שיטה זו מזהה מיקרואורגניזמים הלחמית העין קיימא, אשר מאתגר בשל הסביבה עוינת העיניים. זה יכול לעזור לענות אם מיקרוביום עיני קיים וכיצד נוכחות חיידקית משתנה במחלות עיניים. בניגוד לריצוף דנ"א, המזהה מיקרואורגניזמים בני קיימא ובלתי קיימא כאחד, שיטה זו מזהה רק מיקרואורגניזמים בני קיימא, וכתוצאה מכך הבנה ברורה יותר של קהילת העין.
מחקרים מראים כי קשה לאבחן מחלות עיניים כגון עין יבשה לא אוטואימונית אוטואימונית יש נוכחות חיידקית עינית ייחודית. שיטה זו יכולה לשמש לאבחון מחלות עיניים עם חתימות מיקרוביאליות ייחודיות. התחל על ידי autoclaving את הכמות המתאימה של כותנה חבטות קיסמים עבור מספר העכברים להיות מנוקב, ואז לצבוט את 1/2 חתיכה ארוכה סנטימטר של כותנה חבטות להקניט אותו על ידי משיכת בקצוות כדי ליצור שכבה נקבובית אחת שטוחה לעצור רק לפני החבטות מתפרק.
מערבולת החבטות סביב אחד הקצוות החדים של קיסם על ידי מחזיק קלות את החתיכה מתוח על קצה קיסם כפי שהוא מעוות. ספוגית העין המוגמרת תהיה שכבה דקה מאוד של כותנה נמתחת על קצה המשתרע על 1/2 עד סנטימטר אחד מהקצה. מכניסים את המטוחות לתוך קסה קטנה, ספוגית בצד למטה ואז לכסות ולאוטוקלאב אותם.
נקה את אזור העבודה עם חיטוי כדי למזער את הזיהום aliquot 0.5 מיליליטר של עירוי לב המוח סטרילי, או מדיה BHI לתוך שכותרתו 1.5 מיליליטר סטרילי מיקרו צנטריפוגות צינורות. מכסים את הצינורות במתלה ומציבים את המדף על קרח. הגדר זרימת עבודה משמאל לימין החל מתחנת ההרדמה של העכבר, המכילה את הכלוב עם העכברים הניסיוניים, כלוב סטרילי ריק, הרדמה בטמפרטורת החדר, מחט 25 מד ומזרק מיליליטר אחד.
לאחר מכן, הכינו תחנת ניקוי עיניים המכילה את ה-BHI על הקרח, ספוגיות עיניים מעוקרות, טיפות עיניים סיכה, מיכל ביוהאזרד, מגבות נייר נקיות ותרסיס איזופרופנול של 70%. לבסוף, הקימו את תחנת הציפוי עם צלחות אגר דם בטמפרטורת החדר, פיפט 10 מיקרוליטר, 10 טיפים חד פעמיים סטריליים מיקרוליטר, ומיכל פסולת biohazard. ודא כי העכבר מורדם כראוי על ידי סחיטת כרית רגל אחורית.
המשך רק אם אין תנועה. הקצה יד אחת לטיפול בעכברים מורדמת ובידיים האחרות כדי לטפל בספוגית העין ובתרבות. מוציאים את העכבר מהכלוב ומניחים אותו על משטח העבודה הממוקם על צידו כאשר העין השמאלית חשופה.
מרססים ידיים כפפות עם isopropanol ולייבש אותם עם מגבת נייר. בטלו את התווית BHI micro centrifuge המסומנת ביד ייעודית לטיפול במדיה והניחו את השניים בחזרה בארון התקשורת. טובלים את קצה כותנה מצופה של ספוגית העין ב BHI, ולאחר מכן למשוך את ספוגית מן הצינור תוך מערבולת הקצה פעמיים נגד הצינור הפנימי כדי להסיר נוזל עודף ולהסיר אותו.
עם יד טיפול העכבר, בעדינות להחזיק את העכבר על ידי עורף הצוואר. מצד שני, מניחים את קצה ספוגית העין על אזור הלחמית המדיאלי של העין השמאלית. לדכא קלות את גלגל העין ולהזיז את ספוגית בתנועה לשטוף את החלון בין העפעף התחתון ואת העין 10 פעמים, שמירה על לחץ מתמיד.
מבלי לגעת בפרווה, הסר בעדינות את קצה הספוגית בניצב למקום שבו הוכנס. מניחים את צד הכותנה ספוגית למטה, ישירות לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שכותרתו עם מדיה BHI. יש למרוח טיפת עין על העין המטונפת.
אם תרצה, לרכוש ספוגיות עור או פרווה עבור דגימות שליטה, כפפות חיטוי כראוי בין כל ספוגית. בסיום, להחזיר את העכבר לכלוב. תן ספוגית לעמוד במשך 10 עד 15 דקות על קרח, ולאחר מכן לעקר את הידיים כפפה ולהסיר את ספוגית תוך ערבוב קצה במדיה במשך 10 סיבובים.
משוך את הספוגית על ידי מערבולת הקצה על הקיר הפנימי של הצינור במשך חמישה סיבובים ולהיפטר ממנו במיכל biohazard. חזור על התהליך עבור כל עכבר. להעשיר את המדגם על ידי דגירה של הצינור באופן סטטי במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
במהלך הדגירה, לסמן צלחת TSA טמפרטורת חדר אחד לכל ספוגית עין העכבר או ספוגית שליטה ולחלק אותו לשניים. מוציאים את הדגימות המועשרות מהחממה ומניחים אותן על קרח. בקצרה מערבולת הדגימות לערבב, ואז aliquot 10 microliters של המדגם על צלחת TSA להטות את הצלחת כדי ליצור רצועה.
חזור על זה פעמיים. בצד השני של הקו המפריד צלחות, ליצור 10 נקודות עם 10 microliters של מדגם כל אחד. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות, יומיים וארבעה ימים בתא נקי המונע צלחות אגר ייבוש.
לספור את המושבות ברצועות. שימו לב למורפולוגיה וחשבו יחידות יוצרות מושבה לכל ספוגית לבידודים דומים מבחינה מורפולוגית. תסתכל על הנקודות שבהן אורגניזמים ייחודיים לא נלכדים ברצועות.
כדי להקל על ההדמיה, ציפוי חיידקים בצפיפות בצלחות האמצעית והימנית. בדרך כלל, ראינו הרבה פחות חיידקים בצלחות ספוגיות עיניים. שים לב כי מדי פעם, ספוגיות העין לא יכול להניב חיידקים לשחזור.
צלחת ספוגית עיניים מייצגת עם מבודדים מגוונים מורפולוגית מעכבר C57 שחור שש מוצגת כאן. עבור כל מבודד מובהק, המושבות נספרו ברצועה והשפע היחסי חושב והותווה. עבור אפיון מיקרוביולוגי, חיידקים נקטפו מצלחות ספוגיות עין עכבר בודדות כדי לייצר צלחת TSA מאסטר.
כאשר הצמיחה הופיעה, נערכו בדיקות נוספות כדי לאפיין או לזהות את המיקרואורגניזמים. הלוח הראשי שימש כדי לספק מספיק inoculum כדי להרחיב את המבודדים בהתאמה. כדי לזהות מבודדים, צלחת TSA היה פסים דגירה לילה, ו MALDI-TOF MS בוצע.
דוגמאות של מבודדים המוצגים כאן זוהו סטרפטוקוקוס אסידומינימוס ו אירוקוקוס viridans. רמות שונות באופן משמעותי של אורגניזמים commensal נמצאו זכר ונקבה C57 שחור שישה עכברים. סטרפטוקוקוס אסידומינימוס, Aerococcus viridans קרישה סטפילוקוצ'י שלילי E.coli היו מבודדים מ C57 שחור שישה עכברים N.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי התוצאה הטובה ביותר תושג על ידי ציפוי ספוגית דק לוקח זמן במהלך צעד ספוגית העין. אם הגישה ל- MALDI-TOF MS מוגבלת, ניתן לזהות את המבודדים על ידי בדיקות מיקרוביולוגיות וביוכימיות.
