על ידי חקר תפקוד תאי הגביע בתרבית ראשונית, אנו מקבלים תובנות חשובות לגבי המנגנונים שמאחורי ההבדלים מבוססי המין בבריאות פני השטח של העין. שינינו את שיטת התרבית הראשונית של תאי גביע הלחמית שכבר נקבעה על ידי סילוק הורמונים וחומרים אסטרוגניים מהמערכת, מה שמאפשר שליטה מדויקת יותר ברמות הורמוני המין. שינוי זה משפר את הדיוק והאמינות של הממצאים שלנו.
מדידת הסידן התוך-תאי היא שיטה לחקר תפקוד תאי הגביע תחת גירויים שונים ומסלולי האיתות התוך-תאיים המופעלים על ידי כל גירוי. ניתן להרחיב את הטכניקה לפיתוח תרופות למחלות פני השטח של העין כמו אלרגיה לעיניים, מחלת עין יבשה או דלקת הלחמית. טכניקה זו מאפשרת סריקה של השפעת מולקולות שונות על תאי גביע תחת רמות הורמונים ספציפיות.
אנשים חדשים בטכניקה זו מתקשים לעתים קרובות בהפרדת רקמת הלחמית מרקמת החיבור. עצתנו היא לשים לב היטב למרקם ולתכונות החומר של הרקמה. הלחמית צריכה להיות אלסטית ושקופה למחצה ואילו רקמת החיבור בדרך כלל בהירה יותר בצבע ודמוית סיבי כותנה.
כדי להתחיל, באמצעות אזמל סטרילי, לטחון את רקמת הלחמית האנושית לחתיכות קוביות מילימטר אחד. בצלחת בת שש בארות, זרעו ארבע חתיכות בכל באר המכילות מילימטר אחד של מדיום סל"ד שלם. הקפידו לעגן את החתיכות לצלחת.
לדגור על חלקי הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% אוויר. רעננו את מדיום התרבות כל יומיים. לאחר 72 שעות מהזריעה, הסירו את פקק הרקמה והמשיכו לדגור עד שתאי הגביע מגיעים למפגש של 70% עד 80%.
לאחר מכן, שטפו את התאים עם PBS והוסיפו 0.05% טריפסין EDTA כדי לנתק את התאים מתחתית הצלחת. התבוננו בניתוק התא תחת מיקרוסקופ. וברגע שהתאים מתנתקים, מוסיפים מדיום RPMI מלא כדי להשבית את הטריפסין.
צנטריפוגו את מתלה התא ב 150 G למשך חמש דקות והשהו מחדש את הגלולה בתווך פנול ללא סל"ד אדום. לאחר מכן זרעו מחדש את תרחיף התא על צלחת תרבית תחתית זכוכית למדידת ריכוז הסידן התוך-תאי. להעמסת Fura-2 AM, יש להוסיף חיץ ביקרבונט Krebs-Ringer המכיל 0.5% HEPES, 0.5% BSA ו-0.5 מיקרומולרית Fura-2 AM, שמונה חומצה פלורונית מיקרומולרית F127 ו-250 מיקרומולרית סולפינפירזון לצלחת תחתית הזכוכית המכילה תאי גביע.
לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, להגן עליהם מפני אור. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם חיץ Krebs-Ringer ביקרבונט המכיל 250 sulfinpyrazone micromolar. למדידת ריכוז סידן תוך תאי, הניחו את הצלחת המכילה תאים עמוסים בפורה-2 מתחת למיקרוסקופ.
לאחר מכן מוסיפים הגדלה פי 200. אתר שדה מייצג המכיל 20 עד 50 תאים. באמצעות פונקציית היד החופשית, צייר קו מתאר סביב כל תא כדי להבדיל אותו מפלואורסצנטיות הרקע והמתן עד שהתוכנה תחסר אוטומטית פלואורסצנטיות רקע מהמדידה.
לחץ על הלחצן התחל ניסוי והמתן שמונה עד 15 שניות כדי לקבוע את רמות הסידן הבסיסיות בתאים. לאחר מכן מוסיפים בזהירות את הקרבצ'ול אגוניסט הכולינרגי וממשיכים למדוד לפחות 120 שניות או עד שרמות הסידן חוזרות לקו הבסיס. באמצעות השינוי בריכוז הסידן התוך-תאי השיא, חשבו את רמת הסידן הבסיסית הממוצעת בכל תא משמונה עד 15 השניות הראשונות של המדידות.
הסר תאים בעלי רמת סידן בסיסית ממוצעת השווה או מעל 500 ננו-מולרית ממערך הנתונים. לאחר מכן, חשב את ריכוז הסידן התוך תאי המרבי עבור כל תא. לאחר מכן הפחיתו את ערך רמת הסידן הבסיסית מהריכוז התוך-תאי המרבי שנמדד עבור אותו תא.
לבסוף, ממוצע השינוי בריכוז הסידן התוך-תאי המרבי עבור כל התאים בצלחת. טוהר תאי גביע הלחמית האנושיים אושר באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים לסמני תאי הגביע, ציטוקרטין וסליל פומטיה לקטין 1. התוצאות של בדיקת Fura-2 AM לא הראו הבדלים משמעותיים בין תאים מודגרים בסל"ד אדום פנול עם 1% BSA ומדיום RPMI מלא.
עם זאת, נצפתה עלייה משמעותית בתגובת הסידן התוך-תאית לקרבכול כאשר השוו את הקבוצה הבינונית המתקדמת בסל"ד לקבוצת ה-RPMI הבינונית השלמה. הדבר החשוב ביותר הוא להשיג תרבית תאי גביע אנושית ראשונית בעלת צפיפות תאים מספקת. במהלך הגדילה, ודא כי חתיכות הרקמה להידבק לצלחת התרבית עבור צמיחה יעילה.
החוקרים יכולים לחקור את המעורבות של מסלולים ספציפיים על ידי הפעלת מעכבים שונים, מיקוד קולטנים או מולקולות איתות לתאים לפני הגירוי. ניתן להעריך גם את הפרמטרים האחרים המעידים על תפקוד תאי הגביע, כמו הפרשת מוצין ונטרול קינאזות חלבוניות המופעלות על ידי מיטוגן. המדידות המשלימות מספקות הבנה מקיפה של תגובת תאי הגביע לגירויים שונים.
