긴장에 감사 꼬마 유전학 센터 (건강의 국가 학회 (NIH) 사무실의 연구 인프라 프로그램 P40 OD010440에 의해 자금) 하 고. 저자 뱁 티 스 트 Roelens 및 Eli Lessman, 건설적인 의견 및 마 노 연구소 CCNY, 촬영의 일부에 대 한 그리고 그들의 도움에 대 한 그들의 실험실의 사용을 위한 CUNY에서 제공 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 PSC CUNY 수상 TRADB-46-113에 의해 지원 되 고 NIH 부여 1SC2GM118275-01. 석사 박사 건강 (CIHR) 친교의 캐나다 학회에 의해 부분적으로 지원 되었다 그리고 E.K. NIH/NIGMS 상승에 의해 지원 되었다 GM062981를 부여.

1. 설정 rec-8 RNAi ( 그림 2의 일 1-3)
이 프로토콜은 Kamath 및 Ahringer30에서 수정 됩니다.
<ol><li>대장균에 rec-8 dsRNA 식의 유도, 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 천 격판덮개31 1mm 이소프로필-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG)와 100 µ g/mL의 최종 농도와 보완을 준비합니다 암 피 실린입니다. 사용, 최대 4 주까지 4 ° C에서 어둠 속에 저장 합니다.</li>
	<li>100 µ g/mL 암 피 실린과 50 µ g/mL 항생물질 보충 Luria 국물 (파운드) 접시에 Ahringer 연구소 도서관30 rec-8 클론에서 rec-8 (W02A2.6) 복제를 들고 행진 HT115 박테리아. 37 ° c.에 통에 하룻밤 성장</li>
	<li>주 1 4 mL 파운드 포함 100 µ g/mL 암 피 실린 및 50 µ g/mL 항생물질으로 rec-8 RNAi 클론을 들고 HT115 대장균 박테리아의 갓 질주 된 단일 식민지에서 단일 식민지 접종. 성장 통 또는 37 ° c.에 롤러 드럼에 하룻밤 박테리아 문화</li>
	<li>다음날 아침 (주 2), 두 배 배가 좌초 하는 (ds) RNA 1mm IPTG의 최종 농도 추가 하 고 37 ° c.에 40 분 동안 흔들어 여 HT115 세균성 문화에 rec-8 W02A2.6의 생산을 유도</li>
	<li>유도 후 NGM/IPTG 접시 HT115 rec-8 박테리아의 100-200 µ L 씨 하 고 어두운 하룻밤 (3 일)에 실 온에서 접시를 저장.</li>
	<li>다음날 아침 (4 일), 단계 2.1 아래에 설명 된 대로 유도 HT115 rec-8 박테리아 접시에 원하는 선 충 스트레인을 추가 합니다.</li>
</ol>2. 생성 하 고 Tetraploids ( 그림 2에서 4-16 주) 분리
<ol><li>하루 4, L4 (4 애벌레) 단계 광고에 나온 것 NMG/IPTG 접시에 원하는 2 중 긴장의 하루 전에 유발 했다 HT115 rec-8 박테리아와 시드 3-4 영 장소 (위에 1.5, 단계). 어둠 속에서 15 ° C에서 선 충을 성장.</li>
	<li>3 일 전에 해당 단계에서 첫 번째 자손 (F1s) L4s 될 것입니다 1.3과 1.4 단계 2.1, 후에 3 일을 시작 단계 반복 합니다. 이 단계의 타이밍 15 ° c.에 얼마나 빨리 선 충 스트레인 성장에 따라 달라 집니다. 일부 2 중 돌연변이 체 긴장은 느린 재배 자, 그리고이 타이밍 잘 필요 tetraploids을 분리 하려면.</li>
	<li>( Rec-8 RNAi 먹이 치료의 4 일) 후 8 일, 20 (2 광고에 나온 것/페 트리 접시)는 F1 (첫 번째 자식 세대) L4 광고에 나온 것 갓 유도 HT115 rec-8 RNAi에 HT115 rec-8 박테리아에서의 전송 및 허용 그들 self-fertilize입니다.<ol>
<li>또는,에 HT115 rec-8 박테리아에서 갓 재배는 F1 L4 광고에 나온 것의 전송 20 HT115 rec-8 RNAi 박테리아 같은 스트레인 (2 광고에 나온 것 4-6 남성/플레이트)의 치료 남성 함께 유도.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하루 13, 시작 나타나는 긴 자손 F2 (2 자식 세대)에 대 한 심사 (Lon)에 전체 보다 크거나 야생 유형; 다음 대장균 박테리아의 일반적인 OP50 또는 HB101 변종에 개별 론 동물 전송. 계속 심사 F3 (3 자식) 자손; 그러나, 동일한 접시에서 F3 자손 이라고 할 수 없다 독립 긴장 그들이 설립 될 경우, 그들은 수 있기 때문에 같은 형제 이미 F2 어머니를 설립. 참고: 그들은 명확 하 게 diploids 이상 때문에 상 상속 tetraploids 식별 쉽게 됩니다. 야생 타입 광고에 나온 것은 tetraploids 보다 짧은 3 분의 2. 그것은 더 이상, 때문에 tetraploid 몸 만드는 여분의 차례 꼬리 (그림 3A) 머리에서 정현파 몸 절곡 파도 생성 하 여 앞으로 이동.</li>
	<li>Self-fertilize 하 론 자손만 rec-8 RNAi 치료의 부재에 낼지는 론 자손을 선택 하 여 전파 론 웜 수 있습니다. 이 2 ~ 3 추가 세대를 걸릴 수 있습니다. 론 벌레는 자주 살 균 하 고 자손을 생성 하지 않습니다.</li>
</ol>3. 확인 Tetraploid 긴장 (영화 1와 그림 3A, B)
참고: Tetraploid 긴장 그들의 unfertilized oocytes에서 염색체의 수를 계산 하 여 유효성 수 있습니다. 형광 현미경 검사 법을 사용할 수 있는 경우 변형 염색체에 대 한 형광 성 감 적 (meiotic 사단), 이전 unfertilized 2 중 oocytes에서 염색체 쌍의 수에 대 한 화면. 염색체 형광 표식 부재, tetraploid nematodes 선 충 및 DNA 염료;와 얼룩에 의해 상영 수 있습니다. 에탄올 및 전체 동물 4 '에 대 한 프로토콜에 대 한 아래 참조 6-Diamidine-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) 얼룩.
<ol><li>전체 동물 DAPI 얼룩 참고: 12 연결 된 염색체 쌍을 들고 Tetraploid 긴장 DAPI 이러한 동물을 얼룩이 지 고는 unfertilized oocytes에 DAPI 시체의 수를 계산 하 여 유효성 수 있습니다.<ol>
<li>현미경 슬라이드에 M9 버퍼31 10 µ L 장소 5 다음 드롭 6-10 선 충을 전송.</li>
		<li>해 현미경 보풀 청소 조직으로 선 충을 제거 하지 않고 사용에서 M9의 대부분을 그립니다. 그런 다음, 즉시 벌레에 90% 에탄올의 10 µ L 드롭 추가. 몇 초 보다는 더 이상 벌레 완전 하 게, 하지만 대 한 건조를 허용 합니다.</li>
		<li>최대한 빨리 에탄올 증발 (이 볼 수 있습니다 해 현미경 발생), 90% 에탄올 벌레에의 한 추가 10 µ L을 추가.</li>
		<li>3.1.3 단계 세 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>일단 마지막 한 방울까지 에탄올의 증발 했다, 선택 (예를 들어 m 9에 2 ng / µ L DAPI 재고 농도의 1:1,000 희석)의 설치 미디어에서 권장된 하는 최종 농도에 DAPI 또는 Hoechst 염료의 6 µ L를 추가 합니다. 슬라이드의 장기 저장을 위한 0.5 %p-phenylenediamine M9, 대신 20 mm Tris HCl, pH 8.8, antifade 솔루션으로 90% 글리세롤에 녹을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>coverslip로 슬라이드에 벌레를 커버 하 고 매니큐어와 coverslip의 가장자리를 밀봉. 형광 현미경 (단계 3.1.7) 점수는 coverslip 추가한 후 적어도 10 분. Antifade 없이 슬라이드 전에 득점, 4 ° C에서 몇 일 동안 저장 될 수 있다 하지만 형광의 품질 몇 일 후 감소 하기 시작 합니다.</li>
		<li>바로 옆에 spermatheca 이며는 spermatheca 아직 입력 하지 않은 가장 성숙한 unfertilized oocyte에서 단일 DAPI 시체 (아마도 단일 염색체 쌍)의 수를 점수 100 배 확대에 형광 현미경을 사용 하 여 또는 자 궁입니다.<ol>
<li>점수는 oocyte의 핵 내에서 개별 DAPI 시체, 현미경의 정밀한 초점을 사용 하 여 천천히 oocyte 핵의 위쪽에서 아래쪽으로 계산 하는 동안. 그런 다음, DAPI 시체의 계산된 수를 확인 하는 반대 방향으로 (즉, 핵의 맨 아래에서)에 포커스를 이동 하는 동안 동일한 핵 재검표.</li>
		</ol>
</li>
		<li>가장 성숙한 unfertilized oocyte 안정적 Lon 스트레인 당 적어도 10 광고에 나온 것에 2 개의 생식 기의 각 점수. 야생 타입 oocytes 6 DAPI 시체 평균, 5 autosome 쌍과 성 염색체 쌍에 있다. 안정적인 론 종자는 oocyte에서 12 DAPI 시체의 존재 나타냅니다이 긴장에 동물 부분 (4 세트 Autosomes, 3 X-chromosomes의) 또는 (4 세트 Autosomes, 4 X-chromosomes) tetraploids.</li>
		<li>DAPI 시체 스트레인 당 여러 개의 (10) oocytes에서 관찰의 평균 수를 계산 합니다. 일부 염색체 쌍을 감동 것입니다 또는 오른쪽에 하나의 또 다른, 그래서 DAPI 수는 oocyte에서 시체의 상단은 종종 염색체 쌍의 실제 번호 보다 작습니다.</li>
		<li>(선택 사항) 더 안정적인 론 긴장 DAPI 시체의 평균 수는 전체 (4A, 4 X) 인지 부분 (4A, 3 X) 여부를 테스트 하려면 12 확인 tetraploids 면역 형광 검사 HTP-332같은 염색체 축 단백질에 대 한 얼룩에 의해. 이 얼룩 부분 tetraploid에 단일 연결 되지 않은 염색체에서 십자형 패턴을 보여주는 염색체 쌍 구분 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

단일 (n) gametes의 생산에서 수정 (2n) 2 중 접합 자 생성에 열쇠 이다. 게놈의이 감소는 단일 게놈 복제 후 2 연속 셀 구역으로 감수 분열 동안 수행 됩니다. 단일 생성 하 gametes, C. 선 충, 대부분 다른 metazoans와 마찬가지로 분리 1 부에 임산부 및 paternally-파생 homologs 반면 각 체에서 chromatids 2 부에 분리 하는 여동생. 그 전체 게놈 polyploidy 자연에서 발생 하는 방법 하나는 감수 분열 동안에 그들의 절반 크기의 게놈을 실패 하는 gametes의 세대를 통해입니다.
그것은 잘 알려져 있다 50 년 이상 그 tetraploid C. 선 충 선 충은 실용적이 고 비옥한. Nigon23, 그리고 이후 Madl와 허먼22, 생성 meiotic 염색체 분리를 방해 하 여 선 충 C. tetraploids의 소수를 식별 열 충격 처리를 사용 하 고 각각 유전자 표시를 사용 하 여. 단일 추가 C. briggsae tetraploid 스트레인 30 년 이상이 프로토콜을 사용 하 여 파생 된 이후24. 이러한 tetraploids 어떻게 C. 선 충 결정 될 남성 또는 자웅 동체, ploidy 성장 및 크기를 조절 하는 방법 하 고 페어링 및 감수 분열25,26, 에서 synapsis 분석 조사를 이용 하였다 38 , 39 , 40. 아직 이들과 특정 tetraploids 또는 triploid 종자의 사용을 필요로 하는 다른 연구가 메서드에서 tetraploid 종자 생성에 어려움에 의해 제한 되었다.
여기에 설명 된 프로토콜 통해 안정적인 전체 4A, 4 X 세대 및 부분 4A, 3 X tetraploid 꼬마 선 충 종자에서 2 중 유전 배경 초기 또는 karyotype 유전자 표시의 사용 없이.
Tetraploidy C. 선 충에 메커니즘 중 하나 이상에 의해 발생할 수 있습니다.
Madl와 허먼은 생성 가능성이 tetraploid 긴장 triploid 중간 상태에서 파생 된 제안 했다. 그들의 긴장은 여러 세대에 걸쳐 또는 상 상속 triploid 2 중 남성22중간을 횡단 하 여 선택을 통해 얻은 했다. Rec-8 돌연변이에 준다 오 2 중 oocytes와 정자를 분할 하는 염색체에 결함 tetraploid 동물 rec-8 RNAi 체계27발생할 수 있는 다른 가능한 메커니즘을 제안 합니다.
rec-8 RNAi 대우 광고에 나온 것은 2 중 oocytes 및 수정 시 tetraploid 동물을 야기할 것 이라고 spermatocytes 생산할 수 있습니다. 이 가능성과 일치 하는 복제 f 2 광고에 나온 것 중 일부 상승 했다 안정적인 론 계통에 제안 그 다음 세대에는 복제 론 F2 광고에 나온 것 하는 사실 이다 이미 tetraploid 어디. 횡단 계획에서 rec-8 RNAi 대우 광고에 나온 것의 1 세대 치료 남성으로 건 넜 다. 2 중 spermatocytes 수 여전히 남성 십자가 rec-8 dsRNA를 표현 하는 박테리아의 존재 하 고 따라서, 남성에 노출 되는 rec-8 RNAi 적어도 3 일 동안 짝짓기 하는 동안 때문에 발생 합니다. 따라서, cross-fertilizing 체계에 론 polyploids 수 또한 2 중 oocytes의 수정에서이 2 중 정자 형성 했습니다. 안정적인 tetraploid 긴장 사이 2 중 gametes 중 수정 또는 변수 ploidy의 oocytes를 포함 하는 단일 정자를 생산 하는 2 중 동물과 triploid 동물 크로 싱에서 발생할 수 있습니다.
중요 한 고려 사항:
자기-십자가 구조 대:
자체 기름 rec-8 RNAi의 계획 f 1 광고에 나온 것을 취급 하 고 치료 남성과 두 광고에 나온 치료 것의 교차점을 포함 하는 계획이 4A, 4 배 상승 했다 및 4A, 3 X tetraploid 긴장. 더 많은 polyploids 처음 자체 기름 체계에서 고립 되었다, 비록 더 이다 동물의 살 균 되었고 따라서 두 구성표는 마찬가지로 tetraploid 안정적인 종자 생산에 효율적. 증가 성공 자체 기름 체계에 불 임에 대 한 이유를 알 수 없는 남아 있습니다. 두 구성표는 마찬가지로 효율적인, 자체 기름 체계가 쉽습니다 짝짓기에 대 한 남성의 격리를 필요로 하지 않습니다. 또한, 관심의 변형 비효율적 이거나 짝짓기에 결함이 있는 경우 자체 기름 체계는 것이 좋습니다 것입니다. Cross-fertilizing 체계는 단일 염색체의 두 개 이상의 버전을 포함 하는 복잡 한 tetraploids를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
수정 및 제한:
현재,이 프로토콜 rec-8 유전자에 대 한 dsRNA를 표현 하는 박테리아를 먹이로 rec-8 RNAi 치료를 포함 한다. 따라서, 먹이, 또는 조직41,,4243사이 RNAi의 환경 또는 조직 확산에 결함이 있는 돌연변이이 프로토콜 꼬마 종 RNAi 응답에서 작동 하지 않습니다. 이 문제는 생식에 직접 관심의 dsRNA의 직접 주입 RNAi 치료를 도입 하 여 잠재적으로 해결 될 수 있습니다.
이 제도 안정적인 triploid 종자44,45를 생성 하지 않습니다 때문에 그것은 파생 된, 2 중 동물에 게는 tetraploid로 triploid 동물을 생성 되어야 합니다. 계란의 15%만 물려받은 triploids 해치에 의해 그리고 그들의 자손은 주로 메 마른 자손 이수성 때문. 또한, 몇 살아남은 비옥한 자손 세대 이내 완료 또는 diploids 근처 하 경향이 있다. 이것은 아마, 적어도 부분, oocytes는 부분적으로 첫 번째 meiotic 부문에 북극 몸으로 세 번째 염색체를 분리 하 여 trisomy를 수정 하기 때문에.
이 프로토콜의 insuperable 한계는 그것 때문에 그들은 RNAi 치료46에 저항력이 RNAi 기계의 구성 요소에 영향을 주는 돌연변이의 tetraploids을 만들기 위한 작동 하지 않습니다 이다.
문제 해결:
rec-8 RNAi.
몇 가지 고려 사항은 성공 하려면이 프로토콜에 대 한 중요 한입니다. 첫 번째 rec-8 dsRNA 생산 rec-8 (W02A2.6) 복제를 들고 박테리아 HT115 박테리아에서의 유도 대 한 신선한 IPTG와 갓 만든된 IPTG NMG 플레이트를 사용 하는. IPTG는 빛에 민감한 고 번호판에 빛 노출을 줄이기 위해 하는 것이 중요 하다. IPTG 접시 어둠 속에서 4 ° C에서 한 달에 저장할 수 있습니다. 둘째, rec-8 (W02A2.6) RNAi 세균 HT115 변종 (Kamath 및 Ahringer 2003) Ahringer 라이브러리에서 다른 사용 가능한 rec-8 보다 더 강한 rec-8 형 HT115 클론을 얻지 못했다.
Tetraploid 스트레인 유지 보수:
Tetraploid 긴장 매우 느리게 성장 하 고 세대47당 최대 50 progenies 생산. 모든 확인 된 tetraploid 긴장은 상대적으로 안정적인, 하지만 그들은 무 너 뜨 리 수 있는 2 중 때 스트레스 (조나단 Hodgkin 개인 통신 및 우리의 되지 않은 관찰) 되 고. 따라서, 그것은 tetraploid 긴장 굶 어, 열 충격, 25 ° C에서 재배 하거나 냉동 고 녹여, 그들은 신속 하 게 되돌릴 수 diploidy, 그래서 계속 이러한 긴장을 녹이는 때 론 동물을 선택 하는 것이 중요 하다 또는 때 주의 하는 것이 중요 복귀 하도록 발생할 수 있습니다 스트레스 조건 이러한 긴장을 노출 합니다.
가능한 응용 프로그램:
효과의 조사 또는 전체 게놈 진화, 세포 주기, 유전자 발현 및 다세포 유기 체에서 개발 polyploidization의 역할 사이의 비교에 의존 하고있다: 다른 ploidy, 같은 셀을 포함 하는 유기 체에서 세포 형식에 밀접 하 게 관련 다른 ploidy와 종 또는 받은 진화론 최근 polyploidization 이벤트와 물리적으로 격리3,,56,7,8 종 ,11,18,19,20,,4849,50. Tetraploids 제 브라와 마우스 모델 시스템에서 파생 될 수 있다, 그들의 자손은 멸 균 또는 embryonically 치명적인16,17. 또한, 이러한 모델 시스템 C. 선 충 에 비해 긴 수명 주기 있고 사용할 수 있는 방법 이다 동물을 생성 하는 복잡 하 고 비효율적인. 따라서, C. 선 충 종자가 메서드에서 파생 효과 및 전체 게놈 다세포 생물에서 polyploidy의 역할에 어떤 조사를 발전에 대 한 수단이 될 것입니다.
Diploids, triploids, 및 게놈의 사본의 수만 다른 tetraploids 비교 독특하고 전례 없는 기회를를 제공 합니다 이후는 triploid 원래 2 중에 tetraploid 건너는 tetraploid에서 파생 될 수 있다, 다른 게놈 크기 (또는 유전자 복용량) 해당 동물/장기/셀을 평가 합니다. 유연성과 쉽게 여기에 설명 된 계획의 다른 유전자 2 중 배경 또는 karyotypes 수십 tetraploid 종자의 생성을 허용 했다. 이러한 긴장의 일부 이미 쿼리 메커니즘 synapsis 동종 염색체 쌍의 감수 분열27동안 사용 되었다.
형광 마커를 들고 야생 유형 및 돌연변이 tetraploid 긴장의 스케일링, 전체 게놈 세포내/휴대/기관 및 전체 동물에 게놈 크기와 핵/cytosol 비율 간의 관계를 이해 하는 새로운도 제공할 것입니다. 적응, 종 분화, 유전자 복용량 및 표현과 조직 및 장기 개발에 polyploidization. 생물 학적 스케일링의 연구 뿐만 아니라 tetraploid 긴장의 세대 것 이다 크게 더 근본적인 생물학 질문 extracellular 신호, 게놈 불안정성, endoreduplication, 전체 게놈 관련 쿼리 복제, 유전자 노출량, 스트레스, 약물, 그리고 종 형성 메커니즘을 개발에 적응.

전체 게놈 polyploidy 자연에 걸쳐 존재 하 고는 종종 적응, 종 형성, organogenesis, 상처 치유, 및 생물 학적 스케일링;에서 필요한 단계 그것은 또한 암 및 저항 마약1,2,3,,45,6,7,8, 에 알려져 9 , 10 , 11 , 12. 농업 및 어업 산업 생성 이다 식물, 생선, 그리고 조개 화학 치료 (예를 들어, 콜 히 친 고 orzalin) 빠른 성장 속도 및 bulkier 작물과 가축13, , 14,15. Tetraploids의 실험 및 비효율적인 생산 마우스와 zebrafish 모델 시스템16,17에 대 한 존재합니다. 그러나, 대부분의 또는 모든 이다 다세포 동물 생성 embryonically 치명적인 또는 살 균 및 따라서 다세포 생물에서 polyploidy의 효과 대 한 실험실 연구에 대 한 좋지 않은 있습니다. 따라서, 다세포 생물에 전체 게놈 polyploidization의 어떤 이해 제한 되었습니다 밀접 하 게 관련 종 진화 최근 polyploidization 이벤트18,19,20 . 생물학 역할의 쿼리 또는 polyploidization의 결과를 경로 C. 선 충 모델 시스템의 사용 이다. 중요 한 것은, C. 선 충 은 일반적으로 존재 하는 2 중으로, 5 autosomes (A) 그리고 게놈 당 1 개의 성 염색체 (X)를 포함, vivo에서 생물 학적 과정의 관찰에 대 한 투명 한 수 세공 유전자 시스템 및 (성적으로 성숙한 성인에 게 계란)에서 3-4 일의 짧은 라이프 사이클 있다. C. 선 충 전체 게놈 자연에서 polyploidy의 가장 일반적인 유형인 tetraploid로 재현할 수 표시 되었습니다. Triploid 동물 diploids와 함께 tetraploids로 생성 될 수 있습니다 하지만 그들의 ploidy 안정적 이며 긴장 될 몇 세대 내 2 중.
지난 몇 십년에 한 줌의 실용적이 고 비옥한 C. 선 충 tetraploids 긴장 고립 되었다 실험실에서 힘 드는 이며 제한 된 유형의 긴장21,22, 를 생성 하는 전략을 사용 하 여 23.이 전략 C. 선 충 tetraploids 여 생성 열 충격 처리는 아마도 유전자 표시를 사용 하 여 상 상속 이다 동물에 대 한 심사 뒤 gametes에서 염색체 분리에 영향을 줍니다. 이 tetraploids이 선 충이 류 남성 또는 자웅 동체 될 것인지를 결정 하는 방법의 문의에 매우 유용 했다. 나중 연구 조사, 유전자 복용량, 성장과이 선 충21,,2425,26감수 분열 동안 synapsis의 규정을 사용할 수 있는 긴장을 사용. 불행 하 게도, 이러한 연구는 새로운 tetraploid 긴장과 배경 유전자 표시 포함 된 이러한 변종 생성 어려움에 의해 제한 되었다. 여기에 표시 된 감수 분열27동안 synapsis의 규칙을 공부 하는 긴장을 생성 하는 데 사용 되었습니다는 안정적인 tetraploids, 생성 하 간단 하 고 빠른 프로토콜이입니다.
자연에서 polyploidization 단일 gametes 대신 2 중의 형성에 의해 발생할 수 있습니다. 감수 분열-특정 cohesin 구성 요소 돌연변이 rec-8 2 중 정자 생성 및 oocytes 표시 rec-8 유전자를 노크 하는 우리의 찾는 tetraploid 자손 (그림 1)27의 생산 귀 착될 것입니다. , 2829. 노크 rec-8 phenocopy rec-8 순서로 2 세대에 대 한 RNA 간섭 (RNAi)에 의해 2 중 gametes 돌연변이 포함 됩니다 단순히 tetraploid 긴장을 생성. 상 상속 polyploids 그들의 이상으로 쉽게 식별할 수 있습니다 정상적인 신체 크기 보다. Polyploids는 일단 안정적인 라인 설립 핵 당 염색체의 수를 계산 하 여 전체 또는 일부 tetraploids로 확인 됩니다.
여기에 설명 된 전략 초기 2 중 유전 배경 또는 karyotype 유전자 표시의 사용 없이 안정적인 tetraploid 꼬마 선 충 종자의 생성 수 있습니다. 이 프로토콜 더 다재 다능 한, 효율적이 고 이전에 사용 하는 제도 보다 간단한 이기 때문에, 그것은 개발, 게놈 안정성 및 다세포에 진화의 기본적인 과정에 polyploidization의 역할을 쿼리 하는 데 필요한 도구를 확장 됩니다. 유기 체입니다. 이 프로토콜의 사용에만 예측 가능한 한계 유전 배경 RNAi를 저항에 이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Motic Microscopy</td>
			<td>SMZ171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>T3305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>T3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Agar, 5 kg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89140-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone, BD Bacto</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Trihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG, dioxane-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Lennox Broth</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>89126-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Lennox</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>89126-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Trihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP912-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP</td>
			<td>Koptec, VWR</td>
			<td>89125-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate, monobasic dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC271750025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Clones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>W02A2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>RCE1182-202299820</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of ploidy in caenorhabditis elegans

개발 및 진화; 전체 게놈 polyploidy 놀이 중요 한 역할을 포함 하는 메커니즘 또한, tetraploid 세포의 비정상적인 생성은 암 진행 및 약물 저항의 개발 관련 된 되었습니다. 지금까지, 그것은 쉽게 주로 살 균 자손을 생성 하지 않고 다세포 동물의 ploidy 조작 가능 하지 않았습니다. 여기는 tetraploid 꼬마 선 충 을 생성 하기 위한 간단 하 고 빠른 프로토콜 제시 어떤 2 중 긴장에서 동물. 이 메서드를 사용 하면 궁극적으로 증가 ploidy C. 선 충에서 감수 분열 동안 염색체 분리에는 바이어스를 만들 수 있습니다. 이 전략의 rec-8 진 2 중 gametes를 생성 하는 식의 일시적 감소에 의존 합니다. Rec-8 돌연변이 잠재적으로 수정 시 tetraploids를 생산할 수 있는 2 중 gametes를 생성 합니다. 이러한 세공 구조는 돌연변이 염색체 재배열 페어링 및 synapsis 감수 분열에서 염색체 역학과 상호 작용에 대 한 통찰력을 얻기 위해 들고 tetraploid 긴장을 생성 하 사용 되었습니다. 이 방법은 유전자 표시 없이 안정적인 tetraploid 긴장을 생성 하기 위한 효율적인, 어떤 2 중 긴장에 적용 될 수 이며 triploid C. 선 충을 파생 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 간단한 메서드는 다른 근본적인 생물학 질문 게놈 불안정성, 유전자 노출량, 생물학 확장, extracellular 신호, 적응 스트레스, 약물, 저항의 개발 관련 조사 및 종 형성의 메커니즘입니다.

Rec-8 2 중 Gametes에 Meiotic Cohesin 구성 요소 함수 결과의 장애:
Cohesin 구성 요소 돌연변이 rec-8 의 meiotic 부분의 이미징 정자와 oocytes tetraploid 동물 (그림 1)27,,2933생성 가능한 메커니즘 밝혀. Mechanistically, rec-8 돌연변이 정자와 oocyte의 meiotic 부문 결함 다르다; 그러나, 둘 다 남성과 여성 2 중 gametes는 rec-8 돌연변이 의해 생산 됩니다.
야생 타입 감수 분열에서 상 동 염색체 일시적으로 크로스 오버 재결합에 의해 서로 연결 되 고 단위 또는 (그림 1A)가 첫 번째 meiotic 부문 입력34. 첫 번째 부분 동안 동종 염색체 (homologs) 분리, 서로 떨어진 반면 자매 각 체에 chromatids 2 부까지 함께 남아 있다. 비록 염색체 분리의 패턴은 여성 및 남성 gametes에 동일, oocyte 부서는 반면 spermatocyte 분할 대칭 이며 전문된 cytokinesis 받아야 비대칭. 각 부문에는 oocyte 작은 북극 몸으로 부문 제품의 절반을 삭제합니다. 따라서, 각 oocyte 전조는 단일 단일 oocyte와 두 극 시체 (그림 1B, C)35에 상승을 제공합니다. 반대로, 단일 spermatocyte 전조 2 개의 대칭 사단을 겪고 하 여 4 개의 기능 spermatids에 상승을 제공 합니다. 2 부는 잔여 시체에서 떨어져 싹 트는 4 개의 spermatids와 절정. 이 cytokinesis가입니다 특별 한 패턴 및 spermatids의 수 centrosomes36에 의해 결정 됩니다.
Rec-8 돌연변이 gametes에 전조에서 상 동 염색체 사이 크로스 오버 재결합 일어나지 않는다 하 고 homologs로가 첫 번째 meiotic 부문29,34의 시작 부분에 연결 되지 않은. 야생 타입 gametes에서와 마찬가지로 각 체의 자매 chromatids 1 부 2 부까지 함께 남아 대신에 서로에서 분리. 흥미롭게도, 2 부 중 rec-8 돌연변이 표현 형은 다른 남성과 여성 gametes에 oocytes 반면 spermatocytes 받아야 비교적 정상적인 cytokinesis (그림 1B- 는 cytokinesis을 실패 F) 27 , 28 , 29. 2 중 oocytes 두 번째 부문에서 그들은 염색체 분리 및 cytokinesis 실패 하기 때문에, 따라서 그들은 두 번째 극 시체 (그림 1B, C)을 돌출 하지 않습니다. Rec-8 germlines에 있는 spermatocytes spermatid 신진 또는 cytokinesis, 받을 하지만 종종 spermatids 2 중 spermatid 및 spermatid chromatin 부족에 한 염색체의 두 세트를 분리 (그림 1D- F)27. Rec-8 정자 부족 chromatin의 비율의 정량화는 그림 1 층에 표시 됩니다.
Rec-8 돌연변이에 여성 및 남성 2 중 gametes의 형성이 돌연변이 표현 형 잠재적으로 전체 게놈 tetraploid 긴장을 생성 하는 데 사용 될 수 제안 했다.
Tetraploid C. 선 충 종자의 생성:
모든 생성 된 tetraploid 긴장에 rec-8 유전자에 돌연변이의 존재는 뚜렷이 RNAi29,37여 rec-8 내려 노크 하 여 피할 수 있습니다. Rec-8 돌연변이 할29,37RNAi rec-8 기능 감소 전체 게놈 tetraploid 동물, 잠재적으로 증가 줄 수 있는 2 중 gametes을 생성 것 이라고 가정 한다. 이 프로토콜에 필수적인 rec-8 돌연변이 2 중 gametes을 합리적으로 많은 젊은 aneuploid gametes와 치명적인 주로 살 균 또는 배아/애벌레를 다른 meiotic 뮤턴트 반대를 폐하입니다.
여러 tetraploid 긴장 ( 프로토콜, 그림 2및 표 1참조) 두 가지 전략 중 하나를 사용 하 여 rec-8 dsRNA를 표현 하는 선 충 C. 박테리아를 먹이로 생성 했다27. Tetraploids 자체 기름 광고에 나온 것으로 접시에 2 ~ 3 세대에 대 한 rec-8 dsRNA를 표현 하는 박테리아를 생성할 수 있습니다. 자웅 동체에 갓 배치는이 전략에 의해 만들어진된 rec-8 RNAi 접시와 그것의 자손 갓 유도 rec-8 RNAi 표현 박테리아 ( 프로토콜참조)와 함께 새로운 접시에 나중에 몇 일 전송 됩니다. 또한, tetraploids rec-8 dsRNA ( 를 표현 하는 박테리아와 rec-8 dsRNA 접시에서 동일한 유전자 형의 치료 남성을 표현 하는 박테리아를 먹이 광고에 나온 것의 1 세대를 건너 통해 생성 될 수 있습니다. 그림 2). 이 경우에, 십자가에서 남성에서에서 노출 됩니다 rec-8 RNAi 박테리아에 L4 단계 이후, 짝짓기 하는 동안. 두 구성표 tetraploid 동물27을 일으키 다. 표 1 은 여기에 제시 된 계획을 사용 하 여 얻은 tetraploid 종자를 보여준다. Triploid 및 tetraploid C. 선 충 보다는 더 큰 크기에서 diploids, 하지만 triploid 종자 불안정 tetraploid 긴장은 상대적으로 안정적인22,23반면 하나 또는 두 개의 세대 2 중 될 경향이 있다. 상 상속 tetraploid 종자는 원래 스트레인 (Lon) 광고에 나온 것만 론 자손 (그림 3A)를 물려받은 그 보다 더 큰 것으로 확인 되었다. 론 동물 쉽게 확인-야생 타입 2 중 동물 tetraploids의 길이의 2/3 고 그들의 시체 앞으로 정현파 움직임 (그림 3A) 동안 발견 될 수 있는 여분의 벤드를 만들지 않는다.
Tetraploid 종자는 tetraploid 광고에 나온 것 2 중 광고에 나온 것 (그림 3BC, 그리고 영화 1)의 oocytes에서 6 개의 염색체 쌍에 비해 oocytes에서 12 염색체 쌍의 존재에 대 한 심사에 의해 확인 되었다.
Tetraploid 클래스:
두 가지 유형의 tetraploid 광고에 나온 것이 확인 되었다: 하나의 물려받은 남성 2 중 광고에 나온 것, 다른 비슷한 주파수에서 물려받은 남성이 훨씬 더 높은 주파수 (표 1). 이러한 두 종류 tetraploid 광고에 나온 것의 비슷합니다 2 중 남성의 클래스 생성 주파수는 tetraploid 모든 염색체 (4A, 4 배), 대 한 남성의 생산 클래스 높은 주파수는 다 표시 되었습니다. 광고에 나온 것 autosomes 하지만 성 염색체 (4, 3 X)에 대 한 triploid tetraploid입니다. Tetraploids의 최신 클래스 안정 되며 4A, 3 X 광고에 나온 것과 4A, 2 X 남성 생산.
Tetraploid 긴장 느리게 성장 하 고 생산 감소 가만히 크기 이전 방법22,23생성 된 변종 처럼 그들은에서 파생 했다 diploids에 비해. 그러나 Madl와 허먼22 제안 tetraploid 긴장에서 죽은 태아의 증가 비율에는 oocyte 이수성 때문일 수 있었다,이 수가 상승 tetraploid 종자의 표면 검사 충분히 공개 하지 않았다 oocytes도 비정상적인 oocyte 또는 spermatocyte 사단 무리 크기 (영화 2및 그림 3C, D)에서 관찰 된 감소를 위한 계정.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig1.jpg"> 그림 1: rec-8 돌연변이에 Gametogenesis 의미 안정 이다 얼룩 생성 가능한 메커니즘. 야생 유형 및 rec-8 돌연변이 meiotic 부문에서 염색체 조직 및 분리 패턴의 (A) 도표. 야생 타입 감수 분열에서 상 동 염색체 첫 번째 meiotic 부문에서 분리합니다. 각 체에 자매 chromatids 동일한 스핀 들 극 쪽으로 방향을 설정 하 고 2 부까지 함께 남아. Rec-8 돌연변이, homologs 크로스, 형성 하지 않는다 고 따라서 연결 되지 않은. 반면에 야생 유형, rec-8 자매 chromatids 서로에서 방향 및 첫 번째 meiotic 부문에서 분리. 야생 유형 및 돌연변이 oocytes 여성 pronucleus 및 돌출된 극 시체 (남성 pronucleus 묘사 되지 않습니다)의 (B) 도표. 야생 타입 oocytes, 2 개의 비대칭 meiotic 사단 2 극 시체의 압출에 결과. 그러나 Rec-8 돌연변이에, 두 번째 극 몸 돌출 실패 2 중 oocyte에서 발생 합니다. (C) 야생 유형 및 rec-8 mCherry::histone H2B 표현 된 돌연변이 oocytes의 이미지. 화살표는 두 개의 북극 야생 타입 oocyte에서 몸과 rec-8 돌연변이에 하나를 나타냅니다. 눈금 막대는 5 µ m. (D 및 E) 라이브 이미지 야생 유형 및 rec-8 mCherry::histone H2B (마젠타) 표현 된 돌연변이 동물에서 spermatids의. 화살촉은 anucleate spermatids를 나타냅니다. 눈금 막대는 2 µ m. (D) Spermatocytes 야생 유형 및 rec-8 돌연변이에서 두 번째 (신진) 사단을 겪고. 야생 타입 spermatocytes 대칭 사단을 4 신진 spermatids, 각각 단일 염색체 보완 결과 받 다. Rec-8 돌연변이 spermatocytes, 염색체 분리 2 부에 손상 이다. 가장 자주 chromatin의 단일 질량 남아 잔여 몸 (RB) 또는 두 자매 중 두 번째 meiotic 부문에서 spermatids. 이 anucleate rec-8 돌연변이 정자 (화살촉으로 표시) 또는 2 중 정자에 상승을 제공 합니다. (E) 야생 유형 및 rec-8 돌연변이 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 시각에서 포스트 신진 spermatids의 라이브 이미지. 모든 야생 타입 spermatids 유사한 chromatid 대 중 있다. rec-8 돌연변이 spermatids anucleate 정자 형성. (F) 야생 유형 및 rec-8 돌연변이 anucleate 정자의 정량화. rec-8 돌연변이의 anucleate 정자에서 야생 타입 미만 1.6%에 비해 38.5% 생산. 피셔의 정확한 시험 rec-8 돌연변이의 anucleate (p ≤0.0001) 야생 타입에 비해 상당히 높은 발생률을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig2.jpg"> 그림 2: 생성 하 고 어떤 긴장에서 tetraploid C. 선 충 분리에 대 한 체계. 오른쪽에 화살표 프로토콜 하루 1에서 시작 하 고 하루 17에 진행의 타임 라인을 나타냅니다. 하루 9에 치료 되지 않는 남성에 게 교차점 광고에 나온 것으로 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. 괄호는 시간 표시 막대에 단계의 묘사를 연결합니다. 치료 되지 않는 동물 오렌지, 치료 동물 들은 빨간색, 론 동물 크기에 더 큰, rec-8 dsRNA 박테리아 표현로 서 투명 한 붉은 배경 및 일반 OP50 박테리아 투명 판 투명 한 회색에 그려진 그려져 배경 접시입니다. 달리 명시 되지 않은 절차 15 ° C에서 이루어집니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig3v2.jpg"> 그림 3: Tetraploid 예. (A) tetraploid (MSC2) 동물 및 2 중 변형 (AV740)에서 파생 된 그것의 밝은 분야 심상. Tetraploid C. 선 충 보다는 2 중에 있는 전반적으로 크고 긴 (경도). 몸 크기에이 차이 이동 tetraploid 본문의 추가 사인 곡선 귀착되 고 tetraploid 파생 상품에 대 한 화면을 기준으로 사용할 수 있습니다. 눈금 막대는 0.1 m m. (B, C) 형광 이미지 (AV740) 2 중 및 tetraploid (MSC1) 가장 성숙한 unfertilized oocyte nulcei, meiotic 사업부 이전. 2 차 심사는 같이 영화 1 에서 Mcherry::H2B 및 GFP::β-Tubulin는 생식에 표현 MSC1 스트레인에 대 한 설립된 론 긴장의 unfertilized oocytes에서 염색체 쌍의 수를 관찰 하 여 수행 됩니다. 눈금 막대는 일반적으로 정상적인 감수 분열을 묘사한 tetraploid oocyte meiotic 사단의 시간 경과 (동영상 2)에서 5 µ m. (D) 이미지입니다. 극 지 시체를 표시 하는 화살표 머리와 점선 안에 spermatheca oocyte의 피 질을 표시 하 고 둘러싸인 정자; t = 시간 분에 타락 한. 눈금 막대는 10 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유전자 형</td>
			<td>Tetraploid 파생 (Autosomes의 설정: # X-chromosomes의) *</td>
			<td>부모의 부담 (2 중)</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs16 [파이-1p::mCherry:: 그의 58 + unc-119(+)];</td>
			<td>MSC1 (4A:4 X)</td>
			<td rowspan="6">MSC0</td>
		</tr>
<tr>
<td>
ruIs57 [파이-1p::GFP::b-tubulin + unc-119(+)]
</td>
			<td>MSC2 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC3 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC5 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC6 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC8 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">unc-119(ed3) III; ddIs6; ddIs6 [tbg-1::GFP + unc-119(+)]; ltIs37; ltIs37 [pAA64; 파이-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] 4</td>
			<td>MSC14 (4A:3 X)</td>
			<td rowspan="3">TMR17</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSC15 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSC16 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>spo-11 (me44) / nT1 IV; + nT1 [qIs51 [묘 2::gfp Ppes-10::gfp, PF22B7.9::gfp]] V</td>
			<td>AV800&
</td>
			<td>AV776</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs8 [파이-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II;</td>
			<td rowspan="3">AV809&
</td>
			<td rowspan="3">AV727</td>
		</tr>
<tr>
<td>ltIs37 [파이-1p::mCherry:: 그의 58 + unc-119(+)] IV;</td>
		</tr>
<tr>
<td>ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs8 [파이-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; mnT12 (X; 4)</td>
			<td>AV826&
</td>
			<td>AV695</td>
		</tr>
<tr>
<td>mIn1 [dpy-10(e128) mIs14 [묘 2::gfp pes-10::gfp]] /</td>
			<td rowspan="2">AV810&
</td>
			<td rowspan="2">DR2078</td>
		</tr>
<tr>
<td>
bli-2(e768) unc-4(e120) II </td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">
ruIs32 [파이-1::GFP::H2B + unc-119(+)] III </td>
			<td>AV822&
</td>
			<td rowspan="2">AZ212</td>
		</tr>
<tr>
<td>AV823&
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. briggsae-mfIs42 [Cel-시드-2 + Cel-묘-2::DsRed]</td>
			<td>AV824&
</td>
			<td>JU1018</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: Tetraploid 긴장 생성. * Oocytes 물려받은 남성의 비율 뿐만 아니라 meiotic 사단 이전에 bivalents (연결 된 동종 쌍) 및 univalents (개별 homologs)의 수를 채 점 하 여 추론.
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57296/57296video1.jpg"> 영화 1: 안정적인 론 종자 인지 전체 또는 부분 tetraploids를 확인 하는 심사. 영화 시작 지역 강조는 야생 타입 자웅 동체의 다이어그램 염색체 쌍을 계산 하 여 tetraploids를 식별 하기 위해 (unfertilized oocytes) 몇 군데. 다이어그램, 따라 Z-스택 영화와 예측의 시리즈 DAPI 스테인드 고정 하는 2 중 고 tetraploid 동물의 생식 선 표시 또는 Mcherry::H2B 히스톤을 표현 하는 긴장의 이미지 라이브. 심사는 unfertilized oocytes에 연결 된 상 동 염색체 쌍의 수를 계산 하면 됩니다. MCherry 또는 DAPI 계산 묻은 시체 spermatheca ("-1 oocyte")를 저장 하는 정자에 가장 가까운 unfertilized oocyte에서 이루어집니다. 이 oocyte에서 염색체 가장 응축 하 고 보다 정확한 체 쌍 수에 대 한 수 있도록, 서로에서 분리. 스트레인 당 10 이상 동물-1 oocyte 염색체 수가 정확 했다 되도록 상영 했다. 스택 두께 0.2 µ m. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/Movie1.mov" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이 비디오를 볼 것 이다. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57296/57296video2.jpg"> 영화 2: Tetraploid oocyte 사단 정상 나타납니다. 히스톤 Mcherry::H2B와 GFP::β-Tubulin tetraploid 스트레인의 oocyte 분할의 시간 경과. 타이밍 및 패턴 부분의 정상 표시 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/Movie2.mov" target="_blank">제발 2.5 분 마다 촬영 한 이미지를이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

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Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

이 메서드는 모든 2 중 부담에서 tetraploid 및 triploid 꼬마 선 충의 세대에 대 한 수 있습니다. 이다 긴장이이 메서드에 의해 생성 된 meiotic 의향에서 염색체 상호 작용을 공부 하는 데 사용 되었습니다 그리고이 메서드는 셀을 개발, 진화, 그리고 암 생물학에서 중요 한 기본적인 질문을 검토 하는 데 유용.

꼬마 선 충 에 Ploidy의 조작

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

10.9K 조회수.  City University of New York. 이 메서드는 모든 2 중 부담에서 tetraploid 및 triploid 꼬마 선 충의 세대에 대 한 수 있습니다. 이다 긴장이이 메서드에 의해 생성 된 meiotic 의향에서 염색체 상호 작용을 공부 하는 데 사용 되었습니다 그리고이 메서드는 셀을 개발, 진화, 그리고 암 생물학에서 중요 한 기본적인 질문을 검토 하는 데 유용.

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

연구

유전학

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

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Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and organs. The O9-1 cell line is derived from the endogenous mouse embryonic NCCs and maintains its multipotency. However, under specific culture conditions, O9-1 cells can differentiate into different cell types and be utilized in a wide range of research applications. Recently, with the combination of mouse studies and O9-1 cell studies, we have shown that the Hippo signaling pathway effectors Yap and Taz play important roles in neural crest-derived craniofacial development. Although the culturing process for O9-1 cells is more complicated than that used for other cell lines, the O9-1 cell line is a powerful model for investigating NCCs in vitro. Here, we present a protocol for culturing the O9-1 cell line to maintain its stemness, as well as protocols for differentiating O9-1 cells into different cell types, such as smooth muscle cells and osteoblasts. In addition, protocols are described for performing gene loss-of-function studies in O9-1 cells by using CRISPR-Cas9 deletion and small interfering RNA-mediated knockdown.

O9-1 is a multipotent mouse neural crest cell line. Here we describe detailed step-by-step protocols for culturing O9-1 cells, differentiating O9-1 cells into specific cell types, and genetically manipulating O9-1 cells by using siRNA-mediated knockdown or CRISPR-Cas9 genome editing.

경작 및 O9-1 신경 크레스트 세포의 조작

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are two types of HM based on microscopic morphological evaluation, complete HM (CHM) and partial HM (PHM). These can be further subdivided based on the parental contribution to the molar genomes. Such characterization of HM, by morphology and genotype analyses, is crucial for patient management and for the fundamental understanding of this intriguing pathology. It is well documented that morphological analysis of HM is subject to wide interobserver variability and is not sufficient on its own to accurately classify HM into CHM and PHM and distinguish them from hydropic non-molar abortions. Genotyping analysis is mostly performed on DNA and tissues from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) products of conception, which have less than optimal quality and may consequently lead to wrong conclusions. In this article, detailed protocols for multiplex genotyping and flow cytometry analyses of FFPE molar tissues are provided, along with the interpretation of the results of these methods, their troubleshooting, and integration with the morphological evaluation, p57KIP2 immunohistochemistry, and fluorescence in situ hybridization (FISH) to reach a correct and robust diagnosis. Here, the authors share the methods and lessons learned in the past 10 years from the analysis of approximately 400 products of conception.

Hydatidiform moles are abnormal human pregnancies with heterogeneous aetiologies that can be classified according to their morphological features and parental contribution to the molar genomes. Here, protocols of multiplex microsatellite DNA genotyping and flow cytometry of formalin-fixed paraffin-embedded molar tissues are described in detail, together with results&#8217; interpretation and integration.

마이크로위성 DNA 게노티핑 및 유동 세포분석분석분석포르민고정파라핀내장화증모금조직

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...