Yazarlar Abigail Harris teknik yardım kabul. Onlar da Paula Cohen ve Kim Holloway yüzeyine yayılmış çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama Protokolü optimize etmek için yardımcı olduğunuz için kabul. Yazarlar ayrıca el yazması Karen Schindler tarafından eleştirel okuma için teşekkür ederiz.
Bu eser NIH R01 GM106262 için K.M.B. tarafından desteklenmiştir

Tüm yöntemleri fareler içeren yüksek etik ve sosyal standartları kullanılmaktadır ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite toplantısında Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından kabul edildi.
1. hazırlık çözümler ve gerekli aletleri
<ol><li>Hipotonik ayıklama arabellek (HEB) 50 mL ultrasaf laboratuvar sınıf su, pH 8.2-8.4 (tablo 1) hazırlayın. Taze her zaman buz üzerinde saklayın ve yayılır hazırlama 2 h içinde çözüm olun; Bu azaltmak ve DTT ve PMSF, faaliyetleri sırasıyla inhibe proteaz optimize etmek gereklidir. HEB 10 mL fare testis her çifti için kullanın.</li>
	<li>100 mM Sükroz çözüm (taze her zaman) ultrasaf laboratuvar için 10 mL sukroz 0.342 g ekleyerek sınıf su hazırlamak. 8.2 için pH ayarlama</li>
	<li>Sabitleştirici çözüm hazırlamak (%1 paraformaldehyde (PFA), % 0.15 Triton X-100, 9,2 1 N HCl veya 1 N NaOH ile ayarlanır pH) taze aylık ve mağaza oda sıcaklığında korumalı gelen ışık. Bir % 16 piyasada bulunan İngiltere'de yılın başlangıç hisse senedi 1 X PBS bir çalışma hisse senedi olarak kullanmak için % 4 oranında seyreltin ve % 4 aliquots-20 ° C'de depolayın<ol>
<li>Sabitleştirici çözüm hazırlamak için 10 mL % 4 İngiltere'de yılın çözeltisi ve 600 µL % 10 ekleyin Triton X-100 30 ml 1 X PBS, iyice karıştırın ve pH 1 N HCl veya 1 N NaOH ile 9.2 için ayarlayın. Sabitleştirici çözüm 50 mL konik tüp (en fazla 4 hafta boyunca) oda sıcaklığında alüminyum folyo sarılı saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fotoğraf-Flo 200 (slaytlar son 30 dk kurutma iken) yıkama çözümlerle hazırlamak: %0.4 fotoğraf-Flo 200/PBS (80 ml 1 X PBS fotoğraf-Flo 200 320 µL) ve % 0,4 fotoğraf-Flo 200/dH2O (40 mL ultrasaf laboratuvar sınıf su içinde fotoğraf-Flo 200 160 µL). 10 veya daha az slaytlar teker teker yıkamak için çözümler 40 mL ile dolu bir 50 mL Coplin kavanoz kullanın.</li>
	<li>Cihazlar hazırlamak: Cerrahi makas (Cilt deşmek için), 1 Çift 1 Çift iyi ipucu Cerrahi makas (karın zarını deşmek için), düz ince uç forseps, (her sınav incelemek için) 2 Çift 1 düz kenarlı (her testis deşmek için) jilet, 2 çift eğri (her testis hareketsiz ve seminifer tübüllerin sıkmak için) ipucu forseps, 50 mL Coplin kavanozlar, Teflon basılı 3 halka slaytlar, boyutu 11 bıçak, oksijen odası, 100 x 15 mm Petri yemekler, iyi ipucu kalıcı kalem veya kurşun kalem, 1 neşter ve bir Platform dönen shaker.<ol>
<li>Yer sigorta primi doldurulmamış buzlu sonunda cam slaytlar dik kavanozda kadar kullanmak sabitleştirici çözüm ile dolu 50 mL Coplin precleaned. Not: slaytlar etanol, Floresans in situ hibridizasyon gibi gerektiren işlemler daha sonra kullanılacaksa, kalem tercih edilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. spermatocyte çekirdeği Yayilim
<ol><li>Bir erkek fare (örneğin servikal yerinden çıkması veya CO2 boğulma olmadan) kurumsal yönergelere ötenazi.</li>
	<li>P10 - P20 erkek segregasyonun hücrelere sperma ilk dalga değerlendirmek için kullanın; P15 rutin olarak kullandığımız - hücreleri profaz ı. yetişkin testis sağlayacak tüm substages elde etmek için P17 erkek hücreleri profaz ben de, ama onlar da daha postmeiotic hücreleri, spermatids gibi ortaya çıkarır.</li>
	<li>Hasat ve (eşleştirilmiş ağırlıkları kaydetmek) testis tartmak; o zaman onları nemli tutmak için soğuk HEB birkaç damla içeren bir Petri kabına koyun.</li>
	<li>Testis çanak alt karşı eğri ipucu Forseps ile tutun ve küçük dikey Ensizyon testis kapsül yapmak için düz kenarlı jilet kullanın. Testis çanak alt karşı bir Forseps ile süre hareketsiz tutmak, testislerden seminifer tübüllerin hafifçe sıkmak için eğri ipucu forseps ve düz kenarlı jilet ikinci kümesi kullanın.<ol>
<li>Tübüllerin soğuk HEB, adet kapsül tüpün içine koyarak önlemek için dikkat çekici 10 mL içeren bir 15 mL konik tüp içine koyun. İkinci testis ile bu adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HEB testis büyüklüğüne bağlı olarak 30-60 dakika buzda içeren konik tüp decapsulated seminifer tübüllerin kuluçkaya. 30 mg tartı testislerde tanısal yaklaşım çifti üzerinden seminifer tübüllerin kuluçkaya veya 30 dk, 31-50 mg 60 dakika 30-45 dakika ve daha büyük testis için tartı testislerde tanısal yaklaşım çifti üzerinden tübüllerin için daha az. Bir tek testis için kez değiştirmeyin. Not: En iyi kuluçka süresi deneyci, kullanılan reaktifler ve analiz ediliyor fareler tecrübesine bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Seminifer tübüllerin HEB içinde kuluçka iken, bir işaret veya kalem numarası, slayt numarası ve Tarih precleaned kaymak fare ile buzlu uçları etiketlemek için kullanın. O zaman önceden temizlenmiş slaytlar sabitleştirici solüsyon içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin.</li>
	<li>Kuluçka tübüllerin ve HEB temiz bir Petri ve yaklaşık 3 mm çap kümeleri içine ayrı tübüllerin içine dökün. Her yığın 2 slayt verimleri ve vermiştir slayt sayısını testis boyutuna bağlıdır. Not: Biz vahşi türü ve subfertile Chtf18üzerinden 6 slayt 8 slaytlar elde-P16 testisler (segregasyonun ve Mitotik germ hücreleri8azalan sayıda nedeniyle daha küçük olan) null. 100 mg veya daha ağırlığında bir yetişkin testis 16 slaytlar verim beklenir.</li>
	<li>100 mM Sükroz çözüm bir Teflon bir halka içine yer 23 µL baskılı, 3 slayt halka ve bir yığın seminifer tübüllerin Yüzük'e ekleyin.  Sonra kullanarak yığın tutun, çözüm bulutlu hale gelinceye kadar yavaşça tübüllerin boyutu 11 jilet ile bin dereden su getirmek için ipucu forseps kavisli. Not: Bu parçalanmış kromozomlar yol açar gibi overmince değil. Parçalanmış kromozomlar da mutasyona uğramış bir fenotip göstergesi olabilir unutmayın.</li>
	<li>Enkaz kaldırma Sükroz çözüm başka bir 23 µL ekleyip hafifçe karışım yukarı ve aşağı için birkaç kez pipette için bir micropipette kullanabilirsiniz süspansiyon hücrelerde ayrı yardım.</li>
	<li>Sabitleştirici solüsyon içeren Coplin kavanoza iliklerine kadar bir slayt kaldırmak ve o bir cömert damlacık slayt alt köşesinde toplar böylece slayt kavanoz içinde tilt.<ol>
<li>Damlalıklı 20 µL Sükroz hücre süspansiyon üzerinden prim Teflon yazdırılan 3 yüzük slaytta sabitleştirici damlacık içine yüzük, buzlu cam slayt ve damlalıklı süspansiyon aşağı yukarı 2 - 3 kez. Not: (2,11 aşağıya bakınız) karışımı spread zaman Sükroz hücre süspansiyon bunu 20 μL eklenmesi kapsama tüm slayt sağlar böylece sabitleştirici damlacık hacmindeki yeterince büyük olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaş yavaş Slayt Slayt boyunca hücre süspansiyon yaymak için damlacık karşısında tarafa eğin. Sonra yavaş yavaş eğimli slayt arka tamamen karşılayacak slaydın genişliği boyunca hücre süspansiyon yaymak için. Aynı alanı hücreleri birbiriyle çakışır daha--dan bir kez aksi takdirde slaydın üzerinde süspansiyon yayılmasını önlemek.</li>
	<li>Hemen düz bir oksijen odasında slayt yerleştirin ve slaytlar yapmak için kullanılan seminifer tübüllerin adımlardan 2.8-2,11 tüm kümeleri kadar yineleyin. Yırtılma ve hücreleri örtüşen önlemek için kurutma işlemi sırasında oksijen odası oynatmamaya önemlidir.</li>
	<li>Böylece yavaş yavaş ve tamamen kuru 2,5 h için oda sıcaklığında kapalı bir oksijen odasında kuluçkaya slaytların izin. Yüksek nem ve yavaş bu adımda kurutma yeterli Kromatin yayılmasını sağlamak önemlidir. O zaman odası kapağını çıkarın ve slaytlar tamamen ek bir 30 dk kurumasını sağlar.</li>
	<li>Slaytlar (arkaya veya bir zikzak desen) % 0,4 fotoğraf-Flo 200/1 X PBS solüsyon içeren bir Coplin kavanoza yerleştirin ve slaytlar iki kez, 5 min yıka, yavaşça Coplin Tantanacı tarafından shaker dönen bir platform üzerinde kavanoz. Taze çözüm her yıkama için kullanın ve slaytlar her yıkama için farklı fareler ayrı kavanoz gelen tutmak.</li>
	<li>Coplin kavanozda % 0,4 fotoğraf-Flo 200/dH2O solüsyon 5 min için bir kez süre Tantanacı içeren slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Coplin slaytlardan Kaldır (son yıkama) kavanoz, dikkatle kenarları ve dipleri aşırı sıvı kaldırmak için slaytları silin ve slaytlar kurumasını bir açılı, neredeyse dik konumda yer. Bu teknikte yetkin bir deneyci işlemek ve yüzey-yayılım çekirdeklerin 4 veya 5 fare--dan bir günde hazırlamak.</li>
	<li>Bir kez kuru (15-20 dk), işlem ayirt boyama veya mağaza-80 ° c ışık en fazla 2 hafta için korumalı bir sıkıca kapalı slayt kutusunda hemen slaytlarını (değerlendirilmekte; hedef proteinler bağlı olarak en iyi sonuçları elde aynı gün ya da 2 hafta içinde lekeli).<ol>
<li>-80 ° C'de depolanan, oda sıcaklığına kadar gelip 1 içeren bir Coplin kavanoza boyama önce 5 min için X PBS veya blok yıkayın slayt izin. Not: Birçok farklı ayirt boyama protokolleri iyi sonuçlar sağlayacaktır; Berkowitz vd immunostaining Protokolü ' li8bakın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralının en kritik adımlar de yaymak, iyi kalite spermatocyte çekirdek sayısının fazlalığı elde etmek için HEB, seminifer tübüllerin kıyma uygun seminifer tübüllerin uygun kuluçka süresi içerir ve tekniği istihdam Sükroz hücre süspansiyon sabitleştirici kaplamalı slaytları arasında yayıldı. Biz vahşi türü erkeklerin testis dan kıyaslanabilir yaşlı Chtf18iken HEB yetişkinlikte 45 dk için için doğum sonrası gün 15 arasında değişen testislerde tanısal yakla...

Fareler yaygın olarak mayoz memelilerde çalışma için bir model organizma olarak kullanılır. Normal gelişim süreçleri ve mayoz sırasında oluşan hataları değerlendirilebilir. Zaman çizelgesi ve profaz sırasında ben ve substages oluşan belirgin özellikleri ilerlemesini yanı sıra çok sayıda belirli proteinlerin süreçleri mayoz düzenlenmesi için çok önemli yer vahşi türü ve mutasyona uğramış fareler karakterize edilebilir. Ben (Handel ve Schimenti1' gözden) ayrıntılı okudu mayoz sırasında oluşan birkaç özel işlemler. Bunlar DNA iki iplikçikli (DSB) formasyonu ve tamir, Rekombinasyon, synaptonemal kompleks oluşumu ve kromozom ayrımı içerir.
Segregasyonun süreçleri eğitimi önemli bir yönü optik ve görsel olarak daha iyi çözümlenir içeren homolog kromozomlar ayırt etmek ve profaz ı. profaz 5 substages oluşur substages tanımlamak çekirdeği incelemek için yeteneğidir Bu synaptonemal kompleksi (SC) oluşumu dahil olmak üzere belirli özellikleri ile karakterizedir. SC bir eşleştirme sağlar üçlü protein iskele ve DNA iki iplikçikli sonu tamiri homologs olduğunu. SC Aksiyel unsurları belirlenmiştir gibi leptonema sırasında homologs hizalayın. O zaman zygonema sırasında synaptonemal kompleks Merkezi elemanları ek eşleştirme ve fiziksel bağlantı (synapsis) homologs çiftleri arasındaki kolaylaştırır. Pachynema sırasında homologs synapsis tam olur ve DNA kesişim üzerinden homolog rekombinasyon DNA çift iplikli kırılmalara select nüfusu tamiri dan oluşur. SC diplonema sırasında homologs desynapse ama onların sentromerler ve DNA kesişim sitelerdeki bağlı kalır izin ayrıştırır. Son olarak homologs diakinesis sırasında recondense ve metafaz geçiş1oluşur.
Tarihsel olarak, yüzey saçan segregasyonun Kromatin, kaç hücre çekirdeği, özellikle de profaz erken dönemlerinde üzerinden vermiştir ben2. Sonuç olarak, bu yöntemleri dokuları (yani testis ya da yumurtalık) hücrelerden ayrılması, Yayilim segregasyonun Kromatin tekniği ve değerlendirme2,3, için yüksek kaliteli segregasyonun çekirdeği verimini artırmak için modifiye edilmiştir 4. buna ek olarak, bu yöntem nükleer koruyarak yararlı kanıtladı ve Kromatin bağlı proteinler segregasyonun çekirdekleri tarafından yayımlanan immunolocalization teknikleri5,6,7gösterildiği gibi. Bu nedenle, bu yöntem başlangıçta Engin2 tarafından açıklanan ve verimleri profaz leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ve diakinesis substages geçiren homologs içeren birçok ayrı patlama spermatocyte çekirdeği aşağıda gösterildiği ben.
Yüzey-yayılım çekirdeği (Kromatin yayılmış analiz olarak da bilinir) hazırlama tekniği mayoz üreme ve hücre biyolojisi alanlarında çalışma için yaygın olarak kullanılır. Yüzey-yayılım çekirdek içeren slaytlar immunostained antikorlar proteinlere ilgi ile daha sonra olabilir veya gümüş boyama için tabi ve mikroskobu ile analiz. Yöntem hem erkek hem de dişi fareler için benzer olsa da değişiklikler için dişi fareler2tarif edilmistir. Seminifer tübüllerin overmince değil çok önemlidir. Çekirdeklerin da de immunostaining homologs takip böylece yaymak gerekir ve ilişkili proteinler mikroskobu ile açıkça görülmektedir. Yüzey-yayılım çekirdek sadece birkaç saat ve her iki immunostained hemen hazırlanmış veya en fazla 3 hafta önce çözdürme ve immunostaining-80 ° C'de depolanan. Ancak, en iyi sonuçları en iyi immunostaining hemen veya yüzey-yayılım çekirdeği hazırlama 2 hafta içinde gerçekleştirilirse bazı proteinler için elde edilir. Slaytlar-ebilmek var olmak immunostained karşı antikorlar için faiz, proteinlerin kullanarak standart bir protokol ile kuluçka ikincil antikorlar floresan için konjuge proteinler veya boya ile izledi, sonra Floresans mikroskobu8ile görüntüsü. Doğum sonrası gün 15-21, 6-10 slaytlar vermeye vahşi türü testisler çift başına yeterli doku işte ve büyük fareler (yetişkin dahil) daha fazla slayt verecektir. Ancak, farelerde vahşi tip 6 hafta yaş ve üstü de immunostaining takip slaytlara daha sonrası segregasyonun hücreleri (yani spermatids) ortaya çıkarır. Buna ek olarak, tüm substages profaz, ben çocuk ve yetişkin fareler görülebilmektedir. Testis erkek, doğum sonrası gün 10 ile 15 dan çok daha fazla leptotene ve zygotene hücre ortaya çıkarır. Doğum sonrası gün 14-15 büyük fareler daha fazla pachytene ve diplotene çekirdekleri ortaya çıkarır.
Burada biz tanımlamak ve yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama bir yaygın kullanılan yöntem göstermek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Memeli mayoz germ hücrelerinde oluşur ve okudu ve karakterize dinamik bir gelişim işlemidir. Çekirdeği üzerinde slaytlar yüzeyine yaymak için bir yöntem kullanarak (onları bir yükseklikten atılan yerine), biz ilk olarak 1997 yılında açıklanmıştır bir en iyi duruma getirilmiş tekniği üzerinde fare spermatocytes göstermek. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan yüksek kaliteli çekirdekleri profaz ı. seminifer substages geçiren bir bolluk verimleri çünkü memeli mayoz çalışma laboratuvarlarda tübüllerin ilk spermatocytes şişmeye Hipotonik çözeltilerine yerleştirilir. O zaman spermatocytes bir hücre süspansiyon oluşturmak için bir Sükroz çözümde serbest bırakılır ve çekirdekleri sabitleştirici bulanmış cam slaytlar yayılır. İmmunostaining, proteinler segregasyonun işlemlere konu ile ilgili bir çeşitlilik incelenebilir. Örneğin, protein synaptonemal kompleks kromozom eksen/çekirdek homologs, birlikte bağlayan bir üçlü yapı kolayca görselleştirildiği. DNA çift iplikli kırılmalara tamirde homolog rekombinasyon tarafından söz konusu, segregasyonun rekombinasyon proteinler de profaz ilerlemesini değerlendirmek için immunostained olabilir ben. Burada biz tanımlamak ve ayrıntılı olarak spermatocytes gelen çocuk ya da yetişkin erkek fareler içinde memeli mayoz çalışma için yaygın olarak kullanılan bir tekniği göstermek.

Bu yöntem yüzey çok sayıda yayılmış olduğu gibi homologs içeren çekirdeklerin sağlama yeteneği üç ana faktöre bağlıdır: 1) seminifer tübüllerin Hipotonik arabelleği yeterince elde etmek için (yani HEB) uygun kuluçka süresi arttı spermatocyte patladı ama üzerinden parçalanmaya değil çekirdek kuluçka HEB, 2 içinde uzun süreli) micropipetting birlikte clumped değil çekirdek ve 3 ayrı bir askıya almak için hücreleri Sükroz damlacıkları) her sabitleşt...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mayoz hangi gamet DNA ikileşmesi bir turu ve kromozom ayrışma birbirini izleyen iki tur üzerinden kurulan gelişimsel işlemidir. Memeli mayoz segregasyonun kromozom yayılır hazırlamak için bir teknik kullanarak incelenebilir. Burada, yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama yöntemi göstermektedir.

Fare Spermatocytes segregasyonun kromozom hazırlanması yayılır

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-mouse-spermatocytes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

11.7K Görüntüleme.  Drexel University College of Medicine. Mayoz hangi gamet DNA ikileşmesi bir turu ve kromozom ayrışma birbirini izleyen iki tur üzerinden kurulan gelişimsel işlemidir. Memeli mayoz segregasyonun kromozom yayılır hazırlamak için bir teknik kullanarak incelenebilir. Burada, yüzey-yayılım çekirdeği fare spermatocytes üzerinden hazırlama yöntemi göstermektedir.

Video: Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Biyoloji

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Fare Dalak gentleMACS Dissociator Tek Hücreli Cezalar hazırlanması

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of dissociating whole organs requires specific parameters in order to obtain a high number of viable cells in a reproducible manner. The gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. The instrument contains pre-programmed settings that are optimized for the efficient but gentle dissociation of a variety of tissue types, including mouse lungs. In this publication the use of the gentleMACS Dissociator on lung tissue derived from mice is demonstrated.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue agitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on lung tissue is explained.

Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Bitkilerde FISH için uygun bir Hızlı Hava kuru Damlama Kromozom Hazırlama Yöntemi

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.