Name: handling and treatment of male european eels (anguilla anguilla) for hormonal maturation and sperm cryopreservation
Uploaded: 2018-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation at JoVE.com

פרסום זה מומן על ידי אופק 2020 המחקר האיחוד האירופי, חדשנות תוכנית בהסכם גרנט מארי Sklodowska-קירי לא 642893 (מראה מרהיב), המשרד העלות (עלות הפעולה פא 1205, AQUAGAMETE), ואת מרכז המחקר של המצוינות- 1476-4/2016/FEKUT.

כל ההליכים לעבודה עם צלופח האירופית שמתואר פרוטוקול זה אושרו על-ידי ועדה של אתיקה של חיה הניסויים-València דה Politècnica Universitat, בעקבות הספרדי החוקים והתקנות שליטה הניסויים ו ההליכים בבעלי חיים.
1. דג תחזוקה
<ol><li>להביא את צלופחים האירופית מתקן מחקר ולשים אותם aquaria 200 L עם מערכת recirculation. השתמש טרמוסטטים וגופי כדי לשמור על טמפרטורה קבועה-20 ° C.</li>
	<li>לשמור על הדגים בתנאים כהה כדי למנוע מתח22 , בלי אוכל במהלך הניסוי.</li>
	<li>לשמור את הדגים במים מתוקים במהלך 3 הימים הראשונים. ואז לשנות את 1/3 מכמות המים, ממלאים עם מי ים בכל יום עד שהגיע עם מליחות של 37.0 ± 0.3 g/ל'</li>
</ol>2. טיפול הורמונלי
הערה: טיפול הורמונלי מורכב זריקות שבועיות של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) לאורך כל משך (9 שבועות) הניסוי.
<ol><li>הכן את ההורמון hCG מראש-ריכוז של IU 1/µL על ידי דילול ההורמון בתמיסת (0.9% NaCl). הערה: ההורמון יכול להישמר מדולל בריכוז זה במשך יותר משבוע ב-18 ° c</li>
	<li>כדי עזים ומתנגד הדגים, להכין 40 אני גמיש דלי עם 5 L של מערכת המים.<ol>
<li>בבקבוקון 250 מ ל, לדלל 300 מ"ג בנזוקאין ב- 100 מ של 70% אתנול.</li>
		<li>יוצקים את בנזוקאין מדולל בדלי (הריכוז הסופי 0.36 מ מ) ומערבבים היטב. . זה ריכוז בנזוקאין הסופי של 60 מ ג/ל'</li>
		<li>להעביר את הדגים, בנפרד, לתוך המים עם בנזוקאין, המתן מספר שניות עד בנזוקאין נכנס לתוקף, הדג הוא מורדם כראוי. הערה: כדי לאשר הדגים. הוא מורדם, מניחים את הדגים במצב פרקדן, בדוק כי זה נשאר עדיין במצב הזה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לנהל את ההורמון, שוקל את הדגים ולהכין ההורמון hCG במינון של 1.5 IU/g של דגים, צינור פלסטיק 1.5 מ.<ol>
<li>ממלאים מזרק 1 מ"ל ההורמון hCG מהצינור פלסטיק.</li>
		<li>מניחים את הדגים anesthetized במצב פרקדן, עם הסיוע או את המזרק, להזריק הורמון בקפידה באזור בקרום הבטן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להחזיר את הדגים באקווריום, לפקח עליו עד החלים לחלוטין. הערה: המינהל הורמונלי צריך להתנהל שבועית לאורך כל הניסוי. בדרך כלל, צלופחים האירופית להתחיל spermating לאחר 6-7 שבועות של טיפול הורמונלי.</li>
</ol>3. זרע הדגימה
<ol><li>כדי להשיג את הדוגמאות הטובות ביותר של איכות, תמצית זרע 24 שעות לאחר ניהול הורמונלי6,23.</li>
	<li>עזים ומתנגד הדג עם בנזוקאין כפי שמתואר בשלב 2.2.</li>
	<li>מניחים את הדגים anesthetized במצב פרקדן, אזור איברי המין עם טיפת מים מזוקקים יבש ונקי בקפידה בנייר, כדי להימנע צואה זיהום נוכח באזור איברי המין או הפעלת זרע בשוגג על ידי מגע עם מי ים באקווריום.</li>
	<li>הנחת האצבעות על משני צדי הדג, עיסוי בקפידה הקשת רוחבית מ במינימום באזור איברי המין כדי לאלץ את הזרע החוצה.<ol>
<li>חזור על העיסוי עד אין תאי זרע נוסף יוצא מן הפתח באברי המין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף את הזרע לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל באמצעות משאבה ואקום.</li>
	<li>לדלל את הזרע שחולצו 1:10 ששונה Tanaka´s extender פתרון24 (137 מ"מ NaCl, 76.2 מ מ NaHCO3, בתוך מים מזוקקים) ב- 4 ºC. הערה: הזרע בפתרון ה-extender אמור להישמר 4 ºC.</li>
</ol>4. הערכת איכות הזרע
<ol><li>להכין מי ים מלאכותי13 (במ מ: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9.9, נה2אז4 28.2, אשלגן כלורי 9.4, במים מזוקקים) עם 2% שור אלבומין (BSA) (w:v), להתאים את ה-pH ל 8.2, osmolality עד 1100 mOsm/kg ולתחזק זה 4 ºC כדי למנוע התפתחות חיידקים.</li>
	<li>פתח את תוכנת המחשב בסיוע זרע בניתוח (CASA) ובחר את המודול זרע של דג.<ol>
<li>לחץ על מאפיינים כדי לפתוח את הגדרת המערכת של התוכנה. שם, הגדר את האפשרויות לכידת-60 תמונות בשניה. אופטיקה בחר שלב שלילית, Makler קאמרית, סולם X 10.</li>
		<li>ואז על ניתוח הערכים, בחר דגים מינים, חלקיקים אזור גדול יותר מיקרומטר 22 וקטנות יותר מיקרומטר 202.</li>
		<li>על הפרמטרים מהירות, הגדר איטי כאשר תאים לעבור בין 10 ל- 45 מיקרומטר/s, מוגדר בינוני כאשר נע בין 45 ל 100 מיקרומטר/s מוגדר מהירה כאשר זז מהר יותר 100 מיקרומטר/s. הערה: Spermatozoa עם מהירות איטית יותר מ- 10 מיקרומטר/s נחשבו immotile.</li>
		<li>בחר את ערכי מתקדמת כמו 80% של יושר (STR) ולשמור את המאפיינים.</li>
		<li>לחץ על השדה ללכוד (חלון עם תמונות בשידור חי מן המצלמה תיפתח). הערה: מערכת ניתוח המחשב בסיוע זרע נוצר על ידי מיקרוסקופ, מצלמה, תוכנת ניתוח של התמונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>על החדר ספירה, לשים 4 µL של מי ים מלאכותי, להוסיף 0.5 µL של זרע פתרון (זרע מדולל בפתרון ה-extender).<ol>
<li>למקד את התמונה עם המיקרוסקופ בהגדלה X 10 בשלב שלילי. 15 s לאחר ההפעלה, לחץ על לכידת - וידאו בתוכנת ניתוח המחשב בסיוע זרע.</li>
		<li>לנתח כל מדגם triplicate ובחרו הדגימות עם תנועתיות גבוה יותר מאשר 70 אחוז על הקפאה קריוגנית. הערה: חשוב מאוד לבחור רק באיכות גבוהה זרע להצלחת פרוטוקול זה הקפאה קריוגנית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. זרע שיטת הקפאה
<ol><li>להכין מראש חנ (כ- 2.5 L) ב 34 ס"מ x 34 ס"מ x 30 ס מ ו תיבת קלקר בעובי 5 ס מ. הערה: לשמור על רמה של חנקן נוזלי של 4-5 ס מ גובה כל הזמן.<ol>
<li>לבנות מבנה צפה מראש להקפיא את הזרע. 2 חתיכות פוליסטירן (20 ס מ x 5 ס מ), לאגד אותם עם 2 צינורות פלסטיק ושימוש במקום המבנה על-החנקן הנוזלי. מבנה זה צריך לרחף מעל החנקן הנוזלי בגובה משוער של 3 ס מ מעל פני השטח (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56835/56835fig1.jpg"> איור 1 . הסכימטי של המבנה צף המשמש עבור הקפאת מראש על חנקן נוזלי. המבנה מורכב שתי חתיכות של צפיפות נמוכה קלקר של 20 ס"מ על 4 ס"מ x 5 ס מ מחובר עם צינורות פלסטיק של 14 ס מ. הקשיות ממוקמים מעל צינורות פלסטיק של 3 ס מ מעל החנקן הנוזלי. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56835/56835fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"><li>הכן את הפתרון הקפאה קריוגנית על ידי ערבוב זרע, פתרון ה-extender, מתנול ביחס של 1:8:1 1.5 mL פלסטיק צינורות ומערבבים בעדינות.</li>
	<li>בעזרת פיפטה, להוסיף µL 480 של הפתרון הקפאה קריוגנית לתוך קשיות µL 500, במידת הצורך, לסמן אותם על-ידי סגירת קצה אחד עם דגמי חמר.</li>
	<li>לשים את הקש על המכשיר צף בגובה של 3 ס מ מעל החנקן הנוזלי למשך 3 דקות. אז, במקום את הקש לתוך החנקן הנוזלי.</li>
	<li>לאחר 10-15 דקות, להעביר את הקשיות לתוך מיכל אחסון בחנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ארוכות ולשמור אותם שקועים חנקן נוזלי בכל עת. . הנה, הזרע ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן.</li>
</ol>6. שיטת מפשיר
<ol><li>הכנת קופסת קלקר עם חנקן נוזלי, כפי שמתואר בשלב 5.1 והכן באמבט מים באמצעות 3 L גביע עם מי ברז ב 40 ºC.</li>
	<li>להעביר את הקשיות בזרע קפוא מ למיכל אחסון לתוך התיבה קלקר עם חנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ארוכות.<ol>
<li>לשים כל קש לתוך אמבט מים ב 40 ºC עבור 13 s.</li>
		<li>שופכים את הזרע לתוך צינור פלסטיק 1.5 mL על ידי גזירה את קצוות סגורים של הקש עם מספריים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לנתח את תנועתיות הזרע באמצעות המחשב בסיוע זרע ניתוח המערכת כמוסבר בשלב 4.1.</li>
	<li>שמור µL 100 של זרע כדי לנתח את הכדאיות של spermatozoa עם cytometer זרימה.</li>
</ol>7. דנ
<ol><li>להשתמש ערכת פלורסנט המכיל propidium יודיד (PI), אשר הוא מתחם ניאון אדום זה מכתים את הגרעינים של תאים מתים, ממברנה-permeant מתחם פלורסנט גרעינית, ירוק מכתים את הגרעינים של תאים חיים.<ol>
<li>הכן את הפתרון מכתימים ניאון ירוק על ידי לדלל אותה מן המניות פתרון (1 מ מ) 1:10 Tanaka´s בינוני לפתרון עבודה של 100 מיקרומטר.</li>
		<li>לא לדלל את הפתרון PI. הפתרון מניות הוא 2.4 מ"מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור כל דגימה, לקחת 50 µL של זרע טרי או המופשרים ולהוסיף 0.5 µL של פלורסנט ירוק מכתים הפתרון עובד (ריכוז סופי 1 מיקרומטר) ו- 2 µL של פתרון PI (ריכוז סופי 100 מיקרומטר).</li>
	<li>דגירה בדגימות המכיל הצבעים (PI, צביעת ניאון ירוק) בחושך במשך 5 דקות.<ol>
<li>לדלל את הדגימות ב 500 µL של פתרון ה-extender Tanaka´s ולנתח עם cytometer הזרימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפעיל את cytometer זרימה וליצור פרוטוקול חדש המכיל לפחות 2 מגרשים: SS רישום יומן vs FS, FL1 לעומת FL3. הערה: שני, פלורסנט יודיד מכתים, propidium יכול להיות שמחים עם אור גלוי באורך הגל הירוק. מתי קשור ל- DNA, פליטת קרינה פלואורסצנטית מרבי צבעים אלה הם 516 nm ו 617 nm, בהתאמה.<ol>
<li>התאם את המתחים של לייזרים שונים: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372</li>
		<li>להגדיר את הסכם רכישה הגדרות לאירועים מרבי = s 5000 או 15 (הריכוז הסופי של המדגם צריך להיות כ- 1 מיליון של תאים/mL). קרא את הדגימה באמצעות זרם נמוך .</li>
		<li>בחר את מצב הקריאה צינור יחיד קבוע בעמדה מצב.</li>
		<li>הכניסו את הדגימה המספר הנכון של הקרוסלה</li>
		<li>לקרוא את הדגימה (הקשת F9) ולשמור את הנתונים שנאספו לקובץ excel (לחיצה על F7) לצורך ניתוח נוסף.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>ICES_Working_Group_on_Eels. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. , 246 (2011).</li><li>Moriarty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Catches+of+Elver+of+1928-1988.">European Catches of Elver of 1928-1988.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 75 (6), 701-706 (1990).</li><li>Dekker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractal+geometry+of+the+European+eel+stock.">The fractal geometry of the European eel stock.</a> ICES J. Mar. Sci. 57 (1), 109-121 (2000).</li><li>Jacoby, D., Gollock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. , (2014).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hCG+as+spermiation+inducer+on+European+eel+semen+quality.">Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality.</a> Theriogenology. 66 (4), 1012-1020 (2006).</li><li>P&#233;rez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+and+spermiation+in+the+male+European+eel:+assessment+of+sperm+quality+throughout+treatment.">Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment.</a> J. Fish Biol. 57 (6), 1488-1504 (2000).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+effects+of+thermal+regime+and+alternative+hormonal+treatments+on+the+reproductive+performance+of+European+eel+males+(Anguilla+anguilla)+during+induced+sexual+maturation.">Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation.</a> Aquaculture. 354, 7-16 (2012).</li><li>Asturiano, J. F., S&#248;rensen, S. R., P&#233;rez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+Production+of+Larvae+Using+Cryopreserved+Sperm:+Effects+of+Preservation+Temperature+and+Cryopreservation+on+European+Eel+Sperm+Fertilization+Capacity.">First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity.</a> Reprod. Domestic Anim. 51 (4), 485-491 (2016).</li><li>Di Biase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-treatment+with+androgens+during+artificial+induction+of+maturation+in+female+eel,+Anguilla+anguilla:+Effects+on+egg+production+and+early+development.">Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development.</a> Aquaculture. 479, 508-515 (2017).</li><li>Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+in+female+silver+eels,+Anguilla+australis:+The+benefits+of+androgen+pre-treatment.">Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment.</a> Aquaculture. 437, 111-119 (2015).</li><li>Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+manipulations+for+the+enhancement+of+sperm+production+in+cultured+fish+and+evaluation+of+sperm+quality.">Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality.</a> Aquaculture. , (2016).</li><li>Ohta, H., Izawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diluent+for+cool+storage+of+the+Japanese+eel+(Anguilla+japonica)+spermatozoa.">Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa.</a> Aquaculture. 142 (1-2), 107-118 (1996).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Eel+Sperm+Diluent+for+Short-term+Storage.">European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage.</a> Reprod. Domestic Anim. 45 (3), 407-415 (2010).</li><li>Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+by+the+environmental+concentration+of+ions+of+the+potential+for+motility+in+Japanese+eel+spermatozoa.">Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa.</a> Aquaculture. 198 (3), 339-351 (2001).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm.">Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 28 (1), 501-502 (2003).</li><li>Asturiano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physio-chemical+characteristics+of+seminal+plasma+and+development+of+media+and+methods+for+the+cryopreservation+of+European+eel+sperm.">Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm.</a> Fish Physiol. Biochem. 30 (3), 283-293 (2004).</li><li>Szab&#243;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+sperm+using+different+extenders+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants.</a> Acta. Biol. Hung. 56 (1-2), 173-175 (2005).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sperm+of+farmed+European+eel+Anguilla+anguilla.">Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla.</a> J World Aquac Soc. 35 (2), 225-231 (2004).</li><li>Pe&#241;aranda, D. S., P&#233;rez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+European+eel+sperm+cryopreservation+method+by+preventing+spermatozoa+movement+activation+caused+by+cryoprotectants.">Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants.</a> Cryobiology. 59 (2), 119-126 (2009).</li><li>Marco-Jim&#233;nez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+European+eel+(Anguilla+anguilla)+spermatozoa:+effect+of+dilution+ratio,+foetal+bovine+serum+supplementation,+and+cryoprotectants.">Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants.</a> Cryobiology. 53 (1), 51-57 (2006).</li><li>Asturiano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sperm+cryopreservation+on+the+European+eel+sperm+viability+and+spermatozoa+morphology.">Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology.</a> Reprod. Domestic Anim. 42 (2), 162-166 (2007).</li><li>Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Sexual+Maturation+in+Wild+Female+European+Eels+(Anguilla+anguilla)+in+Darkness+and+Light.">Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light.</a> Isr. J. Aquac. 64, (2012).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+induction+of+maturation+and+fertilization+in+the+Japanese+eel,+Anguilla+japonica.">Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica.</a> Fish Physiol. Biochem. 17 (1), 163-169 (1997).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cryopreservation+of+sperm+of+Japanese+eel.">Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel.</a> J. Fish Biol. 60 (1), 139-146 (2002).</li><li>Gallego, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+pattern+of+eel+spermatozoa+is+affected+by+post-activation+time,+hormonal+treatment+and+the+thermal+regimen.">Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen.</a> Reprod. Fertil. Dev. 27 (3), 529-543 (2015).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. , (2016).</li><li>Kime, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-assisted+sperm+analysis+(CASA)+as+a+tool+for+monitoring+sperm+quality+in+fish.">Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130 (4), 425-433 (2001).</li><li>Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+of+sperm+motility+and+factors+affecting+sperm+quality+in+cultured+fish.">The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish.</a> Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).</li><li>Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+assisted+semen+analyzers+in+andrology+research+and+veterinary+practice.">Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice.</a> Theriogenology. 57 (1), 149-179 (2002).</li><li>Magnotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+vitrification+of+fish+semen:+a+review+with+special+emphasis+on+marine+species.">Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species.</a> Rev. Aquacult. , (2016).</li><li>Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domaga&#322;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-thawed+motility+and+fertility+from+Atlantic+salmon+(Salmo+salar+L.)+sperm+frozen+with+four+cryodiluents+in+straws+or+pellets.">Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets.</a> Theriogenology. 76 (2), 300-311 (2011).</li><li>Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitable+methods+for+cryopreservation+of+semen+from+Atlantic+halibut,+Hippoglossus+hippoglossus+L.">Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L.</a> Aquac. Int. 16 (6), 561-572 (2008).</li><li>M&#252;ller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japanese+eel+(Anguilla+japonica+Temminck+&amp;+Schlegel,+1846)+propagation+using+cryopreserved+sperm+samples.">Japanese eel (Anguilla japonica Temminck &amp; Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples.</a> J. Appl. Ichthyol. 33 (3), 550-552 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר את התהליך המלא של הקפאה קריוגנית, התבגרות, טיפול, זרע, צלופח האירופית. גידול בתנאים המתוארים כאן הם אופטימלית עבור התבגרות מהירה והפקה של אמצעי אחסון גבוהה באיכות גבוהה הזרע הזה מינים 6,7,25. ההצלחה של פרוטוקול זה הקפאה קריו?...

במהלך 25 השנים האחרונות, המספר של צלופחים האירופית (אנגווילה אנגווילה) המגיעים בחוף באירופה ירדו בהתמדה על ידי 90% 1,2,3. ישנם מספר גורמים המסבירים זו ירידה דרסטית כולל זיהום, זיהומים, דייג והרס בית גידול. כל זה יש לו השפעה עמוקה על מין זה, המוביל אל ההכללה של הצלופח האירופית על האיחוד הבינלאומי לשימור הטבע (IUCN) רשימת כמו בסכנת הכחדה קריטית 4. כתוצאה מכך, התפתחות טכניקות ופרוטוקולים עבור רבייה בשבי נחוצים.
ההבשלה של הצלופח האירופית בשבי מושגת על ידי טיפול הורמונלי 5,6,7 אבל בייצור גמטות משני המינים קשה לסנכרן את 8. למרות ההתפתחות של השתלים אנדרוגן חדשים הראו להאיץ oogenesis צלופחים 9,10, העיתוי של ההבשלה הסופי אצל נקבות הוא עדיין מאוד משתנה וקשה לשלוט 11. לכן, אחסון לטווח קצר של הזרע 12,13,14 והקפאה קריוגנית טכניקות נחוצים עבור ניהול רבייה, גורם תא רבייה סינכרון מיותרים 8.
הקפאה קריוגנית בזרע צלופח האירופית פותחה מאז 2003 15,16. מספר חוקרים תוכנן פרוטוקולים מוצלח באמצעות דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או מתנול cryoprotectants 16,17,18,19,20. למרות פרוטוקולים שימשו בהצלחה, הכדאיות שהושג תא הזרע המופשרים cryopreserved עם דימתיל סולפוקסיד הוא נמוך יותר מאשר עם מתנול 20,21. יתר על כן, צלופח זרע מופעל במגע עם דימתיל סולפוקסיד ודורש יותר מייגע זרע מניפולציה 19, לכן מתנול cryoprotectant מתאים יותר לזרע צלופח האירופי מאשר דימתיל סולפוקסיד.
. הנה, פרוטוקול טיפול אופטימלי וטיפול הורמונלי הצלופח האירופית שיפורט להלן. בנוסף לכך, הפרוטוקול הטוב ביותר של הקפאה קריוגנית זרע צלופח האירופי שימוש מתנול cryoprotectant ופרוטוקול להערכת איכות זרע במין הזה יהיה גם המתואר.

<table><tbody><tr><td>AQUACEN BENZOCA&amp;Iacute;NA +D2A2:D24</td><td>AQUACEN</td><td>3394ESP</td><td>Benzocaine</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Avantor&amp;nbsp;</td><td>3624-19</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td>Syringe 1 mL</td></tr><tr><td>FC500</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr><tr><td>Air pump 100</td><td>EHEIM</td><td>4011708370032</td><td>Modified for suction</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5</td><td>Eppendorf</td><td>175508</td><td>Plastic tubes 1.5 mL</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Falcon</td><td>175747</td><td>Plastic tubes 15 mL</td></tr><tr><td>Flexible bucket</td><td>Fiel</td><td>1040101</td><td>40 L, Black color.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guinama SL</td><td>Mg96270</td><td></td></tr><tr><td>Cyopreservation straws&amp;nbsp;</td><td>IMV Technologies</td><td>14550</td><td>500 &amp;micro;L straws</td></tr><tr><td>Live/Dead Sperm Viability Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L7011</td><td>Cytometer Kit</td></tr><tr><td>Modelling clay</td><td>JOVI</td><td>Art 30</td><td>4 different colors</td></tr><tr><td>Precision scale PCB</td><td>KERN &amp;amp; Sohn GmbH</td><td>PCB35002</td><td>Digital scale</td></tr><tr><td>Saline solution Vitulia 0.9%</td><td>Laboratorios Ern, S.A.</td><td>C.N. 999790.8</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Levantina de Lab. SL</td><td>3710025</td><td>30 cm metal forceps</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Levantina de Lab. SL</td><td>3700014</td><td>Scissors 14cm</td></tr><tr><td>Ovitrelle (r-hCG)</td><td>Merck SL</td><td>EMEA/H/C/000320</td><td>Human chorionic gonadotropin</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac Quimica SAU</td><td>2112211210</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac Quimica SAU</td><td>3257091611</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac Quimica SAU</td><td>1416381210</td><td></td></tr><tr><td>782M Camera</td><td>Proiser</td><td>782M</td><td>Camera for CASA</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>Proiser</td><td>ISAS v1</td><td>CASA software</td></tr><tr><td>SpermTrack-10</td><td>Proiser</td><td>SpermTrack-10</td><td>Countig chamber for CASA</td></tr><tr><td>Beaker Pyrex 3L</td><td>PYREX</td><td>2110668</td><td>Glass beaker 3L</td></tr><tr><td>Flask Pyrex 250 GL-45</td><td>PYREX</td><td>21801365</td><td>Glass flask 250 mL</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Scharlab SL</td><td>PO02000500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Scharlab SL</td><td>ME03061000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scharlab SL</td><td>MA00370500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05482</td><td>Bovine serum albumina</td></tr><tr><td>Styrofoam box</td><td></td><td></td><td>34x34x30 cm and 5cm thick</td></tr></tbody></table>

handling and treatment of male european eels (anguilla anguilla) for hormonal maturation and sperm cryopreservation

במהלך השנים האחרונות, מספר קבוצות מחקר עובדים על פיתוח, שיפור של פרוטוקולים חדשים עבור טיפול צלופח האירופית ו ההבשלה. כמו של עוד, זריקות שבועיות של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) הוכח כי maturate זכרים אחרי רק 5-6 שבועות של טיפול, בהפקת כרכים גבוהה של זרע באיכות גבוהה במהלך מספר שבועות. בנוסף, פרוטוקולים הקפאה קריוגנית הזרע באמצעות מרחיקי שונים, cryoprotectants, קירור, מפשיר פעמים בעבר תוארו עבור צלופח האירופית. כאן, נראה כי הפתרון extender Tanaka´s ניתן להשתמש ישירות עבור הפריה או הקפאה קריוגנית, עושה את השימוש של סוגים שונים של פתרונות דילולים מיותרים. יתר על כן, השימוש של מתנול cryoprotectant הופך את פרוטוקול זה קל לשימוש כפי מתנול יש רעילות נמוכה והוא אינו מפעיל את הזרע. הזרע אינו צריך להיות cryopreserved מיד לאחר התוספת של cryoprotectant, זה יכול לשמש זמן רב לאחר להיות הקרת. יתר על כן, תנועתיות הזרע הוא עדיין גבוה לאחר מפשיר למרות שזה נמוך יותר מזה של זרע טרי. מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול זמינים בצורה הטובה ביותר עבור אירופה צלופח טיפול, התבגרות, הקפאה קריוגנית זרע.

הזרע של צלופחים 18 עם תנועתיות הזרע 70% ומעלה, נבחר במחקר זה. התוצאות הראו ירידה בפרמטרי איכות כל לאחר מפשיר בהשוואה לאלו של זרע טרי (טבלה 1 ואיור 2). התוצאות תנועתיות (זאת אומרת ± S.E.M., n = 18) הראו על תנועתיות מוחלט גבוה יותר, תנועתיות מתקדמת של זרע טרי יו...

Watch this Scientific Journal Video about Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation at JoVE.com

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

פרוטוקולים עבור הקפאה קריוגנית, התבגרות, זרע, צלופח האירופית שופרו בשנים האחרונות. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול הטוב ביותר הזמינים באמצעות גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עבור גרימת ההבשלה, מתנול כמו cryoprotectant.

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

handling-treatment-male-european-eels-anguilla-anguilla-for-hormonal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

7.8K Views.  Universitat Politècnica de València. פרוטוקולים עבור הקפאה קריוגנית, התבגרות, זרע, צלופח האירופית שופרו בשנים האחרונות. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול הטוב ביותר הזמינים באמצעות גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עבור גרימת ההבשלה, מתנול כמו cryoprotectant.

Video: Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.

Endocrine Disrupting Compounds (EDC) pose a substantial risk to the aquatic environment. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. The methodology provided in this paper allows for an assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to EDC removal.

שימוש בסוללה של שיטות כימיות Ecotoxicological עבור הערכת היעילות של תהליכי טיפול בשפכים להסיר אסטרוגניים און

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in ...

Environment

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Implantation of a New Micro Acoustic Tag in Juvenile Pacific Lamprey and American Eel

Juvenile Pacific Lamprey and American eels were used for laboratory evaluations to determine potential effects from tag implantation. Telemetry technology has been identified as a way to obtain more detailed information on movement and behavior across a broader spatial scale than is possible with other known technology. The purpose of this method is to provide a detailed step by step instruction on tag implantation for both lampreys and eel. For laboratory studies using actively migrating juvenile Pacific Lamprey (120-160 mm), we determined that the presence of the tag did not alter the swimming ability between tagged and untagged Individuals or have any significant tag loss (&lt;3%). Similar results were determined during laboratory testing of Yellow phase American Eels (113-175 mm). No mortality occurred during a 38-day holding period and there was minimal tag loss (3.8%). The presence of the tag did not have any significant effect on the swimming ability or survival of tagged eels compared to untagged controls and there was minimal tag loss.

This article illustrates the procedure for implanting a micro acoustic tag in juvenile Pacific Lamprey and American Eel. Our application is based on laboratory trials, which indicate that acoustic tags can be successfully implanted with no apparent effects on swimming ability or survival and minimal tag loss.

השרשה של תגית חדשה אקוסטית מיקרו עגולי הפה השקט לנוער, צלופח אמריקאי

Juvenile Pacific Lamprey and American eels were used for laboratory evaluations to determine potential effects from tag implantation. Telemetry technology ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

אוסף המשחק ו הפריה חוץ גופית של Astyanax מקסיאנוס

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology research. Medaka is also used extensively to investigate vertebrate reproduction, which is an essential biological function as it allows a species to perpetuate. Sperm quality is an important indicator of male fertility and, thus, reproduction success. Techniques for extracting sperm and sperm analysis are well documented for many species, including teleost fish. Collecting sperm is relatively simple in larger fish but can be more complicated in small model fish as they produce less sperm and are more delicate. This article, therefore, describes two methods of sperm collection in the small model fish, Japanese medaka: testes dissection and abdominal massage. This paper demonstrates that both approaches are feasible for medaka and shows that abdominal massage can be performed a repeated number of times as the fish quickly recover from the procedure. This article also describes a protocol for computer-assisted sperm analysis in medaka to objectively assess several important indicators of medaka sperm quality (motility, progressivity, duration of motility, relative concentration). These procedures, specified for this useful small teleost model, will greatly enhance understanding of the environmental, physiological, and genetic factors influencing fertility in vertebrate males.

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

This article describes two quick and efficient methods for collecting sperm from the small model fish medaka (Oryzias latipes), as well as a protocol for reliably assessing sperm quality using computer-assisted sperm analysis (CASA).

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ומניפולציה