Name: generation of a chronic obstructive pulmonary disease model in mice by repeated ozone exposure
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
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Os autores gostaria de expressar gratidão ao Sr. Boyin Qin (Shanghai clínicos centro de saúde) para a assistência técnica com a avaliação de µCT neste protocolo.

Nota: OE o modelo foi gerado e usado em pesquisa anteriormente relatados 30 , 31 , 32. Todas as experiências com animais foram aprovadas pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) da Universidade de Shanghai Jiaotong.
 1. ratos instalação <ol><li>casa isentos de organismos patogénicos, de 7 a 9-semana-idade BALB/c ratos fêmeas em gaiolas individuais ventilados um animal sob controlados temperatura (20 ° C) e humidade (40-60%). Fornece uma luz 12 h e ciclo escuro de 12 h na instalação. Providenciar comida e água ad libitum.</li>
</ol> 2. Ozônio ou exposição de ar <ol><li>gerar ozônio com um gerador elétrico em uma caixa de acrílico (por exemplo, Perspex) a vedação. Sopre o ar fora da caixa usando um soprador de ar pequeno através de uma tubulação do respiradouro de ar que está conectado no lado de dentro e fora da caixa. Controlar a concentração de ozônio na caixa usando uma sonda de ozônio. Espere até que a concentração de ozônio na caixa atinge 2,5 partes por milhão (ppm). 
	Nota: A sonda do ozônio pode alternar automaticamente o gerador de ozônio ou desligar e pode manter o nível de ozônio na caixa a 2,5 ppm.</li>
	<li>Coloque os ratos no caixa quando o nível de ozônio atinge 2,5 ppm. Manter os ratos na caixa para 3h cada vez de expô-las ao ozônio. 
	Nota: A caixa pode manter um nível de ozônio de 2,5 ppm durante a 3h comutando automaticamente o gerador de ozônio, ligado ou desligado e soprar o CO 2 que é produzido pelos ratos fora da caixa.</li>
	<li>Dar duas exposições de ozônio (cada exposição durando 3h) por semana (uma vez a cada 3 dias) por 7 semanas; expor os ratos controle ao ar ao mesmo tempo e no mesmo período.</li>
</ol> 3. Microtomografia computadorizada <ol><li>no fim de semana 7, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver que o mouse não responder a uma pitada do dedo do pé. Monitor e mantenha o mouse em uma frequência de respiração firme; e certifique-se sem movimentos voluntários existem durante os procedimentos.</li>
	<li>Coloque os ratos anestesiados na câmara de uma microtomografia computadorizada (µCT).</li>
	<li>Calibrar o µCT usando o protocolo padrão e o fabricante &#39; instruções s. Conjunto do tubo de raio x em 50 kV e a corrente em 450 µA. 
	Nota: Tanto o raio-x e o detector giram em torno do ratos.</li>
	<li>Realizar a análise µCT adquirindo 515 projeções com um tamanho de pixel eficaz de 0,092 mm, tempo de exposição de 300 ms para uma fatia e uma espessura da fatia de 0,093 mm.</li>
	<li>Reconstruir o pulmão com as imagens adquiridas usando um software. Ajustar o brilho da imagem em tons de cinza, definindo o mínimo e máximo, a escala de cinza em unidades de Hounsfield-750 e -550, respectivamente. 
	Nota: O software automaticamente irá calcular os volumes do parênquima pulmonar e a área do baixo-atenuação (LAA) 34 , 35.</li>
	<li>Calcular a porcentagem de LAA (LAA %) dividindo o volume LAA pelo volume total do pulmão.</li></ol>
 4. teste de esteira <ol><li>dão os ratos uma adaptação testar em uma velocidade de 10 m/min por 10 minutos em uma execução esteira máquina. Nota: A eletricidade está sempre desligado quando o processo está sendo conduzido.</li> <li>administrar um teste de fadiga para os ratos.
	<ol><li>Aquecer os ratos a uma velocidade de 10 m/min 5 min.</li>
		<li>Aumentar a velocidade de 15m/min durante 10 min.</li>
		<li>Aumentar a intensidade do exercício: aumentando a velocidade de 5 m/min, começando com 20 m/min, a cada 30 min até ratos não pode continuar a executar 36.</li>
	</ol></li> <li>Gravar o total, correndo a distância e tempo de execução como fadiga de distância e tempo de fadiga, respectivamente.</li></ol>
 5. medidas de função pulmonar <ol><li>anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver que o rato faz Não responde a uma pitada de dedo do pé e esperar até que os ratos têm mantido respiração espontânea. Monitor e mantém o mouse em uma frequência de respiração firme; e certifique-se sem movimentos voluntários existem durante os procedimentos.</li>
	<li>Cuidadosamente tracheostomize os ratos e os coloque em um pletismógrafo de corpo que está ligado a um ventilador controlado por computador. 
	Nota: A ventilação é controlada através de uma válvula localizada proximalmente ao tubo endotraqueal. A instalação oferece diferentes manobras semiautomáticas, incluindo a manobra do volume pressão quase estático e a manobra do volume fluxo rápido.</li>
	<li>Impor uma média de frequência de 150 respirações por minuto para o rato anestesiado por meio de ventilação de pressão controlada até um padrão de respiração regular de respiração e expiração completa em cada ciclo de respiração é obtida.</li>
	<li>Executar a manobra de pressão-volume quase estático com o dispositivo usando as pressões negativas geradas na pletismografia.</li>
	<li>Executar a manobra de volume de fluxo rápido dentro dos loops de pressão-volume quase estático para gravar a CVF e o VEF. Inflar o pulmão para + 30 cm H 2 O e imediatamente depois, conecte-o a uma pressão altamente negativa para impor a expiração até o volume residual é a-30 cm H 2 O. Record o VEF nos primeiros 25, 50 e 75 ms de exalação (FEV 25 FEV 50 e FEV 75, respectivamente). Rejeite as manobras de qualidade inferior. Para cada teste com cada único rato, realizar um mínimo de três manobras aceitáveis para obter uma média confiável para todos os parâmetros numéricos.</li>
</ol> 6. BALF coleção <ol><li>após anestesia terminal com pelltobarbitalum natricum ((1%, 1,8 a 2,4 ml/100 g) ajustar a dose de acordo com situações individuais para ver o que o rato não responder a uma pitada de dedo do pé e perder o fôlego), lavagem do ratos com 2 mL de PBS através de um tubo endotraqueal de 1 mm de diâmetro e em seguida, recuperar o LBA 10.</li>
	<li>Reunir as alíquotas de lavagem obtida e centrifugá-los a 4 ° C e 250 x g durante 10 min.</li>
	<li>Recolher o sobrenadante para uso imediato e guarde o restante no-80 ° C ou líquido nitrogênio.</li>
	<li>Conte o número total de células usando um hemocytometer.</li>
	<li>Ressuspender as células em PBS e então girar (1.400 x g, 6 min) 250 µ l de células ressuspensa em slides utilizando uma centrífuga de girador de slide.</li>
	<li>Wright aplicar coloração para células nos slides de acordo com o fabricante &#39; protocolo de s.</li>
	<li>Contar 200 células por rato; identificar as células como macrófagos ou neutrófilos, de acordo com a morfologia padrão, com ampliação de X 400; e contar os números deles.</li>
</ol> 7. Amostragem de sangue cardíaco <ol><li>coletar sangue através de punção cardíaca, carregá-lo para tubos de 1,5 mL e mantê-lo no gelo por 30 min.</li>
	<li>Centrifugar as amostras de sangue por 5 min em 2.000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante (soro) para um tubo novo e armazená-lo no-80 ° C ou líquido nitrogênio.</li>
	<li>Preparar o soro para IL-1 β, IL-10 e testes de detecção de TNF-α usando os respectivos kits ELISA.</li>
</ol> 8. Análise morfométrica de pulmão <ol><li>dissecar os pulmões e tracheas de ratos.
	<ol><li>Posicionar cada rato euthanized em uma placa cirúrgico imediatamente após o sacrifício.</li>
		<li>Distância dissecar a platisma e músculos traqueais anteriores para visualizar e acessar os anéis traqueais.</li>
		Cavidade <li>aberto até a torácica. Dissecar os pulmões e a traqueia, mas não separe o coração dos pulmões.</li>
	</ol>
	</li> <li>Se conectar o cateter endotraqueal para uma seringa contendo paraformaldeído 4%, através de um tubo de polietileno PE90. 
	Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico. Usar luvas e óculos de segurança e usar a solução dentro de uma coifa.</li>
	<li>Inflar o pulmão completamente usando paraformaldeído 4% (10 gotas, ~ 200 µ l) através do cateter endotraqueal. Remover o coração após a conclusão da inflação.</li>
	<li>Manter o pulmão em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de paraformaldeído 4% pelo menos 4 h.</li>
	<li>Incorporar o pulmão em parafina. Obter as seções 5-µm por bloco de parafina com um micrótomo rotativo de corte. Durante o corte, expor a área máxima da superfície do tecido pulmonar dentro da área da árvore brônquica.</li>
	<li>Para Análise morfométrica, executar hematoxilina e eosina (H &#38; E) coloração sobre as seções.</li>
	<li>As seções de imagem com um microscópio de campo claro vertical (lente objetiva, 20 X; tempo de exposição, ms 1,667).</li>
	<li>Tem dois investigadores cegos para o protocolo de tratamento independentemente as secções histológicas. Use a interceptação linear média (L m) como um parâmetro para medir a distância da parede do septo inter alveolar. Determinar a L m usando as seguintes etapas: <ol><li>abrir as imagens das seções no Photoshop e desenhe uma reticule-grade na imagem com longas filas de cinco 550 µm.</li>
		<li>Contar o número de alvéolos através da linha de grade.</li>
		<li>Calcular a L m dividindo o comprimento da linha de grade pelo número de alvéolos. Para quantificação, imagem cinco seções por rato. Adquirir dez imagens de cada seção (uma imagem por campo) e avaliar aleatoriamente. Durante a seleção do campo, evitar áreas de vias aéreas e vasos movendo um campo à frente ou em outra direção. 
		Nota: Os dados são apresentados como a média ± no MEV mostrou Um teste t não-pareado foi realizado para comparação entre ar-expostos ratos e camundongos expostos de ozônio. Três animais de cada grupo foram usados para calcular a diferença significativa. Um p-valor de &#60; 0,05 foi considerado significativo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. e W.W. são empregados atuais e detentores de opção de ações do grupo de Biomedicina celular (NASDAQ: CBMG). Outros autores a declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Neste estudo, apresentamos um método confiável para a geração de um novo modelo de DPOC. Comparado a outros modelos (i.e., LPS ou modelos de EPI), este modelo de OE recapitula o processo patológico de doentes com DPOC. Porque a fumaça do cigarro é o principal material perigoso que causa a DPOC em pacientes humanos40, o modelo CS continua a ser o mais popular DPOC modelo41,42. No entanto, o modelo CS requer um R de 3 a 12 me...

Estima-se que a DPOC, incluindo enfisema e bronquite crônica, pode ser a terceira principal causa de morte no mundo em 20201,2. A potencial incidência de DPOC em uma população de mais de 40 anos de idade é estimada em 12,7% no sexo masculino e 8,3% nas fêmeas dentro os próximos 40 anos3. Não há medicamentos dispõem reverter a deterioração progressiva em pacientes de DPOC4. Modelos animais confiáveis de DPOC não só exigem a imitação do processo patológico da doença mas também requerem um período curto de geração. Modelos atuais de DPOC, incluindo os LPS ou um modelo de EPI-induzida, podem induzir sintomas de enfisema, como5,6. Uma única administração ou um desafio da semana de LPS ou PPE ratos ou ratos resulta em neutrofilia marcada no líquido de lavagem broncoalveolar (LBA), aumentos de mediadores pró-inflamatórios (por exemplo, TNF-α e IL-1 β) no LBA ou soro, produz o pulmão espaços de ar parenquimatosos destruição-ampliado e limites do fluxo de ar5,6,7,8,9,10. No entanto, LPS ou PPE não são causas de DPOC humana e, portanto, não imitar o processo patológico11. Um modelo CS-induzido produziu uma limitação do fluxo de ar persistente, destruição parenquimatosa pulmonar e reduzida capacidade de exercício funcional. No entanto, um protocolo de CS tradicional requer pelo menos 3 meses para gerar um modelo do DPOC12,13,14,15. Assim, é importante gerar um novo modelo animal mais eficiente que atenda os dois requisitos.
Recentemente, além de fumar de cigarro, poluição do ar e exposição ocupacional tornaram-se as causas mais comuns de DPOC16,17,18. O ozônio, como um dos principais poluentes (embora não é o principal componente da poluição do ar), diretamente pode reagir com o trato respiratório e danificar o tecido pulmonar de crianças e jovens adultos19,20,21 ,22,23,24,25. Ozônio, bem como outros estimuladores incluindo LPS, PPE e CS, estão envolvidos em uma séria de caminhos bioquímicos de estresse oxidativo pulmonar e danos ao DNA e estão ligados ao início e à promoção da DPOC26,27. Outro fator é que os sintomas de alguns doentes com DPOC deteriorar-se após ser exposto ao ozônio, indicando que o ozônio pode interromper pulmão função18,28,29. Portanto, geramos um novo modelo de DPOC, repetidamente, expondo ratos a concentrações elevadas de ozono por 7 semanas; Isto resultou em fluxo de ar defeitos e danos pulmonares parenquimatosas semelhantes de investigações anteriores30,31,32. Nós estendido o protocolo de OE para ratos fêmeas neste estudo e reproduzido com sucesso o enfisema observado em ratos masculinos em nossos anteriores estudos30,31,32. Porque a mortalidade da DPOC diminuiu em homens mas aumentou nas mulheres em muitos países,33, um modelo de DPOC em fêmeas é necessário para estudar os mecanismos e desenvolver métodos terapêuticos para pacientes de DPOC. A aplicabilidade do modelo para todos os gêneros OE presta apoio adicional ao seu uso como um modelo de DPOC.

<table><tbody><tr><td>BALB/c mice</td><td>Slac Laboratory Animal,Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.</td></tr><tr><td>Individual ventilated cages</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>Model Number: MU64S7</td><td>The cages were used for housing mice in the animal facility.</td></tr><tr><td>Sealing perspex-box</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>The box was used&amp;nbsp; to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.</td></tr><tr><td>Electric generator</td><td>Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany</td><td>Model 500&amp;nbsp;</td><td>The device was used for generating ozone.</td></tr><tr><td>Ozone probe</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK</td><td>Ozone 300</td><td>The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P3761</td><td>Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>Micro-Computed Tomography</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>RS0800639-0075</td><td>This device was used for acquiring images of the lung.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 ABA software</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>Micro-view 2.01&amp;nbsp;</td><td>This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.</td></tr><tr><td>Treadmill machine&amp;nbsp;</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>This machine was usd for fatigue test.</td></tr><tr><td>Body plethysmograph</td><td>eSpira&amp;trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>This device was used to test spirometry pulmonary function.</td></tr><tr><td>Ventilator</td><td>eSpira&amp;trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>This device was used to test spirometry pulmonary function.</td></tr><tr><td>Slide spinner centrifuge</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183&amp;nbsp;</td><td>It was used to spin BALF cells onto slides.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, Shanghai, China</td><td>RE04000054</td><td>&amp;nbsp;It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, USA</td><td>4000</td><td>It was used to count cells.</td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100704</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100747</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td>The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Hualing, Shanghai, China</td><td>56#</td><td>It was used to embed the lung.</td></tr><tr><td>Rotary Microtome</td><td>Leica, Wetzlar,&amp;nbsp; Hesse, Germany</td><td>RM2255</td><td>It was used for sectioning the lung.</td></tr><tr><td>Hgaematoxylin and Eosin (H&amp;amp;E) staining solution</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>G1120</td><td>H&amp;amp;E staining was done for morphometric analysis.</td></tr><tr><td>Upright bright field microscope</td><td>Olympus, Center Valley, PA, USA</td><td>CX41</td><td>It was used to image the H&amp;amp;E staining slides.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, CA, USA</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>It was used to count the number of alveoli on the H&amp;amp;E stained images.</td></tr><tr><td>GraphPad prism 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad prism 5</td><td>It was used for data analysis and production of figures.</td></tr></tbody></table>

generation of a chronic obstructive pulmonary disease model in mice by repeated ozone exposure

Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é caracterizada pela destruição parenquimatosa pulmonar e limitação de persistente do fluxo de ar. Tem uma incidência muito alta no envelhecimento das populações. As terapias convencionais atuais para DPOC foco principalmente no sintoma-drogas; assim, é urgente o desenvolvimento de novas terapias. Modelos animais qualificados de DPOC poderiam ajudar a caracterizar os mecanismos subjacentes e podem ser usados para o rastreio de drogas novas. Modelos atuais de DPOC, tais como lipopolissacarídeo (LPS) ou a elastase pancreática porcina (PPE)-modelo de enfisema induzido, gerar a DPOC, como lesões nos pulmões e vias aéreas mas não caso contrário se assemelham a patogênese da DPOC humana. Fumo um cigarro (CS)-modelo induzido continua a ser um dos mais populares porque não só simula DPOC-lesões no sistema respiratório, mas também é baseado em um dos principais materiais perigosos que causa a DPOC em seres humanos. No entanto, os aspectos demorados e trabalhosos do modelo CS-induzido limitam drasticamente sua aplicação na despistagem de drogas novas. Neste estudo, geramos com êxito um novo modelo de DPOC, expondo os ratos a altos níveis de ozônio. Este modelo demonstrou o seguinte: 1) diminuiu o volume expiratório forçado 25, 50 e 75/forçado capacidade vital (VEF25observou, VEF50observou e VEF75observou), indicando a deterioração da função pulmonar; 2) alvéolos pulmonares alargada, com destruição parenquimatosa pulmonar; 3) redução do tempo de fadiga e distância; e 4) aumento da inflamação. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o modelo de exposição (OE) de ozônio é um modelo animal confiável que é semelhante aos seres humanos porque superexposição de ozônio é um dos fatores etiológicos da DPOC. Além disso, só demorou 6-8 semanas, com base no nosso trabalho anterior, para criar um modelo de OE, Considerando que requer 3-12 meses para induzir o modelo de fumaça de cigarro, indicando que o modelo de OE pode ser uma boa escolha para a investigação de DPOC.

Exemplos de imagens 3D µCT de cada grupo são exibidos na Figura 1um. Os ratos expostos de ozônio tinham um volume de pulmão total significativamente maior (Figura 1a e b) e LAA % (Figura 1c) do que os ratos controle expostas ao ar. O volume pulmonar e LAA % manteve-se elevado após seis semanas de ozônio exposição31<sup...

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Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Este estudo descreve a geração bem sucedida de um novo modelo animal de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), repetidamente expondo ratos a concentrações elevadas de ozono.

Geração de um modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica em ratos pela exposição repetida de ozônio

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.9K visualizações.  Cellular Biomedicine Group, Shanghai. Este estudo descreve a geração bem sucedida de um novo modelo animal de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), repetidamente expondo ratos a concentrações elevadas de ozono.

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Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Imunologia e Infecção

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Medicina

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a promising future of using miRNAs in the diagnosis and care of lung diseases. Here, we define a protocol for miRNA profiling to measure the relative abundance of a group of miRNAs predicted to regulate inflammatory genes in the lung tissue from of an ozone-induced airway inflammation mouse model. Because it has been shown that circulating sex hormone levels can affect the regulation of lung innate immunity in females, the purpose of this method is to describe an inflammatory miRNA profiling protocol in female mice, taking into consideration the estrous cycle stage of each animal at the time of ozone exposure. We also address applicable bioinformatics approaches to miRNA discovery and target identification methods using limma, an R/Bioconductor software, and functional analysis software to understand the biological context and pathways associated with differential miRNA expression.

Here we describe a method to assess lung expression of miRNAs that are predicted to regulate inflammatory genes using mice exposed to ozone or filtered air at different stages of the estrous cycle.

Pulmão microRNA Profiling através do ciclo estral em camundongos expostos de ozônio

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Avaliação da mecânica respiratória em ratos usando a técnica de oscilações forçadas

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Biologia

Cigarette Smoke Exposure in Mice using a Whole-Body Inhalation System

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular diseases have been widely studied, however, the impact of CS in other tissues and organs such as blood and bone marrow remain incompletely defined. Finding the appropriate system to study the effects of CS in rodents can be prohibitively expensive and require the purchase of commercially available systems. Thus, we set out to build an affordable, reliable, and versatile system to study the pathologic effects of CS in mice. This whole-body inhalation exposure system (WBIS) set-up mimics the breathing and puffing of cigarettes by alternating exposure to CS and clean air. Here we show that this do-it-yourself (DIY) system induces airway inflammation and lung emphysema in mice after 4-months of cigarette smoke exposure. The effects of whole-body inhalation (WBI) of CS on hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in the bone marrow using this apparatus are also shown.

This protocol demonstrates the study of the pathophysiologic effects of cigarette smoke (CS) with a whole-body inhalation (WBI) exposure system (WBIS) built in-house. This system can expose animals to CS under controlled repeatable conditions for research of CS-mediated effects on lung emphysema and hematopoiesis.

Exposição à fumaça de cigarro em camundongos usando um sistema de inalação de corpo inteiro

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

Fixação pulmonar pressão constante para avaliação de enfisema em camundongos

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and treatment of silicosis in humans have all been extensively studied using the mouse silicosis model. By repeatedly making mice inhale CSD into their lungs, the mice can mimic the clinical symptoms of human silicosis. This methodology is practical and efficient in terms of time and output and does not cause mechanical injury to the upper respiratory tract due to surgery. Furthermore, this model can successfully mimic acute/chronic transformation process of silicosis. The main procedures were as follows. The sterilized 1-5 &#181;m CSD powder was fully ground, suspended in saline, and dispersed in an ultrasonic water bath for 30 min. Mice under isoflurane-induced anesthesia switched from shallow rapid breathing to deep, slow aspiration for approximately 2 s. The mouse was placed in the palm of a hand, and the thumb tip gently touched the lip edge of the mouse's jaw to straighten the airway. After each exhalation, the mice breathed in the silica suspension drop by drop through one nostril, completing the process within 4-8 s. After the mice's breathing had stabilized, their chest was stroked and caressed to prevent the inhaled CSD from being coughed up. The mice were then returned to the cage. In conclusion, this model can quantify CSD along the typical physiological passage of tiny particles into the lung, from the upper respiratory tract to the terminal bronchioles and alveoli. It can also replicate the recurrent exposure of employees due to work. The model can be performed by one person and does not need expensive equipment. It conveniently and effectively simulates the disease features of human silicosis with high repeatability.

This protocol describes a method for establishing a mouse model of silicosis through repeated exposure to silica suspensions via a nasal drip. This model can efficiently, conveniently, and flexibly mimic the pathological process of human silicosis with high repeatability and economy.

Modelo de silicose em camundongos estabelecido por inalação repetida de pó de sílica cristalina

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Um modelo de camundongo de fibrose pulmonar induzida por nebulização de bleomicina nasal

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

Um modelo de camundongo de fibrose pulmonar induzida por nebulização de bleomicina nasal

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...