Name: generation of a chronic obstructive pulmonary disease model in mice by repeated ozone exposure
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
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Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine al signor Boyin Qin (Shanghai Public Health Clinical Center) per l'assistenza tecnica con la valutazione di µCT in questo protocollo.

Nota: OE il modello è stato generato e utilizzato nella ricerca precedentemente segnalati 30 , 31 , 32. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Shanghai Jiaotong University.
 1. topi <ol><li>casa esenti da patogeni, 7 a 9-week-old femminili topi BALB/c in gabbie individuali ventilate in un animale impianto sotto controllato temperatura (20 ° C) e umidità (40-60%). Fornire una 12 ore di luce e il ciclo scuro 12h nella struttura. Fornire cibo e acqua ad libitum.</li>
</ol> 2. L'ozono o l'esposizione all'aria <ol><li>genera ozono con un generatore elettrico in una casella di acrilico (ad es. del Perspex) tenuta. Soffiare l'aria fuori dalla scatola usando un ventilatore di aria piccola attraverso un tubo di sfiato di aria che è collegato all'interno e all'esterno della casella. Monitorare la concentrazione di ozono nella finestra utilizzando una sonda di ozono. Attendere fino a quando la concentrazione di ozono nella casella raggiunge 2,5 parti per milione (ppm). 
	Nota: La sonda di ozono può accendere automaticamente il generatore di ozono o spegnere e può mantenere il livello di ozono nella casella a 2,5 ppm.</li>
	<li>Posto i topi nella casella quando il livello di ozono raggiunge 2,5 ppm. Mantenere i topi nella finestra per 3 h ogni volta di esporli a ozono. 
	Nota: La casella in grado di mantenere un livello di ozono di 2,5 ppm durante i 3 h commutando automaticamente il generatore di ozono o spegnere e che soffia la CO 2 che è prodotto dai topi out of the box.</li>
	<li>Danno due esposizioni di ozono (ogni esposizione durata 3 ore) a settimana (una volta ogni 3 giorni) per 7 settimane; esporre i topi di controllo di aria allo stesso tempo e per lo stesso periodo.</li>
</ol> 3. Micro-tomografia <ol><li>alla fine della settimana 7, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale del pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) aggiustare la dose in base alle singole situazioni per vedere che il mouse non rispondere a una punta pizzico. Monitor e tenere il mouse ad una frequenza di respirazione costante; e assicurarsi che nessun movimenti volontari esistono durante le procedure.</li>
	<li>Porre i topi anestetizzati nella camera di una micro-tomografia computerizzata (µCT).</li>
	<li>Calibrare il µCT utilizzando il protocollo standard e il produttore &#39; s istruzioni. Fissato il tubo di raggi x a 50 kV e la corrente alle 450 µA. 
	Nota: Entrambi i raggi x e il rivelatore ruotano attorno i topi.</li>
	<li>Eseguire l'analisi µCT con l'acquisizione di 515 proiezioni con una dimensione di pixel effettivi di 0,092 mm, un tempo di esposizione di 300 ms per una fetta e uno spessore di fetta di 0,093 mm.</li>
	<li>Ricostruire il polmone con le immagini acquisite utilizzando un software. Regolare la luminosità dell'immagine in scala di grigi impostando rispettivamente il minimo e il massimo di grigi alle unità di Hounsfield-750 e -550,. 
	Nota: Il software calcolerà automaticamente i volumi del parenchima polmonare e la zona bassa attenuazione (LAA) 34 , 35.</li>
	<li>Calcolare la percentuale di LAA (LAA %) dividendo il volume LAA dal volume polmonare totale.</li></ol>
 4. tapis roulant Test <ol><li>dare i topi un adattamento di prova ad una velocità di 10 m/min per 10 min su una corsa tapis roulant macchina. Nota: l'elettricità è sempre spento quando la procedura sta conducenda.</li> <li>amministra un prova di fatica per i topi.
	<ol><li>Riscaldare i topi ad una velocità di 10 m/min per 5 min.</li>
		<li>Aumentare la velocità a 15 m/min per 10 min.</li>
		<li>Aumentare l'intensità dell'esercizio: aumentare la velocità di 5 m/min, a partire da 20 m/min, ogni 30 min fino a topi non può continuare a eseguire 36.</li>
	</ol></li> <li>Registrare la totale distanza corrente e tempo di esecuzione come distanza di affaticamento e stanchezza tempo, rispettivamente.</li></ol>
 5. misure di funzione polmonare <ol><li>anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale del pelltobarbitalum natricum (1%, 0,6 - 0,8 ml/100 g) aggiustare la dose in base alle singole situazioni per vedere che il mouse non non rispondere a un pizzico di punta e attendere che i topi hanno mantenuto respirazione spontanea. Monitor e tenere il mouse ad una frequenza di respirazione costante; e assicurarsi che nessun movimenti volontari esistono durante le procedure.</li>
	<li>Attentamente tracheostomize i topi e metterli in un pletismografo di corpo che è collegato ad un ventilatore controllato dal computer. 
	Nota: La ventilazione è controllato tramite una valvola posta prossimalmente al tubo endotracheale. Il programma di installazione fornisce diverse manovre semi-automatiche, tra cui la manovra del volume pressione quasi-statica e la manovra del volume flusso veloce.</li>
	<li>Imporre una media frequenza di 150 respiri/min al mouse anestetizzato tramite ventilazione pressione-controllata fino a un modello di respirazione regolare respiratoria e completa scadenza ad ogni ciclo di respirazione è ottenuta.</li>
	<li>Eseguire la manovra di pressione-volume quasi-statico con il dispositivo utilizzando pressioni negative generate nel pletismografo.</li>
	<li>Eseguire la manovra di volume di flusso veloce entro i loop di pressione-volume quasi-statica per registrare la FVC e il FEV. Gonfiare il polmone a + 30 cm H 2 O ed immediatamente in seguito, collegarlo a una pressione altamente negativa per far rispettare la scadenza fino a quando il volume residuo è a-30 cm H 2 O. Record il FEV nelle prime 25, 50 e 75 ms dell'espirazione (FEV 25 FEV 50 e FEV 75, rispettivamente). Respingere le manovre non ottimali. Per ogni test con ogni singolo mouse, condurre un minimo di tre manovre accettabili per ottenere un mezzo affidabile per tutti i parametri numerici.</li>
</ol> 6. BALF collezione <ol><li>a seguito di anestesia terminale con pelltobarbitalum natricum ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) aggiustare la dose in base alle situazioni individuali per vedere che il mouse non rispondere a un pizzico di punta e perdere il respiro), il lavaggio la topi con 2 mL di PBS tramite un tubo endotracheale di 1 mm di diametro e quindi recuperare il BALF 10.</li>
	<li>Raccogliere le aliquote di Estratto di lavanda e centrifugare li a 4 ° C e 250 x g per 10 min.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante per un uso immediato e memorizzare il resto a-80 ° C o azoto liquido.</li>
	<li>Contare il numero totale di celle utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in PBS e quindi spin (1.400 x g, 6 min) 250 µ l di sedimento cellule sui vetrini utilizzando una centrifuga spinner diapositiva.</li>
	<li>Applicare Wright colorazione di cellule sulle diapositive secondo il produttore &#39; protocollo s.</li>
	<li>Contare 200 celle per topo; identificare le cellule come i macrofagi o neutrofili, secondo standard morfologia, sotto 400 ingrandimenti; e contare i loro numeri.</li>
</ol> 7. Prelievo di sangue cardiaco <ol><li>raccogliere il sangue tramite puntura cardiaca, caricarlo in provette da 1,5 mL e tenerlo in ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare i campioni di sangue per 5 min a 2.000 x g e 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante (siero) ad un nuovo tubo e conservare a-80 ° C o azoto liquido.</li>
	<li>Preparare il siero per IL-1 β, IL-10 e TNF-α rilevamento test utilizzando i rispettivi kit ELISA.</li>
</ol> 8. L'analisi morfometrica del polmone <ol><li>sezionare i polmoni e i tracheas dai topi.
	<ol><li>Posizionare ogni mouse eutanasizzati su una scheda chirurgica subito dopo sacrificio.</li>
		<li>Distanza sezionare il platisma e muscoli anteriori tracheali per visualizzare e accedere gli anelli tracheali.</li>
		<li>Open up toracico cavità. Sezionare i polmoni e la trachea, ma non separare il cuore dai polmoni.</li>
	</ol>
	</li> <li>Collegare il catetere endotracheale per una siringa contenente paraformaldeide 4% attraverso un tubo di polietilene PE90. 
	Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Indossare guanti e occhiali di sicurezza e utilizzare la soluzione all'interno di una cappa aspirante.</li>
	<li>Gonfiare il polmone completamente usando paraformaldeide al 4% (10 gocce, ~ 200 µ l) attraverso il catetere endotracheale. Togliere il cuore dopo il completamento della inflazione.</li>
	<li>Mantieni il polmone in una provetta da 15 mL contenente 10 mL di paraformaldeide al 4% per almeno 4 h.</li>
	<li>Incorporare il polmone in paraffina. Ottenere le sezioni 5-µm dal blocco di paraffina sezionamento con un microtomo rotativo. Durante il sezionamento, esporre la superficie massima del tessuto polmonare all'interno dell'area dell'albero bronchiale.</li>
	<li>Per l'analisi morfometrica, eseguire ematossilina ed eosina (H &#38; E) colorazione sulle sezioni.</li>
	<li>Le sezioni di immagine con un microscopio verticale campo chiaro (lente dell'obiettivo, 20x; tempo di esposizione, ms 1,667).</li>
	<li>Hanno due investigatori accecati per il protocollo di trattamento indipendentemente contare le sezioni istologiche. Utilizzare l'intercetta lineare media (L m) come parametro per misurare la distanza della parete del setto Inter-alveolare. Determinare L m attenendosi alla seguente procedura: <ol><li>aprire le immagini delle sezioni in Photoshop e disegnare una griglia di reticolo sull'immagine con linee lunghe cinque 550 µm.</li>
		<li>Contare il numero degli alveoli su tutta la linea di griglia.</li>
		<li>Calcolare L m dividendo la lunghezza della linea griglia per il numero degli alveoli. Per la quantificazione, immagine cinque sezioni per topo. Acquisire dieci immagini di ogni sezione (una sola immagine per ogni campo) e valutare in modo casuale. Durante la selezione del campo, evitare campi delle vie aeree e vasi spostando un campo in avanti o in un'altra direzione. 
		Nota: I dati sono presentati come la media ± s.e.m. Un t-test ONU-accoppiato è stato effettuato per confronto tra aria-esposti topi e topi esposti a ozono. Tre animali di ogni gruppo sono stati utilizzati per calcolare la differenza significativa. Un valore di p &#60; 0,05 è stato considerato significativo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. e W.W. sono dipendenti attuali e i titolari di stock options del gruppo cellulare di biomedicina (NASDAQ: CBMG). Gli altri autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

In questo studio, presentiamo un metodo affidabile per la generazione di un nuovo modello di BPCO. Rispetto ad altri modelli (cioè, LPS o modelli di dpi), questo modello di OE ricapitola il processo patologico di pazienti con BPCO. Poiché il fumo di sigaretta è il principale materiale pericoloso che le cause della BPCO in pazienti umani40, il modello CS rimane il più popolare BPCO modello41,42. Tuttavia, il modello CS richiede...

Si prevede infatti che la BPCO, tra cui l'enfisema e la bronchite cronica, potrebbe essere la terza causa di morte nel mondo nel 20201,2. L'incidenza potenziale della BPCO in una popolazione di oltre 40 anni di età è stimata essere 12,7% nei maschi e 8,3% in femmine entro i prossimi 40 anni3. No farmaci attualmente disponibili invertire il deterioramento progressivo in COPD pazienti4. Affidabili modelli animali della BPCO non solo esigono l'imitazione del processo patologico della malattia ma richiedono anche un generazione di breve periodo. Attuali modelli di BPCO, tra cui il LPS o un modello PPE-indotta, possono indurre sintomi simil-enfisema5,6. Una singola somministrazione o una sfida di settimana di LPS o PPE per risultati di topi o ratti in neutrophilia contrassegnato nel fluido di lavaggio broncoalveolare (BALF), aumenti di mediatori pro-infiammatori (per esempio, TNF-α e IL-1 β) nel BALF o siero, produce del polmone parenchimali distruzione-ingrandetta aria spazi e limiti del flusso d'aria5,6,7,8,9,10. Tuttavia, LPS o PPE non sono cause della BPCO umana e non imitare così il processo patologico11. Un modello indotto da CS prodotto una limitazione al flusso aereo persistente, la distruzione parenchimatica del polmone e ridotta capacità di esercizio funzionale. Tuttavia, un protocollo di CS tradizionale richiede almeno 3 mesi per generare un COPD modello12,13,14,15. Pertanto, è importante generare un nuovo modello animale più efficiente che soddisfa i requisiti di due.
Recentemente, oltre al fumo di sigaretta, inquinamento atmosferico e l'esposizione professionale sono diventati più comuni cause di BPCO16,17,18. L'ozono, come uno dei principali inquinanti (anche se non è la componente principale dell'inquinamento atmosferico), direttamente può reagire con le vie respiratorie e danneggiare il tessuto polmonare dei bambini e dei giovani adulti19,20,21 ,22,23,24,25. Ozono, come pure altri stimolatori inclusi LPS, PPE e CS, sono coinvolti in una serie di vie biochimiche dello stress ossidativo polmonare e danno del DNA e sono collegati all'avvio e alla promozione di BPCO26,27. Un altro fattore è che i sintomi di alcuni pazienti BPCO si deteriorano dopo essere stati esposti all'ozono, che indica che l'ozono può interrompere polmone funzione18,28,29. Di conseguenza, abbiamo generato un nuovo modello di BPCO esponendo ripetutamente topi ad alte concentrazioni di ozono per 7 settimane; Ciò ha provocato difetti di flusso d'aria e danni parenchimali polmonari simili a quelli di precedenti indagini30,31,32. Abbiamo prolungato il protocollo OE ai topi femminili in questo studio e riprodotto con successo dell'enfisema osservato nei topi maschi in nostri precedenti studi30,31,32. Perché BPCO mortalità è diminuita negli uomini, ma aumentato nelle donne in molti paesi33, è necessario un modello di BPCO nelle femmine di studiare i meccanismi e per sviluppare metodi terapeutici per pazienti BPCO femminili. L'applicabilità del modello OE per tutti i generi fornisce ulteriore sostegno al suo uso come un modello di BPCO.

<table><tbody><tr><td>BALB/c mice</td><td>Slac Laboratory Animal,Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.</td></tr><tr><td>Individual ventilated cages</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>Model Number: MU64S7</td><td>The cages were used for housing mice in the animal facility.</td></tr><tr><td>Sealing perspex-box</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>The box was used&amp;nbsp; to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.</td></tr><tr><td>Electric generator</td><td>Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany</td><td>Model 500&amp;nbsp;</td><td>The device was used for generating ozone.</td></tr><tr><td>Ozone probe</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK</td><td>Ozone 300</td><td>The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P3761</td><td>Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>Micro-Computed Tomography</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>RS0800639-0075</td><td>This device was used for acquiring images of the lung.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 ABA software</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>Micro-view 2.01&amp;nbsp;</td><td>This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.</td></tr><tr><td>Treadmill machine&amp;nbsp;</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>This machine was usd for fatigue test.</td></tr><tr><td>Body plethysmograph</td><td>eSpira&amp;trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>This device was used to test spirometry pulmonary function.</td></tr><tr><td>Ventilator</td><td>eSpira&amp;trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>This device was used to test spirometry pulmonary function.</td></tr><tr><td>Slide spinner centrifuge</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183&amp;nbsp;</td><td>It was used to spin BALF cells onto slides.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, Shanghai, China</td><td>RE04000054</td><td>&amp;nbsp;It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, USA</td><td>4000</td><td>It was used to count cells.</td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100704</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100747</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td>The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Hualing, Shanghai, China</td><td>56#</td><td>It was used to embed the lung.</td></tr><tr><td>Rotary Microtome</td><td>Leica, Wetzlar,&amp;nbsp; Hesse, Germany</td><td>RM2255</td><td>It was used for sectioning the lung.</td></tr><tr><td>Hgaematoxylin and Eosin (H&amp;amp;E) staining solution</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>G1120</td><td>H&amp;amp;E staining was done for morphometric analysis.</td></tr><tr><td>Upright bright field microscope</td><td>Olympus, Center Valley, PA, USA</td><td>CX41</td><td>It was used to image the H&amp;amp;E staining slides.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, CA, USA</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>It was used to count the number of alveoli on the H&amp;amp;E stained images.</td></tr><tr><td>GraphPad prism 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad prism 5</td><td>It was used for data analysis and production of figures.</td></tr></tbody></table>

generation of a chronic obstructive pulmonary disease model in mice by repeated ozone exposure

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è caratterizzata da distruzione parenchimale di flusso d'aria persistente limitazione e del polmone. Ha un'incidenza molto alta nelle popolazioni di invecchiamento. Le attuali terapie convenzionali per BPCO concentrarsi principalmente su sintomo-modificanti; Pertanto, è urgente lo sviluppo di nuove terapie. Modelli animali qualificati della BPCO potrebbero contribuire a caratterizzare i meccanismi di fondo e possono essere utilizzati per lo screening di stupefacenti nuovi. Modelli attuali di COPD, come il lipopolisaccaride (LPS) o l'elastasi pancreatica porcina (PPE)-modello di enfisema indotto, generare COPD-come le lesioni nei polmoni e vie respiratorie ma altrimenti non assomigliano alla patogenesi della BPCO umano. Un fumo di sigaretta (CS)-modello indotto rimane uno dei più popolari perché non solo simula la BPCO-come le lesioni dell'apparato respiratorio, ma si basa anche su uno dei principali materiali pericolosi che le cause della BPCO in esseri umani. Tuttavia, gli aspetti molto tempo e laboriosi del modello indotto da CS drammaticamente limitano l'applicazione in screening di nuovi farmaci. In questo studio, abbiamo generato con successo un nuovo modello di BPCO esponendo topi ad alti livelli di ozono. Questo modello ha dimostrato quanto segue: 1) è diminuito di volume espiratorio forzato di 25, 50 e 75/forzata di capacità vitale (FEV25/FVC, FEV50/FVC e FEV75/FVC), che indica il deterioramento della funzione polmonare; 2) gli alveoli del polmone allargata, con distruzione parenchimale del polmone; 3) ridotto affaticamento tempo e distanza; e 4) ha aumentato l'infiammazione. Presi insieme, questi dati dimostrano che il modello di esposizione (OE) l'ozono è un affidabile modello animale che è simile agli esseri umani perché sovraesposizione di ozono è uno dei fattori eziologici della BPCO. Inoltre, ci sono voluti solo 6-8 settimane, basate sul nostro lavoro precedente, per creare un modello di OE, considerando che richiede 3-12 mesi per indurre il modello di fumo di sigaretta, che indica che il modello di OE potrebbe essere una buona scelta per la ricerca di BPCO.

Esempi di immagini 3D µCT di ogni gruppo vengono visualizzati nella Figura 1un. I topi esposti a ozono hanno avuti un volume polmonare totale significativamente più grande (Figura 1un e b) e LAA % (Figura 1c) che ha fatto i topi di controllo aria-esposti. Il volume polmonare e LAA % è rimanere elevati dopo sei settimane di ozono esposizione<sup cl...

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Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Questo studio descrive la generazione di successo di un nuovo modello animale di malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) esponendo ripetutamente topi ad alte concentrazioni di ozono.

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

generation-chronic-obstructive-pulmonary-disease-model-mice-repeated

Research

JoVE Journal

Medicine

10.9K Views.  Cellular Biomedicine Group, Shanghai. Questo studio descrive la generazione di successo di un nuovo modello animale di malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) esponendo ripetutamente topi ad alte concentrazioni di ozono.

Video: Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

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Medicina

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a promising future of using miRNAs in the diagnosis and care of lung diseases. Here, we define a protocol for miRNA profiling to measure the relative abundance of a group of miRNAs predicted to regulate inflammatory genes in the lung tissue from of an ozone-induced airway inflammation mouse model. Because it has been shown that circulating sex hormone levels can affect the regulation of lung innate immunity in females, the purpose of this method is to describe an inflammatory miRNA profiling protocol in female mice, taking into consideration the estrous cycle stage of each animal at the time of ozone exposure. We also address applicable bioinformatics approaches to miRNA discovery and target identification methods using limma, an R/Bioconductor software, and functional analysis software to understand the biological context and pathways associated with differential miRNA expression.

Here we describe a method to assess lung expression of miRNAs that are predicted to regulate inflammatory genes using mice exposed to ozone or filtered air at different stages of the estrous cycle.

Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

Valutazione In Vivo dell'efferocitosi del macrofago alveo dopo l'esposizione all'ozono

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate

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Biologia

Cigarette Smoke Exposure in Mice using a Whole-Body Inhalation System

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular diseases have been widely studied, however, the impact of CS in other tissues and organs such as blood and bone marrow remain incompletely defined. Finding the appropriate system to study the effects of CS in rodents can be prohibitively expensive and require the purchase of commercially available systems. Thus, we set out to build an affordable, reliable, and versatile system to study the pathologic effects of CS in mice. This whole-body inhalation exposure system (WBIS) set-up mimics the breathing and puffing of cigarettes by alternating exposure to CS and clean air. Here we show that this do-it-yourself (DIY) system induces airway inflammation and lung emphysema in mice after 4-months of cigarette smoke exposure. The effects of whole-body inhalation (WBI) of CS on hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in the bone marrow using this apparatus are also shown.

This protocol demonstrates the study of the pathophysiologic effects of cigarette smoke (CS) with a whole-body inhalation (WBI) exposure system (WBIS) built in-house. This system can expose animals to CS under controlled repeatable conditions for research of CS-mediated effects on lung emphysema and hematopoiesis.

Esposizione al fumo di sigaretta nei topi con un sistema di inalazione per tutto il corpo

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

Fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dell'enfisema nei topi

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and treatment of silicosis in humans have all been extensively studied using the mouse silicosis model. By repeatedly making mice inhale CSD into their lungs, the mice can mimic the clinical symptoms of human silicosis. This methodology is practical and efficient in terms of time and output and does not cause mechanical injury to the upper respiratory tract due to surgery. Furthermore, this model can successfully mimic acute/chronic transformation process of silicosis. The main procedures were as follows. The sterilized 1-5 &#181;m CSD powder was fully ground, suspended in saline, and dispersed in an ultrasonic water bath for 30 min. Mice under isoflurane-induced anesthesia switched from shallow rapid breathing to deep, slow aspiration for approximately 2 s. The mouse was placed in the palm of a hand, and the thumb tip gently touched the lip edge of the mouse's jaw to straighten the airway. After each exhalation, the mice breathed in the silica suspension drop by drop through one nostril, completing the process within 4-8 s. After the mice's breathing had stabilized, their chest was stroked and caressed to prevent the inhaled CSD from being coughed up. The mice were then returned to the cage. In conclusion, this model can quantify CSD along the typical physiological passage of tiny particles into the lung, from the upper respiratory tract to the terminal bronchioles and alveoli. It can also replicate the recurrent exposure of employees due to work. The model can be performed by one person and does not need expensive equipment. It conveniently and effectively simulates the disease features of human silicosis with high repeatability.

This protocol describes a method for establishing a mouse model of silicosis through repeated exposure to silica suspensions via a nasal drip. This model can efficiently, conveniently, and flexibly mimic the pathological process of human silicosis with high repeatability and economy.

Un modello murino di silicosi stabilito dall'inalazione ripetuta di polvere di silice cristallina

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Un modello murino di fibrosi polmonare indotta dalla nebulizzazione nasale di bleomicina

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

Un modello murino di fibrosi polmonare indotta dalla nebulizzazione nasale di bleomicina

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...