מטרת הליכים אלה היא להעריך את שלמות קרום הזרע באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ניתוח ציטומטריה זרימה. טכניקות אלה עשויות לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הרבייה כגון חיזוי פוטנציאל ההפריה ואיכות דגימת הזרע. היתרון העיקרי של טכניקות אלה הוא שהם מאפשרים הערכה מדויקת של קרום זרע מרובים אשר ידועים לקשר עם פוטנציאל הפריית זרע.
ההשלכות של טכניקות אלה להרחיב לקראת אבחון של איכות שפיכה כפי שהוא מאפשר הערכה מדויקת יותר של פלזמת זרע ושלמות קרום אקרוזום, כמו גם פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי. כדי להתחיל בהליך זה, להשיג כ 1 עד 6 מיליליטר של זרע שור בצינור 15 מיליליטר בטמפרטורת החדר. הוסף שישה מיליליטר של חיץ NKM מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לכל מיליליטר אחד של זרע.
צנטריפוגה ב 600 פעמים g במשך שמונה דקות. חזור על הצנטריפוגה פעם או פעמיים עד העל-טבעי ברור. לאחר מכן, מיד להשליך את רוב supernatant, משאיר כ סנטימטר אחד של על טבעי מעל גלולה.
בזהירות להישען על הצינורות בזווית של 30 מעלות באינקובטור ולחכות 20 עד 30 דקות כדי לאפשר את spermatozoa לשחות למעלה. באמצעות micropipette, להסיר בזהירות את מיליליטר הנותרים של על טבעי אשר מכיל כעת את זרע מוטיב ולהעביר אותו צינור טרי 1.5 מיליליטר. שמור על הזרע ב 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
ראשית, הכן את כל פתרונות המלאי הדרושים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר 133 microliters של spermatozoa מוטיב בריכוז של 25 מיליון זרע למיליליטר לצינור חדש 1.5 מיליליטר. הוסיפו 17 מיקרוליטרים של פתרון העבודה DAPI ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
צנטריפוגה ב 1,000 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר NKM לכדור. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של FITC-PSA, שני microliters של JC-1, ושלושה microliters של PI. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
צנטריפוגה ב 1,000 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת הכדור ב-40 מיקרוליטרים של מאגר NKM. לאחר מכן להעביר 10 microliters של המדגם לשקופית זכוכית.
מורחים את הדגימה ומוסיפים כיסוי. לאחר מכן, מיד להתחיל לדמיין את המדגם על ידי מיקרוסקופ epifluorescence עם מטרה 40X ומסנן משולש כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, באמצעות מצלמה דיגיטלית כדי ללכוד תמונה נפרדת עבור כל מסנן. השתמש באפשרות המיזוג בתוכנת המצלמה כדי למזג את שלוש התמונות שהתקבלו מהסננים, כדי לשמור את הקובץ החדש בתבנית JPEG.
פתחו את התמונה הממוזגת בעזרת כלי הצבע ולהשתמש באפשרות המברשת לסימני הזרע שנספרו. לאחר מכן, לסווג את spermatozoa מבוסס על הפלואורסצנטיות הנפלטת מכל בדיקה, הקפדה להעריך לפחות 200 spermatozoa לכל שקופית. כל התאים צריכים להופיע כחולים מ- DAPI.
לספור את התאים המתים, שנראים סגולים, כדי להעריך את הכדאיות. לאחר מכן השתמש בדפוסים של כתמי פלואורסצנטיות כדי להעריך את מצב האקרומוזום. לבסוף, להעריך את פוטנציאל קרום המיטוכונדריה על ידי הבחנה spermatozoa עם פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי גבוה אשר מציגים אמצע מוכתם אדום מן הזרע עם פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי נמוך אשר מציגים אמצע מוכתם ירוק.
לספור מידות אדומות וירוקות בנפרד ולחשב את היחס ביניהם. כדי להתחיל את הערכת שלמות קרום הפלזמה, לקחת את המספר הרצוי של בארות מן הכדאיות ואת ערכת הריכוז. מעבירים את בארות לבסיס העבודה ומכסים אותן במכסה גמיש כדי להגן עליהן מפני אור.
הוסף 199 מיקרוליטרים של פתרון במאגר עבור ציטומטריה לכל באר. לאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של זרע הומוגני בריכוז של 57 מיליון תאים למיליליטר לכל באר והומוגניזציה על ידי צינורות. מכסים את הצלחת עם המכסה ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאחר מכן, הפעל את המדגם דרך ציטומטר הזרימה באמצעות הגדרת הכדאיות. כדי להתחיל להעריך את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, להוציא את המספר הרצוי של בארות מתוך ערכת פעילות המיטוכונדריה. העבר אותם לבסיס העבודה.
מוסיפים 10 מיקרוליטרים של אתנול מוחלט לכל באר ולהשתמש פיפטה כדי לנצל מחדש את האבקה הקיימת בתוך באר. הוסף 190 microliters של PBS לגם הומוגניזציה על ידי pipetting. הוסף 0.75 מיקרוליטרים של זרע הומוגני בריכוז של 57 מיליון תאים למיליליטר לכל באר והומוגניזציה על ידי צינורות.
מכסים את הצלחת עם המכסה והדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, הפעל את המדגם דרך ציטומטר הזרימה באמצעות הגדרת הפעילות המיטוכונדרית. כדי להתחיל להעריך את שלמות הממברנה האקרוזומלית, להוציא את המספר הרצוי של בארות מן הכדאיות ואת ערכת שלמות acrosome.
מעבירים את בארות לבסיס העבודה ומכסים אותן במכסה גמיש כדי להגן עליהן מפני אור. הוסף 200 מיקרוליטרים של פתרון במאגר עבור ציטומטריה לכל באר. לאחר מכן הוסיפו 0.7 מיקרוליטרים של זרע הומוגני בריכוז של 57 מיליון תאים למיליליטר לכל באר והומוגניזציה על ידי צינורות.
מכסים את הצלחת עם המכסה ואת הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לאחר מכן, הפעל את המדגם דרך ציטרומטר הזרימה באמצעות הגדרת התובנה. במחקר זה, איכות הזרע מוערכת בטכניקות שונות, שאחד מהם העריך קרום זרע באמצעות בדיקות פלואורומטריות.
ניתן להעריך את ההבדלים באיכות דגימת הזרע במונחים של שלמות קרום. לדוגמה, השפיכה של שור מספר שבע היה אחוז נמוך יחסית של תאים מתים, שיעור נמוך של זרע עם אקרוסום פסאודו-הגיב, ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי גבוה יותר בהשוואה לשפיכה של שור מספר אחד. דגימות לאחר מכן מוערכים עבור הכדאיות ופעילות המיטוכונדרית.
ההיסטוגרמות לדוגמאות מייצגות אלה מייצגות את הזרע והפסולת המגודרים ואת הזרע המגודר. היסטוגרמות אלה מייצגות גם את התאים קיימא ומתים ואת התפלגות של זרע קרום מיטוכונדריאלי מקוטב דה מקוטב. שלמות האקרואז מוערכת לאחר מכן עם ערכה מוכנה לשימוש ולקרוא עם ציטומטריית זרימה, חלוקת האזור לשלושה אזורי סמן המייצגים תאים פלואורסצנטיים נמוכים זניחים עם אקרומוזום לא מוכתם שלם, תאים פלואורסצנטיים נמוכים עם חלק מוכתם שיורית של האקרואז, ותאים פלואורסצנטיים מאוד עם קרום משובש.
בעת ניסיון הליכים אלה, חשוב לוודא להכין כראוי את דגימת הזרע הראשונית. טכניקות אלה יכולות לספק תובנה להערכת איכות הזרע ו ניתן ליישם אותן על אורגניזמים שונים כגון בשר חזיר, עופות ואנושיים. השוואה בין שתי הטכניקות, הכתמה מרובעת וציטומטריית זרימה לא הצביעה על הבדלים משמעותיים בכדאיות, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ושלמות האקרוזום החושפת כי שתי הטכניקות הניבו תוצאות תואמות.
