המחברים ברצוננו להביע תודה מר אדם מאוד צ'ין (שנגחאי בריאות הציבור קלינית במרכז) לסיוע טכני עם ההערכה µCT ב פרוטוקול זה.

הערה: מודל ה OE שנוצר, המשמשים למחקר שדווחה בעבר 30 , 31 , 32. ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת שנחאי ג'יאוטונג של.
 1. עכברים <ol><li>בית נטולת הפתוגן, 7 עד 9-בת נקבה BALB/c עכברים בכלובים מאוורר בודד בחיה מתקן תחת מבוקר טמפרטורה (20 ° C) ולחות (40-60%). מספקים אור 12 שעות ו 12 שעות מחזור כהה במתקן. לספק מזון ומים ad libitum.</li>
</ol> 2. האוזון או חשיפה אוויר <ol><li>צור האוזון עם גנרטור חשמלי בתוך קופסה איטום אקרילי (למשל פרספקס). לנשוף האויר מחוץ לקופסה באמצעות מפוח אוויר קטן דרך צינור אוורור אוויר המחובר מבפנים, מחוץ לקופסה. נטר את ריכוז האוזון בתיבה באמצעות בדיקה של האוזון. המתן עד ריכוז האוזון בתיבת מגיע ל- 2.5 חלקים למיליון (ppm). 
	הערה: החללית האוזון יכולה להחליף באופן אוטומטי את מחולל האוזון או ביטול, באפשרותך לשמור על רמת האוזון בתיבה בחלק 2.5 ppm.</li>
	<li>למקם את העכברים לתוך התיבה בעת הרמה של האוזון מגיע ל- 2.5 ppm. לשמור את העכברים בתיבה עבור 3 שעות בכל פעם לחשוף אותם האוזון. 
	הערה: תיבת יכול לשמר רמה האוזון של 2.5 ppm במהלך ה 3 על-ידי מיתוג אוטומטית את מחולל האוזון או ביטול ו CO 2 הזמבורה המיוצר על ידי העכברים מהקופסה.</li>
	<li>לתת אוזון שתי חשיפות (בכל חשיפה מתמשכת 3 h) בשבוע (פעם אחת כל 3 ימים) במשך 7 שבועות; לחשוף את העכברים הבקרה האווירית, באותו זמן, באותה התקופה.</li>
</ol> 3. מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת <ol><li>בסוף שבוע 7, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 מ ל/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים כדי לראות העכבר אינו להגיב הבוהן קמצוץ. צג ולשמור העכבר בתדר נשימה קבועה; וודא כי אין הרצוניות קיים במהלך ההליכים.</li>
	<li>מקום העכברים anesthetized בחדרו של טומוגרפיה שחושב מיקרו (µCT).</li>
	<li>לכייל את µCT באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי והיצרן &#39; s הוראות. הגדר את שפופרת רנטגן 50 kV והזרם ב 450 µA. 
	הערה: שניהם הרנטגן והגלאי סובב סביב העכברים.</li>
	<li>לבצע את הניתוח µCT על-ידי השגת תחזיות 515 עם גודל פיקסל אפקטיבי של 0.092 מ מ, של זמן חשיפה של ms 300 בשביל פרוסה אחת, עובי הפרוסה של מ"מ 0.093.</li>
	<li>לשחזר את הריאה עם תמונות נרכשות באמצעות תוכנה. לכוונן את בהירות התמונה בגווני אפור על-ידי הגדרת את מינימום ומקסימום של גווני האפור ב-750 ו-550 נ. האונספילד יחידות, בהתאמה. 
	הערה: התוכנה יחשב באופן אוטומטי את אמצעי האחסון של parenchyma הריאה, 35 אזור נמוך-הנחתה (LAA) 34 ,.</li>
	<li>לחשב את אחוז LAA (LAA %) על-ידי חלוקת האחסון LAA לפי נפח הריאות הכולל.</li></ol>
 4. הבדיקה על ההליכון <ol><li>לתת העכברים הסתגלות לבדוק במהירות של 10 מ' לדקה 10 דקות ריצה הליכון המכונה הערה: החשמל הוא תמיד כבוי כאשר ההליך מתנהל.</li> <li>מנהל מבחן עייפות לעכברים.
	<ol><li>לחמם את העכברים במהירות של 10 מ' לדקה במשך 5 דק.</li>
		<li>להגדיל את המהירות עד 15 מ' לדקה במשך 10 דקות</li>
		<li>להגדיל את עצימות: הגדלת המהירות על ידי 5 מטר/דקה, החל מ- 20 מ'/דקה, כל 30 דקות עד עכברים אין אפשרות להמשיך לפעול 36.</li>
	</ol></li> <li>להקליט את הסיכום רץ מרחק ויפעילו את הזמן כמו עייפות מרחק וזמן עייפות, בהתאמה.</li></ol>
 5. מדידות תפקוד ריאתי <ol><li>עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של pelltobarbitalum natricum (1%, 0.6 - 0.8 מ ל/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים לראות כי העכבר עושה לא להגיב קמצוץ הבוהן ולחכות עד העכברים נשימה ספונטנית. צג שמרו ולשמור העכבר בתדר נשימה קבועה; וודא כי אין הרצוניות קיים במהלך ההליכים.</li>
	<li>בעיון tracheostomize העכברים ומניחים היא תגלה הגוף שאליו מחובר חמה מבוקר-מחשב- 
	הערה: אוורור נשלטת דרך שסתום הממוקם הציר הקרוב הצינור אנדוטרכאליות. הגדרת מספק תמרונים חצי אוטומטי שונים, כולל את התמרון של אמצעי האחסון לחץ סטטי ומעין ולתמרן את נפח זרימה מהירה.</li>
	<li>לכפות ממוצע נושם התדירות של 150 נשימות לדקה העכבר anesthetized באמצעות אוורור מבוקר ללחץ עד דפוס נשימה רגיל והשיג תפוגה מלאה על כל מחזור הנשימה.</li>
	<li>לבצע את התמרון לחץ סטטי ומעין-נפח עם המכשיר באמצעות הלחץ השלילי שנוצר היא תגלה.</li>
	<li>לבצע את התמרון נפח זרימה מהירה בתוך לולאות לחץ סטטי ומעין-נפח להקליט את FVC ואני את FEV. לנפח הריאה +30 ס"מ H 2 O ומיד לאחר מכן לחבר אותו כדי לחץ שלילי מאוד כדי לאכוף תפוגה עד שאמצעי האחסון שיורית ב-30 ס מ H 2 O. שיא FEV הראשון 25, 50, ו ms 75 של נשיפה (FEV 25 FEV 50, FEV 75, בהתאמה). דוחים את התמרונים שיוצרת. עבור כל בדיקה עם כל עכבר אחת, לנהל מינימום של שלושה מקובל תמרונים כדי לקבל ממוצע אמין עבור כל הפרמטרים מספריים.</li>
</ol> 6. אוסף BALF <ol><li>בעקבות הרדמה מסוף עם pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 גרם/100 גרם) להתאים את המינון על פי מצבים בודדים לראות כי העכבר לא מגיב קמצוץ הבוהן, לאבד את הנשימה), שטיפה עכברים עם 2 מ של PBS דרך 1 מ מ קוטר צינור אנדוטרכאליות ו מכן לאחזר BALF 10-</li>
	<li>מאגר של aliquots שטיפה שאוחזרו ו centrifuge אותם ב 4 ° C ו- g x 250 במשך 10 דקות</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע לשימוש מיידי ולאחסן את השארית ב-80 מעלות צלזיוס או נוזל חנקן.</li>
	<li>לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא PBS, ואז ספין (1,400 x g, 6 דקות) µL 250 תאים resuspended על השקופיות בעזרת צנטריפוגה טווה שקופיות.</li>
	<li>רייט להחיל מכתימה את התאים של השקופיות לפי היצרן &#39; פרוטוקול s.</li>
	<li>לספור תאים 200 לכל עכבר; לזהות את התאים המקרופאגים או נויטרופילים, על פי המורפולוגיה סטנדרטי, תחת הגדלה X 400; ולספור את המספרים שלהם.</li>
</ol> 7. דגימה דם לב <ol><li>לאסוף דם באמצעות דקירה בלב, לטעון אותו לתוך צינורות 1.5-mL, ולשמור את זה על קרח במשך 30 דקות</li>
	<li>Centrifuge את דגימות הדם למשך 5 דקות ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע (סרום) צינור ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס או נוזל חנקן.</li>
	<li>להכין את הנסיוב IL-1β, IL-10, ו- TNF-α בדיקות זיהוי באמצעות ערכות אליסה בהתאמה.</li>
</ol> 8. ניתוח ריאות Morphometric <ol><li>לנתח את הריאות ואת tracheas של העכברים.
	<ol><li>למקם כל עכבר לאללה על גבי לוח כירורגית מיד לאחר ההקרבה.</li>
		<li>לנתח משם platysma את שרירי הנשימה הקדמי כדי להמחיש ולגשת הטבעות והכו אותי.</li>
		<li>פתח את החזי חלל. לנתח את הריאות, קנה הנשימה, אך אל תפריד את הלב מהריאות.</li>
	</ol>
	</li> <li>להתחבר הקטטר אנדוטרכאליות המזרק המכיל 4% paraformaldehyde דרך צינור פוליאתילן PE90. 
	התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. ללבוש כפפות בטיחות משקפיים ולהשתמש הפתרון בתוך ברדס fume.</li>
	<li>מנפח הריאות לחלוטין באמצעות paraformaldehyde 4% (10 טיפות, µL ~ 200) דרך הקטטר אנדוטרכאליות. להסיר את הלב לאחר השלמתו של האינפלציה.</li>
	<li>שמור על הריאה בשפופרת 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde לפחות 4 h</li>
	<li>להטביע את הריאה פרפין. לקבל סעיפים 5-מיקרומטר על-ידי בלוק פראפין חלוקתה עם מיקרוטום רוטרי. במהלך חלוקתה, לחשוף את פני השטח המרבי של רקמת הריאה בתוך אזור עץ הסמפונות.</li>
	<li>ניתוח morphometric, לבצע hematoxylin אאוזין (H &#38; E) צביעת במקטעי.</li>
	<li>תמונה הסעיפים עם מיקרוסקופ זקוף בהיר-שדה (המטרה עדשה, 20 X; זמן החשיפה, 1.667 ms).</li>
	<li>שני חוקרים עיוור בפרוטוקול טיפול באופן עצמאי לספור הסעיפים היסטולוגית. השתמש בנקודת החיתוך ליניארי רשע (L m) כפרמטר למדידת המרחק של הקיר במחיצה הבין-מכתשי. לקבוע את L m באמצעות השלבים הבאים: <ol><li>לפתוח את התמונות של הסעיפים ב- Photoshop וצייר החריט-רשת על התמונה עם תורים ארוכים 550 5 מיקרומטר.</li>
		<li>לספור את מספר alveoli מעבר לקו רשת.</li>
		<li>לחשב את ה L m על-ידי חלוקת אורך הקו ברשת על ידי מספר alveoli. על כימות, תמונה לחמישה מדורים לכל העכבר. לרכוש עשר תמונות של כל אחד מהמקטעים (תמונה אחת לכל שדה), להעריך באופן אקראי. בעת בחירת שדה, להימנע שדות של דרכי הנשימה וכלי על-ידי הזזת שדה אחד קדימה או לכיוון אחר. 
		הערה: הנתונים מוצגים גם זאת אומרת ± S.E.M. מבחן-t בלתי מזווג בוצע לשם השוואה בין עכברים החשופים אוויר ועכברים החשופים האוזון. שלוש חיות של כל קבוצה שימשו כדי לחשב את ההבדל המשמעותי. ערך-p של &#60; 0.05 נחשב משמעותי.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. וו. וו הם העובדים הנוכחי ומחזיקים אופציות של קבוצת וההתערבות הסלולר (סימול: CBMG). המחברים אחרים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

במחקר זה, אנו מציגים שיטה אמינה ליצירת מודל חדש של COPD. מודל זה OE לעומת דגמים אחרים (קרי, LPS או עיקרון השוויון הפוליטי מודלים), recapitulates את תהליך פתולוגי של מטופלי COPD. כי עישון סיגריות הוא החומר מסוכנים העיקרית שגורמת COPD בחולים אנושיים40, דגם CS נשאר הפופולרי ביותר COPD דגם<sup class="xre...

ההערכה היא כי COPD, כולל אמפיזמה וגם ברונכיטיס כרונית, עשוי להיות הגורם המוביל השלישי המוות בעולם 20201,2. שכיחות COPD פוטנציאליים בקרב אוכלוסיה מעל גיל 40 מוערך 12.7% אצל גברים ו- 8.3% אצל נקבות בתוך 40 שנה הבאה3. אין תרופות זמינים כעת להפוך את הידרדרות הדרגתית חולי COPD4. אמין מודלים חייתיים של COPD לא רק דורשים החיקוי של תהליך פתולוגי המחלה אך גם לדרוש תקופה קצרה הדור. המודלים הנוכחיים COPD, כולל את התקליטים או מודל הנוצרות על-ידי עיקרון השוויון הפוליטי, יכול לגרום תסמינים דמויי אמפיזמה5,6. ניהול יחידה או אתגר השבוע של LPS או עיקרון השוויון הפוליטי תוצאות עכברים או חולדות neutrophilia המסומן בנוזל שטיפה bronchoalveolar (BALF), מגביר pro-מתווכים דלקתיים (למשל, TNF-α ו- IL-1β) BALF או סרום, מייצרת ריאות האיזורים אוויר מוגדל-הרס parenchymal, גבולות זרימת אוויר5,6,7,8,9,10. עם זאת, LPS או עיקרון השוויון הפוליטי אינם גורמים אנושיים COPD, ובכך לא לחקות את תהליך פתולוגי11. דגם CS-induced המיוצר על הגבלת זרימת האוויר מתמשך, הרס parenchymal ריאות, מופחתת יכולת תפקודית פעילות גופנית. עם זאת, פרוטוקול CS מסורתי דורש לפחות 3 חודשים כדי להפיק COPD מודל12,13,14,15. לכן, חשוב לייצר מודל בעלי חיים חדשים, יעיל יותר העומד בדרישות שני.
לאחרונה, בנוסף עישון סיגריות, זיהום אוויר, חשיפה תעסוקתית הפכו הסיבות השכיחות יותר של COPD16,17,18. האוזון, כאחד המזהמים העיקריים (אם כי לא המרכיב העיקרי של זיהום אוויר), יכולים להגיב עם מערכת הנשימה באופן ישיר לנזק רקמת הריאה של ילדים והן צעירים מבוגרים19,20,21 ,22,23,24,25. אוזון, כמו גם תכשירים אחרים כולל LPS, עיקרון השוויון הפוליטי של הפקולטה למדעי המחשב, מעורב של משעולים הביוכימי של סטרס חמצוני ריאתי, נזק לדנ א הינם מקושרים על ייזום וקידום של COPD26,27. גורם נוסף הוא כי הסימפטומים של חלק מהחולים COPD להתדרדר אחרי נחשפים האוזון, המציין כי האוזון יכול לשבש את הריאה פונקציה18,28,29. לכן יצרנו מודל חדש של COPD על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון 7 שבועות; כתוצאה מכך זרימת אוויר פגמים ונזק ריאות parenchymal דומים לאלה של חקירות קודמות30,31,32. עלינו להרחיב את פרוטוקול OE עכברים הנשי במחקר זה, בהצלחה לשכפל האמפיזמה נצפתה בעכברים זכרים ב שלנו הקודם מחקרים30,31,32. כי COPD התמותה ירדה בגברים אך גדל אצל נשים אצל מדינות רבות33, מודל COPD אצל נקבות יש צורך ללמוד את המנגנונים וכדי לפתח שיטות טיפוליות לחולים COPD הנשי. תחולת שמודל OE כל המינים משאיל תמיכה נוספת לשימוש שלה כמודל COPD.

<table><tbody><tr><td>BALB/c mice</td><td>Slac Laboratory Animal,Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.</td></tr><tr><td>Individual ventilated cages</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>Model Number: MU64S7</td><td>The cages were used for housing mice in the animal facility.</td></tr><tr><td>Sealing perspex-box</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>The box was used&amp;nbsp; to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.</td></tr><tr><td>Electric generator</td><td>Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany</td><td>Model 500&amp;nbsp;</td><td>The device was used for generating ozone.</td></tr><tr><td>Ozone probe</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK</td><td>Ozone 300</td><td>The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P3761</td><td>Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>Micro-Computed Tomography</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>RS0800639-0075</td><td>This device was used for acquiring images of the lung.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 ABA software</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>Micro-view 2.01&amp;nbsp;</td><td>This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.</td></tr><tr><td>Treadmill machine&amp;nbsp;</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>This machine was usd for fatigue test.</td></tr><tr><td>Body plethysmograph</td><td>eSpira&amp;trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>This device was used to test spirometry pulmonary function.</td></tr><tr><td>Ventilator</td><td>eSpira&amp;trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>This device was used to test spirometry pulmonary function.</td></tr><tr><td>Slide spinner centrifuge</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183&amp;nbsp;</td><td>It was used to spin BALF cells onto slides.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, Shanghai, China</td><td>RE04000054</td><td>&amp;nbsp;It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, USA</td><td>4000</td><td>It was used to count cells.</td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100704</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100747</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td>The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Hualing, Shanghai, China</td><td>56#</td><td>It was used to embed the lung.</td></tr><tr><td>Rotary Microtome</td><td>Leica, Wetzlar,&amp;nbsp; Hesse, Germany</td><td>RM2255</td><td>It was used for sectioning the lung.</td></tr><tr><td>Hgaematoxylin and Eosin (H&amp;amp;E) staining solution</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>G1120</td><td>H&amp;amp;E staining was done for morphometric analysis.</td></tr><tr><td>Upright bright field microscope</td><td>Olympus, Center Valley, PA, USA</td><td>CX41</td><td>It was used to image the H&amp;amp;E staining slides.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, CA, USA</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>It was used to count the number of alveoli on the H&amp;amp;E stained images.</td></tr><tr><td>GraphPad prism 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad prism 5</td><td>It was used for data analysis and production of figures.</td></tr></tbody></table>

generation of a chronic obstructive pulmonary disease model in mice by repeated ozone exposure

מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) מאופיין על ידי הגבלת זרימת האוויר מתמשך והרס parenchymal ריאות. יש שיעור גבוה מאוד של הזדקנות האוכלוסייה. טיפולים קונבנציונליים הנוכחי COPD דגש בעיקר על שינוי סימפטום סמים; לפיכך, ההתפתחות של טיפולים חדשים דרוש בדחיפות. מוסמך מודלים חייתיים של COPD יכול לעזור כדי לאפיין את המנגנונים המשמשת כבסיס, יכול לשמש עבור חדש והתרופות הקרנה. המודלים הנוכחיים של COPD, כגון ליפופוליסכריד (LPS) או elastase הלבלב חזירי (עיקרון השוויון הפוליטי)-מודל אמפיזמה המושרה, ליצור נגעים COPD, כמו ריאות, דרכי הנשימה אבל אחרת לא דומים בפתוגנזה של COPD אנושי. לעשן סיגריה (CS)-מודל המושרה נותר אחד הפופולריים ביותר כי זה לא רק מדמה COPD דמוי נגעים במערכת הנשימה, אבל זה גם מבוסס על אחד החומרים המסוכנים העיקרית הגורמת COPD בבני אדם. עם זאת, ההיבטים מהגידולים ועתירת של דגם CS-induced להגביל באופן דרמטי שלה יישום חדש והתרופות הקרנה. במחקר זה, בהצלחה יצרנו מודל חדש של COPD על ידי חשיפת עכברים לרמות גבוהות של האוזון. מודל זה הפגין את הפעולות הבאות: 1) ירד קיבולת ויטל 25, 50, והכריח את 75/נפח expiratory בכפייה (FEV25/FVC, FEV50/FVC, FEV75/FVC), המציין את התדרדרות תפקוד הריאות; 2) alveoli ריאות מוגדלת, עם הרס parenchymal ריאות; 3) מופחת עייפות הזמן והמרחק; . ו-4) מוגבר דלקת. יחדיו, נתונים אלה מדגימים כי המודל חשיפה (OE) האוזון הוא מודל בעלי חיים אמין דומה לבני כי חשיפת יתר האוזון הוא אחד הגורמים etiological של COPD. בנוסף, לקח רק 6-8 שבועות, בהתבסס על העבודות הקודמות שלנו, כדי ליצור מודל OE, ואילו זה דורש 3-12 חודשים לזירוז המודל עשן סיגריות, המציין כי המודל OE עשוי להיות בחירה טובה עבור מחקר COPD.

דוגמאות של תמונות תלת-ממד µCT של כל קבוצה מוצגים באיור 1. העכברים החשופים האוזון היה נפח הריאות הכולל גדול יותר באופן משמעותי (איור 1ו- b) LAA % (איור 1c) מאשר העכברים בקרת אוויר החשופים. נפח הריאות ואת LA...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure at JoVE.com

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

מחקר זה מתאר את הדור מוצלחת של מודל חדש של בעלי חיים מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון.

דור של מחלת ריאות חסימתית כרונית מודל בעכברים על ידי חשיפה חוזרת ונשנית האוזון

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

generation-chronic-obstructive-pulmonary-disease-model-mice-repeated

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Views.  Cellular Biomedicine Group, Shanghai. מחקר זה מתאר את הדור מוצלחת של מודל חדש של בעלי חיים מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) על ידי חשיפת שוב ושוב עכברים ריכוזים גבוהים של אוזון.

Video: Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Immunology and Infection

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

מדידה אוטומטית של הריאות נפחתו וקטן Airway Remodeling בעכברים שנחשפו לעשן סיגריות

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a promising future of using miRNAs in the diagnosis and care of lung diseases. Here, we define a protocol for miRNA profiling to measure the relative abundance of a group of miRNAs predicted to regulate inflammatory genes in the lung tissue from of an ozone-induced airway inflammation mouse model. Because it has been shown that circulating sex hormone levels can affect the regulation of lung innate immunity in females, the purpose of this method is to describe an inflammatory miRNA profiling protocol in female mice, taking into consideration the estrous cycle stage of each animal at the time of ozone exposure. We also address applicable bioinformatics approaches to miRNA discovery and target identification methods using limma, an R/Bioconductor software, and functional analysis software to understand the biological context and pathways associated with differential miRNA expression.

Here we describe a method to assess lung expression of miRNAs that are predicted to regulate inflammatory genes using mice exposed to ozone or filtered air at different stages of the estrous cycle.

ריאות microRNA פרופיל לרוחב ייחום בעכברים החשופים אוזון

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

הערכה של מכניקת מערכת נשימה בעכברים באמצעות טכניקת תנודה בכפייה

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Biology

Cigarette Smoke Exposure in Mice using a Whole-Body Inhalation System

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular diseases have been widely studied, however, the impact of CS in other tissues and organs such as blood and bone marrow remain incompletely defined. Finding the appropriate system to study the effects of CS in rodents can be prohibitively expensive and require the purchase of commercially available systems. Thus, we set out to build an affordable, reliable, and versatile system to study the pathologic effects of CS in mice. This whole-body inhalation exposure system (WBIS) set-up mimics the breathing and puffing of cigarettes by alternating exposure to CS and clean air. Here we show that this do-it-yourself (DIY) system induces airway inflammation and lung emphysema in mice after 4-months of cigarette smoke exposure. The effects of whole-body inhalation (WBI) of CS on hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in the bone marrow using this apparatus are also shown.

This protocol demonstrates the study of the pathophysiologic effects of cigarette smoke (CS) with a whole-body inhalation (WBI) exposure system (WBIS) built in-house. This system can expose animals to CS under controlled repeatable conditions for research of CS-mediated effects on lung emphysema and hematopoiesis.

חשיפה לעשן סיגריות בעכברים באמצעות מערכת שאיפה לכל הגוף

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

קיבעון ריאה תחת לחץ מתמיד על הערכה של אמפיזמה בעכברים

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

הדמיה של התאמות תאיות ריאות במהלך אוזון משולב ו- LPS המושרה פגיעה ריאות חריפה מורין

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and treatment of silicosis in humans have all been extensively studied using the mouse silicosis model. By repeatedly making mice inhale CSD into their lungs, the mice can mimic the clinical symptoms of human silicosis. This methodology is practical and efficient in terms of time and output and does not cause mechanical injury to the upper respiratory tract due to surgery. Furthermore, this model can successfully mimic acute/chronic transformation process of silicosis. The main procedures were as follows. The sterilized 1-5 &#181;m CSD powder was fully ground, suspended in saline, and dispersed in an ultrasonic water bath for 30 min. Mice under isoflurane-induced anesthesia switched from shallow rapid breathing to deep, slow aspiration for approximately 2 s. The mouse was placed in the palm of a hand, and the thumb tip gently touched the lip edge of the mouse's jaw to straighten the airway. After each exhalation, the mice breathed in the silica suspension drop by drop through one nostril, completing the process within 4-8 s. After the mice's breathing had stabilized, their chest was stroked and caressed to prevent the inhaled CSD from being coughed up. The mice were then returned to the cage. In conclusion, this model can quantify CSD along the typical physiological passage of tiny particles into the lung, from the upper respiratory tract to the terminal bronchioles and alveoli. It can also replicate the recurrent exposure of employees due to work. The model can be performed by one person and does not need expensive equipment. It conveniently and effectively simulates the disease features of human silicosis with high repeatability.

This protocol describes a method for establishing a mouse model of silicosis through repeated exposure to silica suspensions via a nasal drip. This model can efficiently, conveniently, and flexibly mimic the pathological process of human silicosis with high repeatability and economy.

מודל עכבר סיליקוזיס שנקבע על ידי שאיפה חוזרת ונשנית של אבק סיליקה גבישי

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>מודל עכבר של פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי נבוליזציה של בלומיצין באף

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

מודל עכבר של פיברוזיס ריאתי המושרה על ידי נבוליזציה של בלומיצין באף

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...