אסטיאנה מקסיקניוס, הידוע גם בשם דג המערה המקסיקני העיוור, מתגלה כאורגניזם מודל למגוון תחומי מחקר במדע הביולוגי, במיוחד בהבנת האבולוציה של תכונות גנטיות אדפטיביות. מין זה מורכב ממורף פני השטח השוכן בנהר ומורפ השוכן במערה ומאפשר לנו לנתח כיצד שתי אוכלוסיות מאותו המין התפצלו עם הזמן. עם זאת, על מנת שמחקר זה יתקיים עלינו להיות מסוגלים להשיג עוברים בריאים תואמי זמן ו outcrosses היברידית.
בעוד מין זה מתוחזק בקלות וגדל במעבדה הדגים בעיקר להשריץ בשעות הלילה מה שהופך אותו מאתגר להשיג עוברים שהונחו טרי במהלך היום. בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד על ידי התאקלמות Astyanax mexicanus כדי לשנות מחזורי אור ושינויי טמפרטורה אנו מסוגלים להעביר מחזורי רבייה לשעה נוחה יותר של היום. לאחר מכן, אנו מראים כיצד לזהות דגים הורים מתאימים ולאסוף גיימרים זכרים ונקבות הרדמה.
לבסוף, אנו מדגימים כיצד לייצר צאצאים קיימא באמצעות הפריה חוץ גופית ולדון סימנים של הפריה מוצלחת. אנו מצפים שפרוטוקול זה יאפשר הליכים כגון הזרקת מבנים גנטיים וניתוח התפתחותי להתבצע בקלות בשעות העבודה הרגילות. בנוסף טכניקה זו יכולה להיות שימושית ליצירת outcrosses היברידית בין כל המערה ואוכלוסיות שוכנות פני השטח.
הגדר מיכלי דגים בתוך מערכת אטומה, סגורה לחלוטין זרימה דרך חקלאות ימית המכיל שורות מרובות של טנקים. שמור על הטמפרטורה של כל מיכל עם גוף חימום עצמאי המשמש לשינוי ידני של הטמפרטורה במהלך תהליך הפרימינג. הגדר שורות בודדות באופן שיאפשר פוטופריודים נפרדים בכל אחת מהן.
התקן דלתות בכל שורה שניתן לסגור כדי למנוע כניסת אור או בריחה ממנו. הבקר האוטומטי יכול לאפשר מניפולציה של כל photoperiods עם ההפרעה לפחות לדגים. לצייד את המדף עם אור עבודה אדום וילונות האפלה לגישה בשעות חשוכות.
הסר את הדגים הרצויים מתלי המערכת הכללית והצב במדפים רבייה כדי לאפשר התאמה של photoperiod 14 ימים לפני priming. זה מאפשר לדגים להסתגל לסביבה חדשה. שמור את הדגים ב 22.8 מעלות צלזיוס במהלך תקופה זו באמצעות מערכת חימום מימית מותקנת.
הפופריוד הרגיל הוא 6 .m בבוקר עד שמונה .m, ושמונה p.m.
לשש .m.כהה. עבור ארון תקשורת מחזור אור להעביר את photoperiod ל 10 p.m. כדי 12 p.m.
אור, ו 12 p.m. כדי 10 p.m. כהה על ידי התאמת טיימר שמפעיל את האור בתוך המדף.
ברגע שהדגים מסתגלים מתחילים להוליך את בעלי החיים להשריץ. זהו הליך שלוקח שישה ימים בסך הכל. במהלך תקופה זו לשנות את הטמפרטורה כדי להפוך את הייצור ova באמצעות מערכת חימום מימית מותקנת.
ביום הראשון להעלות את הטמפרטורה מ 22.8 מעלות צלזיוס ל 24.4 מעלות צלזיוס. ביום השני להעלות את הטמפרטורה מ 24.4 מעלות צלזיוס ל 26.1 מעלות צלזיוס. ביום השלישי וארבע לשמור על הטמפרטורה ב 26.1 מעלות צלזיוס.
דגים יהיו מוכנים להשריץ במהלך היום ו ניתן לבצע הפריה חוץ גופית. ביום החמישי להוריד את הטמפרטורה מ 26.1 מעלות צלזיוס ל 24.4 מעלות צלזיוס. ביום השישי להוריד את הטמפרטורה מ 24.4 מעלות צלזיוס ל 22.8 מעלות צלזיוס.
ספק פער של שבעה ימים לפני שתחזור על מחזור טמפרטורה זה. אנו ממליצים להמשיך לשמור את הדגים פוטופריוד זה מאז זה יקטין את הזמן הכולל הדרוש על ידי הדגים כדי להתאים את מחזור האור עבר. התחל על ידי החדרת רקמה לחה לנגב לתוך מכסה צלחת פטרי וסגירת המנה כדי ליצור תא לח ולמנוע את ביצית להתייבש במהלך תהליך האיסוף.
לאחר מכן בחר נקבה לאוסף. דג Gravid עם בטן בולטת גדולה צפוי להיות הבחירה הטובה ביותר עבור הליך זה. לשתק נקבה באמצעות מים צוננים ולמקם אותה בתמורת supine במחזיק חיית ספוג לחה.
לאחר ממוקם כתם בצד הגחוני של הדג עם לנגב רקמה עדינה כמו מגע עם מים יגרום ova לפעול. החזק את הנקבה בין האגודל לאצבע המורה. לחץ בעדינות על הצדדים הצדדיים של החלל הקואלומי לכיוון פתח urogenital תוך גלגול האצבע מעט.
לאסוף את ביצית לידי ביטוי באמצעות מרית חד פעמית. מעבירים את אלה לצלחת פטרי לחה. ניתן לשלב מספר מצמדים של ביציות באותה מנה אם אין צורך בנתונים ספציפיים של הורות.
לאחר איסוף בעדינות להחזיר את הדגים למיכל התאוששות מלא מי מערכת. בחר זכר לאוסף. אין סימנים גלויים כלפי חוץ של איכות gamete הגברי.
עם זאת, דגים צריכים להיראות בריאים במראה לפני השימוש בהליך זה. לשתק זכר באמצעות מים צוננים ולמקם אותו בתמורת עלוב במחזיק חיית ספוג לחה. כתם את הצד הגחוני של הדג עם מגבון רקמה עדין כמו מגע עם מים יפעיל את המילט.
מניחים בעדינות את הקצה של צינור נימי בפתיחה urogenital. לגרש milt על ידי הפעלת לחץ עדין על הצדדים של הדג עם האגודל והאגודל. התחל דיסטלי הזימים נע לכיוון הפתיחה urogenital.
לאסוף את המילט בסוף צינור נימי. יניקה עדינה עשויה להיות נחוצה על ידי שימוש בצינור שאפה. הימנע מכל צואה שעלולה להיות מגורשת עם המילט.
מחלקים את המילט לתוך צינור צנטריפוגה ריק 1.5 מיליליטר לדלל עם נפח כפול של מאריך זרע E400. שמור על קרח. מילט ממספר זכרים עשוי להיות מתאחד אם אין צורך בנתונים ספציפיים של הורות.
שלב זה יכול לשמש כדי להאריך את זמן העבודה של המילט במשך כמה שעות, אבל לא נדרש להפריה מיידית. לאחר איסוף בעדינות להחזיר את הדגים למיכל התאוששות מלא מי מערכת. באמצעות פיפטה חדשה עבור כל מניה לערבב את הזרע על ידי צינור ו / או להתסיס את הצדדים של הצינור לפני הפריה כמו זרע milt להתיישב E400 פתרון לאורך זמן.
לוותר על פתרון milt או מילט המורחבת לתוך ביצית שנאסף טרי. מוסיפים במהירות מיליליטר אחד של מי מערכת למצמד כדי להפעיל את הזרע והביצים להפריה. הימנע ערבוב או תסיסה של תוכן המנה ולאפשר שתי דקות להפריה להתרחש.
מוסיפים את מדיית העובר E2 כדי למלא את המנה 2/3 מלא. בהתאם להליך הבא עוברים ניתן להשתמש מיד עבור יישומים במורד הזרם או שהם יכולים להיות דגירה במדיה עובר E2 ב 23 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים חמישה ימים לאחר ההפריה. בשלב זה אנו מעבירים עוברים למערכת הדיור העיקרית המרסמת באמצעות מי מערכת.
החוזק העיקרי של שיטה זו הוא הייצור האמין של מערה היברידית פני השטח של Astyanax מקסיקניוס. שיטות קונבנציונליות של ייצור היברידי מאתגרות מאוד בשל אובדן השעון הביולוגי במערת מורפוטיפ של אסטיאנקס מקסיקניוס, מה שתויר זמני השרץ משתנים של דגים אלה. עבור הליך מוצלח IVF ב Astyanax מקסיקניוס איכות ביצית שנאסף הוא בעל חשיבות רבה.
דג נקבה Gravid עם בטן בולטת גדולה נוטים ביותר לשחרר ביצית קיימא, אשר מופיעים ברור ואפילו במראה. הוספת המילט שנאסף ova כזה תוצאות התפתחות של עוברים מופרים בדרך כלל בתוך 20 עד 30 דקות. עוברים בני קיימא יהפכו קצת יותר שקופים לפני הכניסה לשלב התא האחד של מחזור ההתפתחות.
ביצית לא מופרה תופיע יותר לא אחידה ואטמה. באמצעות הפריה חוץ גופית כדי ליצור כלאיים של דגי מערות טנז'ה ודגים פני השטח ניתן לבחון מגוון רחב של פנוטיפים מורפולוגיים. לדוגמה, כלאיים פני השטח / מערה יש עיניים המציין את נוכחות העיניים היא תכונה דומיננטית.
במערת פני השטח F2 היברידיות עם זאת, אנו מקבלים מגוון רחב של גדלי עיניים המציין כי ישנם לוקוסים מרובים לשלוט בגודל העין Astyanax mexicanus מה שהופך אותו תכונה כמותית. דוגמה נוספת היא פיגמנטציה. התבוננות היברידית F1 של פני השטח ואת cavefish, ניתן להסיק כי פיגמנטציה הגוף היא תכונה דומיננטית כמו הדגים הם פיגמנט מלא.
בדור ה-F2 השונות בפיגמנטציה של הגוף מצביעה שוב על תכונה כמותית. שילוב של נתונים פנוטיפיים אלה עם נתוני רצף יכול לחשוף loci גנטי הבסיסית אחראי על פנוטיפים אלה. בפרוטוקול זה למדנו כיצד להעביר את מחזורי הרבייה של Astyanax mexicanus לשעות נוחות יותר של היום, ולקבל עוברים בריאים קיימא באמצעות הפריה חוץ גופית.
בנוסף לאפשר עבודה עם עוברים בשלב מוקדם זה גם מאפשר חקירה עתידית של cryopreservation הזרע. סטנדרטיזציה של טכניקה זו מחזקת את אסטיאנאקס המקסיקנית כמערכת מודל למחקרים התפתחותיים וגנטיים מוקדמים.
