnica de preparación de núcleos de extensión de superficie (también llamados análisis de propagación de la cromatina) es ampliamente utilizada para el estudio de meiosis en los campos de la biología reproductiva y de la célula. Diapositivas que contienen núcleos de extensión de la superficie pueden ser posteriormente immunostained con anticuerpos a las proteínas de interés o sometidos a tinción de plata y luego analizan con microscopia. El método es similar para los ratones masculinos y femeninos, aunque se han descrito modificaciones para ratones hembra2. Es crucial no overmince los túbulos seminíferos. Núcleos deben también bien transmitirse para que tras inmunotinción homólogos y las proteínas asociadas claramente se observan con microscopia. Núcleos de extensión de la superficie pueden ser preparados en tan sólo unas horas y ya sea immunostained inmediatamente o almacenados a-80 ° C durante un máximo de 3 semanas antes de la descongelación y el immunostaining. Sin embargo, obtener resultados óptimos se obtienen mejor para algunas proteínas si inmunotinción se realiza inmediatamente o dentro de 2 semanas de preparación de núcleos de extensión de la superficie. Diapositivas pueden ser immunostained con un protocolo estándar usando los anticuerpos a las proteínas de interés, seguido por la incubación con anticuerpos secundarios conjugados a fluorescente proteínas o tintes, luego imágenes con fluorescencia microscopía8. En el día postnatal 15-21 hay suficiente tejido por cada par de testículos de tipo salvaje para producir diapositivas 6 a 10, y ratones mayores (incluyendo a adultos) dan más diapositivas. Sin embargo, ratones de tipo salvaje 6 semanas de edad y mayores también producirá más post meiosis células (es decir, espermátidas) en las diapositivas siguientes immunostaining. Además, todos los subestadios de profase puedo observarse en ratones adultos y juveniles. Los testículos de machos en postnatales días 10 al 15, obtendrá muchas más células leptoteno y anfiteno. Mayores de día postnatal 14 a 15 ratones producirá más núcleos paquiteno y diploteno.
Aquí describimos y demostrar un método ampliamente utilizado de la preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Meiosis mamífera es un proceso dinámico del desarrollo que ocurre en las células de germen y puede ser estudiado y caracterizado. Usando un método para extender los núcleos en la superficie del portaobjetos (en lugar de dejarlos caer desde una altura), se demuestra una técnica optimizada en espermatocitos de ratón que primero fue descrita en 1997. Este método es ampliamente utilizado en laboratorios para el estudio de meiosis mamífera porque produce una gran cantidad de núcleos de alta calidad sometidos a subetapas de la profase I. seminíferos túbulos primero se colocan en una solución hipotónica a hincharse espermatocitos. Espermatocitos se lanzan en una solución de sacarosa para crear una suspensión de células y núcleos se extienden sobre portaobjetos de vidrio empapado de fijador. Después de inmunotinción, se puede examinar una diversidad de proteínas relacionadas a los procesos de meiosis. Por ejemplo, las proteínas del Complejo Sinaptonémico, una estructura tripartita que une los ejes de cromosoma/corazones de homólogos pueden visualizarse fácilmente. Las proteínas de la recombinación meiótica, que están implicadas en la reparación de roturas de doble cadena de DNA por recombinación homóloga, pueden también ser immunostained para evaluar la progresión de la profase I. Aquí describimos y mostrar en detalle una técnica ampliamente utilizada para el estudio de meiosis mamífera en espermatocitos de ratones machos jóvenes o adultos.

La capacidad de este método para proporcionar grandes cantidades de superficie de extensión núcleos que contienen homólogos intactos depende de tres factores principales: 1) tiempo de incubación apropiados de los túbulos seminíferos en tampón hipotónico (es decir, HEB) para obtener adecuadamente hinchó espermatocito núcleos que explotaran pero no se desintegran de prolongada incubación en HEB, 2) micropipetting las gotas de sacarosa de las células para obtener una suspensión...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

La meiosis es el proceso de desarrollo por que los gametos se forman a través de una sola ronda de replicación del ADN y dos series sucesivas de segregación cromosómica. Meiosis mamífera pueden examinarse mediante la utilización de una técnica para preparar extensiones de cromosoma meiótico. Aquí, demostramos un método de preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón.

Preparación del cromosoma meiótico se extiende desde ratón espermatocitos

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

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11.7K vistas.  Drexel University College of Medicine. La meiosis es el proceso de desarrollo por que los gametos se forman a través de una sola ronda de replicación del ADN y dos series sucesivas de segregación cromosómica. Meiosis mamífera pueden examinarse mediante la utilización de una técnica para preparar extensiones de cromosoma meiótico. Aquí, demostramos un método de preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón.

Video: Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

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Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Preparación de una sola célula suspensiones de bazo de ratón con el disociador gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

La preparación estandarizada de un solo suspensiones de células de tejido pulmonar de ratón con el disociador gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparación de los cromosomas politénicos de Drosophila Calabazas para el Etiquetado de anticuerpos

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Cromosoma Preparación de las células cultivadas

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Una caída Cromosoma Aire seco Rápido Método de preparación adecuados para FISH en Plantas

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.