קו התא O9-1 הוא כלי שימושי מאוד לחקר תאי סמל עצבי במבחנה. יש לו פוטנציאל גדול לשימוש במגוון רחב של יישומים בשימוש במגוון רחב של מחקר. לתאי O9-1 יש יתרונות ברורים, כגון גישה קלה, והשגת מספרי תאים מספקים לניסויים במהירות, מה שהופך אותו לשיטה רבת עוצמה המשלים למחקרים במבחנה של תאי סמל עצבי.
כדי להתחיל, הכן מדיה בזלית עבור תרבות תא O9-1, על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לסנן את המדיה הבסיסית, ולעטוף אותו בנייר כסף כדי להגן עליו מפני האור. לאחר מכן, אסוף מדיה בזלית מותנה מתאים STO פעילים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
ראשית, להפשיר aliquot של מטריצת קרום מרתף על קרח במשך שעתיים. לאחר מכן, לדלל את מטריצת קרום המרתף עם DMEM מעוקר מסונן עם 10%FBS לריכוז סופי של 0.5mg/ml. מצפים את הצלחת עם מטריצת קרום המרתף בטמפרטורת החדר במשך שעה.
לאחר מכן, שאף את מטריצת קרום המרתף תוך הטיית הצלחת. יבש את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בעת הוספת מטריצת קרום המרתף לצלחת, ודא שהפתרון כיסה את הבאר באופן שווה כדי לשמור על מאפייני התא ולהימנע משינויים מיותרים בין הניסויים.
לשחזר O9-1 תאים על ידי הצבת cryo-בקבוקון לתוך 37 מעלות צלזיוס מים אמבטיה. לאט מערבלים את הבקבוקון עד שהתסכול הופך לחלוטין לנוזל. לאחר מכן, להעביר את פתרון התא מן cryo-בקבוקון לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
הוסף חמישה אמצעי אחסון של DMEM עם 10%FBS לצינור כדי להשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה התאים במשך שלוש דקות ב 180 Gs.Then, שאף את העל טבעי, דואג לא להפריע גלולה. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה במדיה הבסיסית מותנה בתוספת LIF ו BFGF.
זרע את התאים בצלחת שש באר, ולהסעיר את הצלחת כדי לזרוע את התאים באופן שווה. כאשר מתסיסים את הצלחת, לעשות זאת אופקית ואנכית, כמו מערבולת הצלחת יגרום לתאים להתרכז לכיוון המרכז. ולאפשר לתאים האלה לצרף ולגדול באינקובטור סטנדרטי לתרבות התאים בן לילה.
ודא שהתאים מחוברים לפני שינוי המדיה. כאשר תאי O9-1 מגיעים ל-80%, הפשיר את מטריצת קרום המרתף והכן צלחת מצופה מטריצת קרום מרתף כמתואר קודם לכן. לאחר מכן הוסיפו מדיה בסיסית בתוספת LIF ו- BFGF למטריצת הממברנה.
יש לשטוף בעדינות את בארות עם 2 מ"ל של DPBS פעמיים. לאחר מכן, נתק את התאים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לנטרל את טריפסין עם כמות שווה של DMEM עם 10%FBS על ידי צינורות שוב ושוב את הנוזל על פני כל פני השטח של באר.
לאחר מכן, להעביר את פתרון התא לצינור צנטריפוגה. וצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 180 Gs.Aspirate העל טבעי מבלי להפריע גלולה של תאים. לאחר מכן, לחץ מחדש על גלולת התא על-ידי פיפטציה עדינה של מדיה בזלית מותנה בתוספת LIF ו- BFGF.
זרעים את התאים לצלחת מצופה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, לאפשר לתאים לצרף ולגדול באינקובטור תרבות תאים סטנדרטית. ראשית, הכן את המדיה המקפיאה פי 2 בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, סנן את המדיה. לשטוף את הקירות של הצלחת עם DPBS פעמיים, צינורות בעדינות, כדי למנוע אובדן תאים. לאחר מכן נתק את התאים עם 0.05% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.
נטרל את טריפסין עם כמות שווה של 10%FBS ו- DMEM. מעבירים את תכולת הצלחת לצינור צנטריפוגה, וצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 180 Gs.Then, שאפו את העל-טבעי והוסיפו 2 מ"ל של PBS כדי למצות מחדש את גלולה. צנטריפוגה פתרון התא שוב ושואפים את העל טבעי.
התאם את כמות המדיה הבסיסית בצינור לפי הצורך והוסף כמות שווה של מדיה להקפאה של פי 2. לאחר מכן, העבר את התאים לבקבוקוני ההקפאה המסומנות. מניחים את בקבוקוני ההקפאה בתוך קופסת פוליסטירן עם מכסה כדי להשיג קצב קירור איטי של 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.
כדי לבצע נפילה SIRNA בתאי O9-1, לשחזר ולזרע את התאים. לדלל ליפוזומים בנפח מתאים של מדיה ללא סרום. לאחר מכן, לדלל את SIRNA במדיה ללא סרום על פי פרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, מוסיפים את SIRNA מדולל ליפוזומים מדולל, על פי הוראות היצרן. מערבבים את הפתרון על ידי צינורות, ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של תסביך השומנים SIRNA לתאים.
לאחר מכן, להחרים את התאים במשך 24 שעות באינקובטור תרבות תאים סטנדרטי. תאי O9-1 יכולים להתבדל לסוגי תאים שונים בתנאי תרבות הבחנה ספציפיים. כדי להבדיל בין תאים O9-1 לתאים osteoplasts, להכין מדיה בידול אוסטאוגני על פי פרוטוקול הטקסט.
לבסוף, לזהות את סמן osteoplast אוסטאוקלצין osteoplasts מובחן על ידי כתמים חיסוניים. כדי להבדיל בין תאי O9-1 לתאי שריר חלקים, תרבו אותם תחת מדיית הבחנה על פי פרוטוקול הטקסט, והעריכו את ההבחנה על ידי הכתמת אימונו של אקטין שריר חלק. בפרוטוקול זה, הן לדפוק ולהפיל ניסוי כדי לחקור את אובדן תפקוד Yap בתאי O9-1 בוצעו.
תחת תנאי התדלדלות חלקה של תאי השריר, רוב תאי O9-1 מסוג הבר הוליד שריר חלק actin תאי שריר חלקים חיוביים. תאים ריקים Yap עם זאת בדרך כלל לא הצליחו להבדיל לתוך תאי שריר חלקים חיוביים SMA. זה מצביע על כך יאפ ממלא תפקיד קריטי בידול של תאי סמל עצבי לתוך תאי שריר חלקים.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בקו התא O9-1 בעדינות ובזהירות במהלך התהליך כולו. הקפד לדלל ולהשתמש כראוי במטריצת הממברנה הבסיסית, ולהשתמש ב- 0.05%trypsin לניתוב תאים. אל תשכח כי במהלך ההכנה לתרבות התא O9-1, עבודה עם mitomycin c יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה וכפפות תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
