Name: generation of a chronic obstructive pulmonary disease model in mice by repeated ozone exposure
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
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저자가이 프로토콜에서 µCT 평가와 기술 지원 씨 Boyin 진 (상하이 보건 임상 센터)에 게 감사를 표현 하 고 싶습니다.

참고: 모델에 OE를 생성 하 고 이전에 보고 된 연구 30 , , 31 32에서 사용. 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 상하이 교통 대학에 의해 승인 했다.
 1. 쥐 아래 <ol><li>집 병원 체-무료, 7-를 9 주-오래 된 여성 BALB/c 마우스 동물에 개별 통풍이 장에 시설 제어 온도 (20 ℃)와 습도 (40-60%). 12 h 빛 및 시설에 12 h 어두운 주기를 제공 합니다. 음식을 제공 하 고 광고 libitum 물.</li>
</ol> 2. 오존 또는 공기 노출 <ol><li>씰링 (예: Perspex) 아크릴 상자에 전기 발전기로 생성 오존. 상자 안쪽에 연결 되는 공기 환기 파이프를 통해 작은 공기 송풍기를 사용 하 여 상자에서 공기를 불어. 오존 프로브를 사용 하 여 상자에서 오존의 농도 모니터링 합니다. 상자에서 오존의 농도 당 2.5 부분에 도달할 때까지 기다려 백만 (ppm). 
	참고: 오존 프로브 켜거나 오존 생성기를 자동으로 전환할 수 있습니다 및 2.5 ppm에 상자에서 오존 수준을 유지할 수 있습니다.</li>
	<li>오존의 수준에 도달 하면 2.5 ppm 상자에 마우스를 놓습니다. 계속 쥐 3 h 상자에서 각 시간 오존 노출. 
	참고: 상자 3 h 동안 켜거나 오존 생성기를 자동으로 전환 하 여 2.5 p p m의 오존 레벨을 유지할 수 있고 상자 마우스에 의해 생산 되는 CO 2 부.</li>
	<li>7 주 동안 주당 (한 번 매 3 일) 두 오존 노출 (3 h 지속 각 노출)를 주고, 동시에 및 동일한 기간 동안에 컨트롤 마우스를 노출.</li>
</ol> 3. 마이크로-단층 <ol><li>주 7의 끝에, anesthetize pelltobarbitalum natricum의 복 주사와 쥐 (1%, 0.6-0.8 ml/100 g) 마우스 하지 않습니다 보고 개별 상황에 따라 복용량을 조정 발가락을 꼬집어. 모니터 응답 및 꾸준한 호흡 주파수;에서 마우스를 계속 아무 자발적인 동의 절차 동안 존재 다는 것을 확인.</li>
	<li>마이크로 계산 된 단층 촬영 (µCT)의 약 실에 있는 마 취 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>보정 표준 프로토콜 및 제조 업체를 사용 하 여 µCT &#39; s 지시. 50 x 선 튜브 설정 k v 및 450 µ A 전류. 
	참고: 모두는 마우스 주위를 회전 하는 x-선 및 검출기.</li>
	<li>µCT 분석 한 조각, 300 ms의 노출 시간과 0.093 m m의 슬라이스 두께 0.092 mm의 효과적인 픽셀 크기 515 계획을 획득 하 여 수행.</li>
	<li>인수 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 폐를 재구성 합니다. -750 및-550 Hounsfield 단위, 최소 및 최대는 회색조의를 각각 설정 하 여 회색 음영 이미지의 밝기를 조정. 
	참고: 소프트웨어 자동으로 폐 실질과 낮은 감쇠 지역 (LAA) 34 , 35의 볼륨 계산 합니다.</li>
	<li>총 폐 볼륨에 의해 라 볼륨을 나누어 라 (라 %)의 비율을 계산.</li></ol>
 4. 디딜 방 아 테스트 <ol><li>주고는 실행 디딜 방 아 기계입니다. 참고에 10 분 동안 10 m/분의 속도에 적응 한 쥐 테스트: 전기는 항상 떨어져 절차 실시 되는 때.</li> <li>관리는 피로 마우스를 테스트 합니다.
	<li>워밍업 5 분에 대 한 10 m/min의 속도로 마우스</li> <ol>
		<li>10 분에 대 한 15 m/분 속도 증가</li>
		<li>운동 강도 증가: 5 m/min, 20 m/분에서 시작 하 여 속도 증가 마우스까지 30 분 마다 36 실행을 계속할 수 없습니다.</li>
	</ol></li> <li>거리가 고 실행 시간 피로 거리 및 피로 시간으로 각각 총 기록.</li></ol>
 5. 폐 기능 측정 <ol><li>Anesthetize pelltobarbitalum natricum의 복 주사와 쥐 (1%, 0.6-0.8 ml/100 g) 마우스는 볼을 개별 상황에 따라 복용량을 조정 발가락 핀치에 응답 하지 및 쥐 유지 자발적인 호흡. 모니터와 꾸준한 호흡 주파수;에서 마우스를 계속 될 때까지 기다립니다 아무 자발적인 동의 절차 동안 존재 다는 것을 확인.</li>
	<li>신중 하 게 쥐를 tracheostomize 하 고 컴퓨터 제어 통풍 기에 연결 된 몸 plethysmograph에 그들을 배치. 
	참고: 환기 proximally endotracheal 튜브에 있는 밸브를 통해 제어 됩니다. 설치 다른 자동 기동, 준 정적 압력 볼륨의 책략 및 빠른 흐름 볼륨의 책략을 포함 하 여 제공 합니다.</li>
	<li>호흡 주파수 150 호흡/분 일반 호흡 패턴까지 압력 제어 환기를 통해 마 취 마우스의 평균 고 각 호흡 사이클에서 완전 한 만료 획득.</li>
	<li>는 plethysmograph에서 생성 하는 부정적인 압력을 사용 하 여 장치와 유사 정적 압력-볼륨 책략을 수행.</li>
	<li>는 FVC는 FEV를 기록 준 정적 압력-볼륨 루프 내 빠른 흐름 볼륨 책략을 수행 합니다. + 30 cm H 2로 폐를 팽창 O 및 즉시 이후에 만료 될 때까지 잔여 볼륨-30 cm H 2 o. 기록에 첫 번째 25, 50, 및 증발 기 (FEV 25의 75 ms에 FEV를 적용 하는 매우 부정적인 압력에 연결 FEV 50 및 FEV 75, 각각). 최적이 아닌 훈련을 거부 한다. 모든 단일 마우스를 각 테스트에 대 한 모든 숫자 매개 변수에 대 한 신뢰할 수 있는 의미를 세 허용 훈련의 최소 수행.</li>
</ol> 6. BALF 컬렉션 <ol><li>pelltobarbitalum natricum와 터미널 마 취에 따라 ((1%, 1.8-2.4 ml/100 g) 마우스 발가락 핀치에 응답 하지 않는 및 숨을 잃게 참조 하는 개별 상황에 따라 복용량을 조정), 게는 1 m m 직경 endotracheal 튜브 및 다음 검색 BALF 10 통해 PBS의 2 mL와 쥐.</li>
	<li>풀 검색 된 게 aliquots 및 4 ° C와 10 분 대 한 250 x g에서 원심</li>
	<li>즉각적인 사용을 위해 상쾌한을 수집 하 고 저장-80 ° C 또는 액체 질소에서 나머지.</li>
	<li>는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 총 수를 계산 하.</li>
	<li>PBS에 다음 스핀 (1400 x g, 6 분) 250 µ L 슬라이드 회전자 원심 분리기를 사용 하 여 슬라이드에 resuspended 셀의 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>제조 업체에 따라 슬라이드에 세포 적용 라이트를 얼룩 &#39; s 프로토콜.</li>
	<li>마우스 당 200 셀, 400 배 확대;에서 표준 형태에 따라 세포 또는 호 중구, 셀을 식별 하 고 그들의 숫자의 개수 계산.</li>
</ol> 7. 심장 혈액 샘플링 <ol><li>심장 찔린 통해 혈액 수집 1.5 mL 튜브에 그것을 로드 하 고 30 분에 대 한 얼음에 그것을 유지</li>
	<li>2000 g x 4에서 5 분에 대 한 혈액 샘플을 원심 ° c.</li>
	<li>새 튜브를 상쾌한 (혈 청)을 전송 하 고-80 ° C 또는 액체 질소에 저장.</li>
	<li>IL 1β에 대 한 혈 청을 준비 IL-10, 및 각각 ELISA 키트를 사용 하 여 TNF-α 탐지 테스트.</li>
</ol> 8. 폐 형태학 분석 <ol><li>부 폐와 쥐에서 tracheas.
	<ol><li>희생 후 즉시 외과 보드에 각 안락사 마우스 위치.</li>
		<li>멀리는 platysma 해 부 및 시각화 하 고 액세스 tracheal 반지 앞쪽 tracheal 근육.</li>
		<li>열기는 흉부를 캐비티입니다. 폐와 기관지, 해 부 하지만 폐에서 마음을 분리 하지 마십시오.</li>
	</ol>
	</li> <li>PE90 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 4 %paraformaldehyde 포함 된 주사기에 연결할 endotracheal 테. 
	주의: Paraformaldehyde 독성이 있다. 장갑, 안전 안경 착용 하 고 연기 후드 내부 솔루션을 사용 하 여.</li>
	<li>Endotracheal 카 테 터를 통해 4 %paraformaldehyde (10 방울, ~ 200 µ L)를 사용 하 여 완전히 폐를 부 풀 려. 인플레이션의 완료 후에 심장 제거.</li>
	<li>유지 적어도 4 헤에 대 한 4 %paraformaldehyde 10 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 폐</li>
	<li>는 파라핀에 폐를 포함합니다. 파라핀 블록 회전 톰으로 단면 5 µ m 섹션을 얻을. 단면, 하는 동안 폐 조직 기관지 트리 영역 내에서 최대 표면적 노출.</li>
	<li>형태학 분석 수행 되며 고 오신 (H &#38; E) 섹션에 얼룩.</li>
	<li>밝은 분야 직 립 현미경 (대물 렌즈, 20 X, 노출 시간, 1.667 ms) 섹션 이미지.</li>
	<li>두 수 사관 치료 프로토콜을 눈 멀게 하는 조직학 단면도 독립적으로 계산 했습니다. 간 치경 septal 벽의 거리를 측정 하기 위한 매개 변수로 평균 선형 절편 (L m)를 사용 합니다. 다음 단계를 사용 하 여 L m 결정: <ol><li>포토샵에서 섹션의 이미지를 열고 5 550 µ m 긴 라인 이미지에 reticule 그리드를 그립니다.</li>
		<li>폐 포의 수를 계산 하는 격자 라인에 걸쳐.</li>
		<li>는 그리드 라인의 길이 폐 포의 수로 나누어 L m을 계산 합니다. 정량화, 마우스 당 5 섹션 이미지. 각 섹션 (하나의 이미지 필드 당)의 10 개의 이미지를 수집 하 고 무작위로 평가. 필드 선택, 동안 앞 또는 다른 방향에서 한 필드를 이동 하 여 항공 및 선박 분야 방지. 
		참고: 데이터 평균 ± S.E.M.로 표시 됩니다. 유엔 쌍체 t 검정은 공기에 노출 된 쥐와 쥐 오존 노출 사이 비교를 위해 실시 됐다. 각 그룹의 3 개의 동물 상당한 차이 계산 하기 위해 사용 되었다. P-값이 &#60; 0.05 중요 하 게 고려 되었다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S.와 트 면은 현재 직원 및 셀룰러 의학 그룹의 스톡 옵션 보유자 (나스닥: CBMG). 다른 작가 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

이 연구에서 우리는 새로운 COPD 모델을 생성 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법 제시. (즉, LPS 또는 PPE 모델) 다른 모델에 비해,이 OE 모델이 COPD 환자 들의 병 적인 과정. 담배 연기 때문에 인간의 환자40에서 COPD를 일으키는 주요 유해 물질, CS 모델 가장 인기 있는 COPD 모델41,42남아 있습니다. 그러나 CS 모델 3-12 개월 연구를 필요로 하?...

폐기 종 등 만성 기관지염 COPD 20201,2세계에서 죽음의 세 번째 주요 원인 것으로 추정 되었다. 40 세 이상 인구에서 COPD의 잠재적인 발생률 남성에서 12.7%와 8.3%3다음 40 년 이내 여성에서 추정 된다. 아니 약물 COPD 환자4진보적인 악화를 현재 사용할 수 있습니다. COPD의 신뢰할 수 있는 동물 모델 뿐만 아니라 질병 병리학 과정의 모방을 요구 하지만 짧은 세대 기간 필요. LPS 또는 PPE 유도 모델을 포함 하 여 현재 COPD 모델 기종 같은 증상5,6을 유도할 수 있다. 폐를 생산 하는 단일 관리 또는 쥐 또는 쥐에 bronchoalveolar 게 액체 (BALF), 증가 프로-염증 성 중재자 (예를 들어, TNF-α 및 IL 1β) BALF 또는 혈 청에서 표시 된 neutrophilia LPS 또는 PPE의 1 주일 동안 도전 parenchymal 파괴 확대 공기 공간, 고도 공기5,6,7,,89,10. 그러나, LPS 또는 PPE 인간의 COPD의 원인이 되지 않습니다 및 따라서 병 적인 과정11를 모방 하지 않습니다. CS 유발 모델 지속적인 공기 흐름 제한, 폐 parenchymal 파괴, 생산과 기능적 운동 능력을 감소. 그러나, 전통적인 CS 프로토콜 COPD 모델12,13,,1415를 생성 하기 위해 3 개월 이상 필요 합니다. 따라서, 두 가지 요구 사항을 충족 하는 새로운, 더 효율적인 동물 모델을 생성 하는 것이 중요 하다.
최근, 담배 흡연, 뿐만 아니라 대기오염과 직업적 노출 되고있다 COPD16,,1718의 일반적인 원인. 오존, 주요 오염 물질의 한으로 (비록 아니라 대기오염의 주요 구성 요소), 수 직접 호흡기로 반작용 하 고 어린이 젊은 성인19,20,21의 폐 조직 손상 ,,2223,,2425. LPS, PPE, CS, 등 다른 자극으로 오존, 심각한 폐 산화 스트레스와 DNA 손상의 생 화 확 적인 통로의 참여 하 고 개시와 COPD26,27의 승진에 연결. 또 다른 요인은 일부 COPD 환자의 증상 오존, 오존이 폐 기능18,,2829을 방해할 수 있습니다 나타내는 노출 후 악화 이다. 따라서, 우리는 반복 해 서 7 주;에 대 한 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 COPD 모델 생성 이 공기 결함 및 이전 조사30,,3132의 그들과 유사 하 폐 parenchymal 손상 귀착되는. 우리이 연구에서 여성 쥐 OE 프로토콜을 확장 하 고 우리의 이전 연구30,,3132남자 쥐에서 관찰 하는 기종 성공적으로 재현. 때문에 남성에서 COPD 사망률은 감소 하지만 많은 국가33여성 증가, 여성에서 COPD 모델 메커니즘을 연구 하 고 필요한 여성 COPD 환자에 대 한 치료 방법을 개발 하. 모든 성별에 OE 모델의 적용 COPD 모델로 사용 하는 추가 지원을 빌려준다.

<table><tbody><tr><td>BALB/c mice</td><td>Slac Laboratory Animal,Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.</td></tr><tr><td>Individual ventilated cages</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>Model Number: MU64S7</td><td>The cages were used for housing mice in the animal facility.</td></tr><tr><td>Sealing perspex-box</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>The box was used&amp;nbsp; to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.</td></tr><tr><td>Electric generator</td><td>Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany</td><td>Model 500&amp;nbsp;</td><td>The device was used for generating ozone.</td></tr><tr><td>Ozone probe</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK</td><td>Ozone 300</td><td>The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P3761</td><td>Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.</td></tr><tr><td>Micro-Computed Tomography</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>RS0800639-0075</td><td>This device was used for acquiring images of the lung.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 ABA software</td><td>GE Healthcare, London, ON, Canada</td><td>Micro-view 2.01&amp;nbsp;</td><td>This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.</td></tr><tr><td>Treadmill machine&amp;nbsp;</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>This machine was usd for fatigue test.</td></tr><tr><td>Body plethysmograph</td><td>eSpira&amp;trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>This device was used to test spirometry pulmonary function.</td></tr><tr><td>Ventilator</td><td>eSpira&amp;trade; Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK</td><td>Forced Manoeuvres System</td><td>This device was used to test spirometry pulmonary function.</td></tr><tr><td>Slide spinner centrifuge</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183&amp;nbsp;</td><td>It was used to spin BALF cells onto slides.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, Shanghai, China</td><td>RE04000054</td><td>&amp;nbsp;It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, USA</td><td>4000</td><td>It was used to count cells.</td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100704</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100747</td><td>They were used to test the respective factors in serum.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td>The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Hualing, Shanghai, China</td><td>56#</td><td>It was used to embed the lung.</td></tr><tr><td>Rotary Microtome</td><td>Leica, Wetzlar,&amp;nbsp; Hesse, Germany</td><td>RM2255</td><td>It was used for sectioning the lung.</td></tr><tr><td>Hgaematoxylin and Eosin (H&amp;amp;E) staining solution</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>G1120</td><td>H&amp;amp;E staining was done for morphometric analysis.</td></tr><tr><td>Upright bright field microscope</td><td>Olympus, Center Valley, PA, USA</td><td>CX41</td><td>It was used to image the H&amp;amp;E staining slides.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, CA, USA</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>It was used to count the number of alveoli on the H&amp;amp;E stained images.</td></tr><tr><td>GraphPad prism 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad prism 5</td><td>It was used for data analysis and production of figures.</td></tr></tbody></table>

generation of a chronic obstructive pulmonary disease model in mice by repeated ozone exposure

만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 지속적인 공기 흐름 제한 및 폐 parenchymal 파괴에 의해 특징입니다. 그것은 인구 고령 화에 매우 높은 발생률 있습니다. 의약품에 대 한 COPD 초점 주로 증상 수정; 현재 기존의 치료 따라서, 새로운 치료법의 개발이 절실히 필요 합니다. COPD의 자격 갖춘된 동물 모델 기본 메커니즘을 특성화 하는 데 도움이 수와 새로운 약물 검사에 사용할 수 있습니다. 현재 COPD 모델, lipopolysaccharide (LPS) 또는 돼지 췌 장 elastase (PPE)-유도 기종 모델, COPD 모양의 병 변 폐와 기도에서 생성 하지만 그렇지 않으면 인간의 COPD의 병 인을 유사 하지 않습니다. 담배 연기 (CS)-유도 모델 뿐만 아니라 호흡기 시스템에 COPD와 같은 장애를 시뮬레이션 하지만 그것은 또한 인 간에 있는 COPD를 일으키는 주요 유해 물질 중 하나에 기반 하기 때문에 가장 인기 있는 중 하나에 남아 있다. 그러나, CS 유발 모델의 시간과 노동 집약적인 측면 극적으로 새로운 약물 검사에 응용 프로그램을 제한합니다. 이 연구에서 우리는 성공적으로 오존의 높은 수준에 쥐를 노출 하 여 새로운 COPD 모델 생성. 이 모델은 다음 설명: 1) 강제로 내쉬는 숨의 볼륨 25, 50, 및 75/강제 중요 한 용량 감소 (FEV25/FVC, FEV50/FVC, 고 FEV75/FVC), 폐 기능;의 악화를 나타내는 2) 확대 폐 폐 포, 폐 parenchymal 파괴; 3) 감소 피로 시간과 거리; 그리고 4) 염증 증가. 함께 찍은, 이러한 데이터는 오존 노출 (OE) 모델은 오존 노출 과도 COPD의 etiological 요인 중 하나는 인 간에 게 유사한 이므로 신뢰할 수 있는 동물 모델을 보여 줍니다. 또한, 그것은 단지 6-8 주, 3-12 개월 OE 모델 COPD 연구를 위한 좋은 선택 일지도 모 르다 나타내는 담배 연기 모델을 유도 해야 하는 반면 OE 모델을 만드는 데 우리의 이전 작업에 기반 했다.

각 그룹의 3 차원 µCT 이미지의 예는 그림 1는에 표시 됩니다. 오존 노출 쥐 상당히 큰 총 폐 볼륨 했다 (그림 1는 b)와 라 %그림 1(c) 보다 공기 노출 제어 마우스. 오존 노출31,32의 6 주 후 폐 볼륨 및 LAA % 상승 된 남아. 증가 폐 ...

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Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

이 연구는 반복적으로 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 동물 모델의 성공적인 세대를 설명 합니다.

반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

generation-chronic-obstructive-pulmonary-disease-model-mice-repeated

Research

JoVE Journal

Medicine

10.9K 조회수.  Cellular Biomedicine Group, Shanghai. 이 연구는 반복적으로 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 동물 모델의 성공적인 세대를 설명 합니다.

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Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

연구

면역학 및 감염병학

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

담배 연기에 노출 된 마우스의 폐 폐기종 및 작은기도 리모델링 자동 측정

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

의학

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a promising future of using miRNAs in the diagnosis and care of lung diseases. Here, we define a protocol for miRNA profiling to measure the relative abundance of a group of miRNAs predicted to regulate inflammatory genes in the lung tissue from of an ozone-induced airway inflammation mouse model. Because it has been shown that circulating sex hormone levels can affect the regulation of lung innate immunity in females, the purpose of this method is to describe an inflammatory miRNA profiling protocol in female mice, taking into consideration the estrous cycle stage of each animal at the time of ozone exposure. We also address applicable bioinformatics approaches to miRNA discovery and target identification methods using limma, an R/Bioconductor software, and functional analysis software to understand the biological context and pathways associated with differential miRNA expression.

Here we describe a method to assess lung expression of miRNAs that are predicted to regulate inflammatory genes using mice exposed to ozone or filtered air at different stages of the estrous cycle.

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

오존 노출 에 따른 폐포 대식세포 비세포증의 생체내 평가

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 호흡기 시스템 역학의 평가

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

생물학

Cigarette Smoke Exposure in Mice using a Whole-Body Inhalation System

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular diseases have been widely studied, however, the impact of CS in other tissues and organs such as blood and bone marrow remain incompletely defined. Finding the appropriate system to study the effects of CS in rodents can be prohibitively expensive and require the purchase of commercially available systems. Thus, we set out to build an affordable, reliable, and versatile system to study the pathologic effects of CS in mice. This whole-body inhalation exposure system (WBIS) set-up mimics the breathing and puffing of cigarettes by alternating exposure to CS and clean air. Here we show that this do-it-yourself (DIY) system induces airway inflammation and lung emphysema in mice after 4-months of cigarette smoke exposure. The effects of whole-body inhalation (WBI) of CS on hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in the bone marrow using this apparatus are also shown.

This protocol demonstrates the study of the pathophysiologic effects of cigarette smoke (CS) with a whole-body inhalation (WBI) exposure system (WBIS) built in-house. This system can expose animals to CS under controlled repeatable conditions for research of CS-mediated effects on lung emphysema and hematopoiesis.

전신 흡입 시스템을 사용하여 쥐의 담배 연기 노출

Close to 14% of adults in the United States were reported to smoke cigarettes in 2018. The effects of cigarette smoke (CS) on lungs and cardiovascular ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

마우스에 있는 기종의 평가를 위한 일정한 압력의 밑에 폐 고정

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

A Silicosis Mouse Model Established by Repeated Inhalation of Crystalline Silica Dust

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and treatment of silicosis in humans have all been extensively studied using the mouse silicosis model. By repeatedly making mice inhale CSD into their lungs, the mice can mimic the clinical symptoms of human silicosis. This methodology is practical and efficient in terms of time and output and does not cause mechanical injury to the upper respiratory tract due to surgery. Furthermore, this model can successfully mimic acute/chronic transformation process of silicosis. The main procedures were as follows. The sterilized 1-5 &#181;m CSD powder was fully ground, suspended in saline, and dispersed in an ultrasonic water bath for 30 min. Mice under isoflurane-induced anesthesia switched from shallow rapid breathing to deep, slow aspiration for approximately 2 s. The mouse was placed in the palm of a hand, and the thumb tip gently touched the lip edge of the mouse's jaw to straighten the airway. After each exhalation, the mice breathed in the silica suspension drop by drop through one nostril, completing the process within 4-8 s. After the mice's breathing had stabilized, their chest was stroked and caressed to prevent the inhaled CSD from being coughed up. The mice were then returned to the cage. In conclusion, this model can quantify CSD along the typical physiological passage of tiny particles into the lung, from the upper respiratory tract to the terminal bronchioles and alveoli. It can also replicate the recurrent exposure of employees due to work. The model can be performed by one person and does not need expensive equipment. It conveniently and effectively simulates the disease features of human silicosis with high repeatability.

This protocol describes a method for establishing a mouse model of silicosis through repeated exposure to silica suspensions via a nasal drip. This model can efficiently, conveniently, and flexibly mimic the pathological process of human silicosis with high repeatability and economy.

결정질 실리카 분진을 반복적으로 흡입하여 확립된 규폐증 마우스 모델

Silicosis can be caused by exposure to respiratory crystalline silica dust (CSD) in an industrial environment. The pathophysiology, screening, and ...

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse models continue to be an important tool for developing new anti-fibrotic strategies. In this study, intrapulmonary administration of bleomycin (BLM) is carried out by nasal nebulization to create a mouse model of pulmonary fibrosis that closely mimics clinical disease characteristics. C57BL/6 mice received BLM (7 U/mL, 30 min/day) by nasal nebulization for 3 consecutive days and were sacrificed on day 9, 16, or 23 to observe inflammatory and fibrotic changes in lung tissue. Nasal aerosolized BLM directly targeted the lungs, resulting in widespread and uniform lung inflammation and fibrosis. Thus, we successfully generated an experimental mouse model of typical human pulmonary fibrosis. This method could easily be used to study the effects of the administration of various nasal aerosols on lung pathophysiology and validate new anti-inflammatory and anti-fibrotic treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>비강 Bleomycin 분무에 의해 유도된 폐 섬유증의 마우스 모델

Various animal models of pulmonary fibrosis have been established using bleomycin to clarify the pathogenesis of pulmonary fibrosis and find new drug targets. However, most pulmonary fibrosis models targeting lung tissue have uneven drug administration. Here, we propose a model of uniform pulmonary fibrosis induced by nasal bleomycin nebulization.

비강 Bleomycin 분무에 의해 유도된 폐 섬유증의 마우스 모델

Pulmonary fibrosis is characteristic of several human lung diseases that arise from various causes. Given that treatment options are fairly limited, mouse ...