Name: manipulation of ploidy in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Biz Caenorhabditis genetik Merkezi (Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) Office, araştırma altyapı programları P40 OD010440 tarafından finanse edilir) suşlar için teşekkür ederim. Yazarlar Baptiste Roelens ve Eli Lessman, bize yapıcı geribildirim ve CCNY, CUNY filme bölümü için ve onların yardım için kendi laboratuvar kullanımı için Mano laboratuarda sunmak için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser bir PSC CUNY Ödülü TRADB-46-113 tarafından desteklenen ve NIH 1SC2GM118275-01 vermek. M.S. kısmen Sağlık (CIHR) doktora sonrası bursu bir Kanada Enstitüsü tarafından desteklenen ve E.K. NIH/NIGMS RISE tarafından desteklenen GM062981 verin.

1. ayar kadar rec-8 RNAi (günde 1-3 Şekil 2)
Bu iletişim kuralı Kamath ve Ahringer30değiştirilir.
<ol><li>Rec-8 dsRNA Escherichia coliifadede indüksiyon için Yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) Ağar kaplamalar31 1 mM izopropil-β-D-2-thiogalactopyranoside (IPTG) ve 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon ile desteklenmiş hazırlamak Ampisilin. 4 ° C'de karanlıkta kullanım için ilâ 4 hafta kadar saklayın.</li>
	<li>Rec-8 (W02A2.6) klon Ahringer laboratuvar Kütüphane30 rec-8 klon 100 µg/mL Ampisilin ve 50 µg/mL tetrasiklin takıma Luria suyu (LB) plakalar üzerine gelen taşıyan çizgi HT115 bakteri. Bir shaker 37 ° C'de gecede büyümek</li>
	<li>Gün 1'de, 4 mL LB içeren 100 µg/mL Ampisilin ve 50 µg/mL tetrasiklin rec-8 RNAi klon taşıyan HT115 E. coli bakteri taze çizgili tek kolonilerden tek kolonileri aşılamak. Bakteri kültürü bir Çalkalayıcı veya rulo davul 37 ° C'de gecede büyümek</li>
	<li>Ertesi sabah (gün 2), çift büklümlü (ds) RNA için rec-8 W02A2.6 1 mM IPTG son bir konsantrasyon ekleyerek ve 37 ° C'de 40 dk sallayarak HT115 bakteriyel kültür üretimi teşvik</li>
	<li>İndüksiyon sonra 100-200 µL HT115 rec-8 bakterilerin pilakalar NGM/IPTG tohum ve plakaları, oda sıcaklığında karanlık gecede (3. gün) depolamak.</li>
	<li>Ertesi sabah (4. gün), istenen nematodunun zorlanma indüklenen HT115 rec-8 bakteri plakaları için adım 2.1 açıklandığı gibi ekleyin.</li>
</ol>2. oluşturma ve Yalıtma Tetraploids (günde 4-16 Resim 2)
<ol><li>Gün 4, L4 (dördüncü larva) sahne hünsa NMG/IPTG plakaları istenen diploit yüklenmenize seribaşı önceki gün uyarılan olmuştu HT115 rec-8 bakteri ile 3-4 genç yerleştirin (1.5, yukarıda adım). Karanlıkta 15 ° C'de nematodlar büyümek.</li>
	<li>Üç gün önce bu adım ilk döl (F1s) L4s haline olacak adımları 1.3 ve 1.4 3 gün sonra adım 2.1, başlangıç yineleyin. Zamanlama bu adımın ne kadar hızlı bir yuvarlak yük 15 ° C'de büyür bağlıdır Diploit bir mutant suşları yavaş yetiştiricileri vardır ve bu zamanlama güzel tetraploids yalıtmak için ayarlama.</li>
	<li>Gün 8 (sonra 4 gün rec-8 RNAi beslenme tedavisinin), 20 (2 hünsa/Petri kabına) taze indüklenen HT115 rec-8 RNAi üzerine HT115 rec-8 bakteri yetiştirilen F1 (ilk anne babaya üretimi) L4 hünsa aktarmak ve izin Onları self-fertilize için.<ol>
<li>Alternatif olarak, HT115 rec-8 bakteriler taze yetiştirilen transferi 20 F1 L4 hünsa HT115 rec-8 RNAi bakteri ile birlikte aynı baskı (4-6 erkek/plaka ile 2 hünsa) tedavi edilmezse erkek indüklenen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gün 13, uzun görünür döl için F2 (ikinci anne babaya nesil) tarama Başlat (Lon) veya genel olarak büyük vahşi türü; ardından tek tek Lon hayvanlar düzenli OP50 veya HB101 E. coli bakteri suşları üzerine aktarın. F3 (üçüncü anne babaya) döl eleme devam; Ancak, eğer onlar kurulan haline bağımsız suşları F3 döl aynı plaka kabul edilemez, çünkü onlar olabilir aynı kardeş zaten F2 anne kurmuştur. Not: diploitler açıkça uzun oldukları için sözde tetraploids kolayca tanımlanır. Vahşi türü hünsa 2/3 tetraploids kısa olan. Uzun olduğundan, ileri sinüsoidal dalgalar vücut bükme başından kuyruğuna (şekil 3A) oluşturarak hareket ederken bir tetraploid vücut ilave bir dönüş yapar.</li>
	<li>Lon solucan Self-fertilize ve rec-8 RNAi tedavi yokluğunda sadece döl Lon çocuğu kadar Lon döl seçerek yaymak izin verir. Bu iki ya da üç ek nesiller alabilir. Lon solucanlar kez steril ve döl verim değil.</li>
</ol>3. doğrulama Tetraploid suşları (film 1 ve şekil 3A, B)
Not: Tetraploid suşları kromozomlar içinde onların döllenmemiş yumurta sayısını hesaplama tarafından doğrulanabilir. Floresan mikroskobu-ebilmek var olmak kullanılmış zorlanma kromozomlar floresan avans varsa (önce segregasyonun bölümler) döllenmemiş diploit yumurta kromozom çiftlerinin sayısı için ekran için. Floresan kromozom işaretleri yokluğunda tetraploid nematodlar nematodlar sabitleme ve DNA boya ile boyama tarafından taranması; etanol sabitleme ve bütün hayvan 4'için bir iletişim kuralı için aşağıya bakın 6-Diamidine-2 '-phenylindole dihydrochloride (DAPI) boyama.
<ol><li>Bütün hayvan DAPI boyama Not: Tetraploid suşları 12 bağlı kromozom çiftleri taşıyan bu hayvanlar boyama ve onun döllenmemiş yumurta DAPI organları sayılması DAPI tarafından doğrulanabilir.<ol>
<li>Yer 5-10 µL M9 arabellek31 mikroskop slayt, ardından açılan için 6-10 nematodlar aktarın.</li>
		<li>Diseksiyon mikroskop altında hav bırakmayan bir temizlik dokusuyla nematodlar kaldırmadan damla--dan M9 çoğunu çizin. Daha sonra hemen % 90 etanol solucanlar üzerine bir 10 µL damla ekleyin. Tamamen, ama için Kuru solucanlar artık birkaç saniye izin ver.</li>
		<li>En kısa zamanda etanol buharlaşır (diseksiyon mikroskop altında böyle olduğundan bu görülebilir), ek bir 10 µL % 90 etanol solucanlar üzerine ekleyin.</li>
		<li>3.1.3 üç kez daha yineleyin.</li>
		<li>Bir kez etanol son damla buharlaşıp vardır, DAPI veya Höchst boya 6 µL seçim (örneğin, bir 2 ng/µL DAPI hisse senedi konsantrasyon M9 içinde 1:1,000 seyreltme) önerilen son konsantrasyonu montaj medya ekleyin. %0,5 p-boya 20 mM Tris-HCl, pH % 90 gliserol antifade çözüm olarak 8.8, yerine sadece, M9 içinde çözünmüş slaytları uzun süreli depolama için kullanılır.</li>
		<li>Solucanlar bir coverslip ile slayt üzerinde kapak ve coverslip tırnak cilası ile kenarlarını kapatın. Floresan mikroskop (Adım 3.1.7) puanı en az 10 dk coverslip ekledikten sonra. Slaytlar antifade olmadan puanlama birkaç gün 4 ° C'de depolanabilir, ancak Floresans kalitesini birkaç gün sonra azalmaya başlar.</li>
		<li>100 X büyütme oranında floresan mikroskop kullanarak Puan edinildi tek DAPI organları (muhtemelen tek kromozom çiftleri) sayısı için spermatheca hemen bitişik olan ve henüz spermatheca girmedi en olgun döllenmemiş yumurta içinde ya da Rahim.<ol>
<li>Bireysel DAPI organları içinde bir oosit çekirdeğe puanı için mikroskop'ın iyi odak yavaş yavaş oosit çekirdeği tepesinden sayım sırasında altına taşımak için kullanın. Sonra aynı çekirdek odağı (Yani, alt üst çekirdeği) ters yönde DAPI organları sayılan sayısını onaylamak için hareket ederken anlattıklarında.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Her birinde en az on hünsa istikrarlı Lon zorlanma başına iki gonads en olgun döllenmemiş yumurta puan. Vahşi türü yumurta 6 DAPI organları üzerinde ortalama, 5 autosome çift ve seks kromozom çifti var. Bu zorlanma hayvanlarda kısmi (Autosomes, 3 X-chromosomes 4 setleri) ya da (4 takımları Autosomes, 4 X-chromosomes) çoğu yumurta 12 DAPI organları istikrarlı Lon suşlarının olduğunu gösteren tetraploids.</li>
		<li>DAPI organları zorlanma başına birden çok (en az 10) yumurta dan gözlenen ortalama sayısını hesaplayın. Bazı kromozom çiftleri dokunaklı ya da sağ üst kısmında bir başka DAPI sayısı bir oosit organları bu yüzden genellikle kromozom çiftleri gerçek sayısından daha küçük olduğunu.</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Daha fazla istikrarlı Lon suşları DAPI organları ortalama sayısı 12 tam (4A, 4 X) veya kısmi (4A, 3 X) olup test etmek için nerede doğrulamak kromozom eksen proteinler HTP-332gibi karşı boyama ayirt tarafından tetraploids. Bu boyama kromozom çiftleri bağlanmamış kromozomlar kısmi tetraploid mevcut tek bir haç desen göstererek ayıracaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Haploit (n) gamet üretim gübreleme, diploid (2n) zigot oluşturma anahtarıdır. Bu azalma genom kopyası bir tek genom tekrarından sonra iki ardışık hücre tümen ile mayoz sırasında gerçekleştirilir. Haploid oluşturmak için gamet, C. elegans, ile en diğer metazoans gibi maternally ve paternally-kaynaklı homologs ilk bölümünde ise ayırmak chromatids her homolog dan ayırmak da ikinci bölümde kardeş. Bir şekilde o tüm genom poliploidi doğada doğar yarım genom büyüklükleri mayoz sırasında başarısız gamet nesil geçer.
Bu o tetraploid 50 yılı aşkın zamandır C. elegans nematodlar uygun ve verimli. Nigon23ve daha sonra Madl ve Herman22, oluşturulan ve C. elegans tetraploids bir avuç segregasyonun kromozom segregasyon kesintiye tarafından tanımlanan ve ısı-şok tedavileri kullanarak genetik işaretler, anılan sıraya göre. Tek bir ek C. briggsae tetraploid zorlanma elde edilen 30 yılı aşkın bu iletişim kuralını kullanan daha sonra24. Bu tetraploids nasıl C. elegans belirlemek olup erkek veya hermafrodit, büyüme ve boyut Ploitlik düzenleyen nasıl olmak ve eþleþtirme ve mayoz25,26, synapsis çözümlemek için araştırmak için kullanılmıştır 38 , 39 , 40. henüz bunlar ve belirli tetraploids veya triploid suşları kullanımı gerektiren diğer çalışmalarda bu yöntemle tetraploid suşları üreten zorluk Antlaşmasına neredeyse uygundu.
Burada açıklanan protokol istikrarlı tam 4A, 4 X nesil sağlar ve kısmi 4A, 3 X tetraploid Caenorhabditis nematodunun suşları herhangi diploit genetik arka plan ilk veya genetik işaretler kullanmadan karyotip.
Tetraploidy C. elegansbir mekanizma daha tarafından ortaya çıkabilir:
Madl ve Herman onlar büyük olasılıkla oluşturulan tetraploid suşları triploid bir ara durumundan türetilmiş önerdi. Onların suşları seçim birden çok kuşaklara veya sözde triploid diploit erkek22ile ara geçiş yoluyla elde edilmiştir. Ekranlarda verir yükselişi diploit yumurta ve sperm için rec-8 mutantlar bölümleme kromozom bulunan başka bir olası mekanizma hangi rec-8 ile RNAi düzeni27tetraploid hayvan çıkabilecek öneririz.
Rec-8 tedavi RNAi hünsa diploit yumurta ve döllenme üzerine tetraploid hayvan çıkmasına spermatocytes üretmek olabilir. Klonlanmış F2 hünsa bazıları artış istikrarlı Lon suşları için öneriyor sonraki nesilde klonlanmış Lon F2 hünsa verdiğini bu imkanı ile tutarlıdır zaten tetraploid nerede. Geçişi düzeninde rec-8 tedavi RNAi hünsa ilk nesil tedavi edilmezse erkek ile geçti. Diploit spermatocytes hala haç rec-8 dsRNA ifade bakteri varlığında yapılır ve böylece, erkeklerde en az 3 gün boyunca çiftleşme sırasında rec-8 ' e RNAi maruz kalır çünkü erkeklerde çıkabilecek. Bu nedenle, Lon polyploids cross-fertilizing düzeni de diploit yumurta döllenme diploit sperm tarafından oluşmuş. İstikrarlı tetraploid suşları ya döllenme diploit gametler arasında veya değişken Ploitlik yumurta haploit sperm üreten diploit hayvanlarla içeren triploid hayvanlar trafik kavşağından ortaya çıkabilir.
Dikkat edilmesi gerekenler:
Öz-karşılıklı etkileşimlere düzenleri karşı:
Rec-8 RNAi kendi kendine gübreleme düzeni F1 hünsa tedavi ve tedavi edilmezse erkekler tedavi hünsa in içeren düzeni doğuran 4A, 4 X ve 4A, 3 X tetraploid suşları. Daha fazla polyploids kendi kendine Gübreden düzeninden başlangıçta izole olmasına rağmen polyploid bu hayvanların daha fazla steril ve dolayısıyla her iki düzenleri tetraploid istikrarlı suşları üretir benzer şekilde verimli. Artan başarı ve kendi kendine Gübreden düzenindeki kısırlık nedeni bilinmemektedir. Her iki düzenleri benzer şekilde verimli olmasına rağmen kendi kendine Gübreden düzeni bu çiftleşme için erkek yalıtım gerektirmez gibi daha kolay olur. Buna ek olarak, faiz suşu verimsiz veya çiftleşme, hatalı olduğunda, kendi kendine Gübreden düzeni tercih olacaktır. Cross-fertilizing düzeni tek bir kromozom ikiden fazla sürümlerini içeren karmaşık tetraploids üretmek için kullanılabilir.
Değişiklikler ve sınırlamalar:
Şu anda, bu iletişim kuralı dsRNA için rec-8 gen ifade bakteri besleyerek rec-8 RNAi tedavi gerektirir. Böylece, bu iletişim kuralını Caenorhabditis türlerin RNAi için yanıt vermeyen besleme ya da mutantlar RNAi çevresel veya sistemik formada doku41,42,43arasında arızalı does değil iş. Bu sorun büyük olasılıkla RNAi tedavi ilgi dsRNA direkt enjeksiyon tarafından doğrudan germline tanıtarak çözülmüş olabilir.
Triploid hayvanlar bu düzeni istikrarlı triploid suşları44,45oluşturmaz çünkü onu türetildiği, diploit bir hayvan için bir tetraploid crossing tarafından oluşturulan gerekir. Yumurta sadece % 15 triploids kapağı tarafından çocuğu ve onların döl çoğunlukla steril döl anöploidi nedeniyle vardır. Ayrıca, kaç hayatta kalan verimli döl birkaç kuşak içinde tam ya da diploitler olma eğilimindedirler. Yumurtalar kısmen Trizomi ilk segregasyonun bölümü kutup vücuda üçüncü kromozom yavru tarafından düzeltmekte olduğunuz bu büyük olasılıkla, en azından kısmen, çünkü.
Bir aşılamaz bu protokolü bu bileşenleri RNAi makine RNAi tedavi46için dayanıklı oldukları için etkileyen mutant tetraploids yapmak için işe yaramazsa kısıtlamasıdır.
Sorun giderme:
Rec-8 RNAi:
Birkaç değerlendirmeler bu iletişim kuralı için başarılı olmak büyük önem taşımaktadır. İlk indüksiyon rec-8 (W02A2.6) klon taşıyan bakteri HT115 bakteri rec-8 dsRNA üretim için taze IPTG ve taze yapılmış IPTG NMG plakaları kullanmaktır. IPTG ışığa duyarlı ve hafif levha azaltmak önemlidir. IPTG plakaları için karanlıkta 4 ° C'de bir ay saklanabilir. İkinci olarak, rec-8 (W02A2.6) RNAi bakteriyel HT115 suşlarının Ahringer Library (Kamath ve Ahringer 2003) diğer kullanılabilir rec-8 ' den daha güçlü bir rec-8 fenotip HT115 klonlar vermiştir.
Tetraploid zorlanma bakım:
Tetraploid suşları çok yavaş büyür ve üretimi47başına en az 50 ettiklerinizden üretmek. Tüm tanımlı tetraploid suşları nispeten sabit, ama yıkmak ve diploit ne zaman (Jonathan Hodgkin kişisel iletişim ve yayınlanmamış gözlemlerimiz) vurguladı olmak. Bu nedenle, bu tetraploid suşları 25 ° C'de, ısı-şok, hasret, yetiştirilen veya dondurulmuş ve fetişlerin, onlar hızla diploidy için bu suşlar defrost Lon hayvan almaya devam etmek önemlidir bu yüzden ya da ne zaman dönebilirsiniz unutmamak önemlidir Bu suşların dönmek neden olabilir stresli koşulların ortaya.
Olası uygulamaları:
Etkisinin araştırılması veya tüm genom polyploidization evrim, hücre döngüsü, gen ekspresyonu ve çok hücreli organizmalar gelişiminde rolü arasında karşılaştırmalar dayanıyordu: farklı Ploitlik, aynı hücreyi içeren hücreleri bir canlı türlerinde yakından farklı Ploitlik bu türe veya evrimsel son polyploidization olaylar ve fiziksel izolasyon3,5,6,7,8 uğramıştır türler ile ilgili ,11,18,19,20,48,49,50. Tetraploids Zebra balığı ve fare modeli sistemlerden elde edilebilir olsa da, onların döl steril veya embryonically öldürücü16,17yaşındasın. Buna ek olarak, bu model sistemleri uzun ömürleri C. elegans, için karşılaştırıldığında var ve karmaşık ve verimsiz polyploid hayvanları üretmek için kullanılabilir yöntemleri. Bu nedenle, bu yöntemle elde edilen C. elegans suşları etkileri ve tüm genom çok hücreli organizmalarda poliploidi rolleri hakkında herhangi bir soruşturma sürdürmek için vesile olacak.
Bir triploid bir tetraploid orijinal diploid tetraploid crossing tarafından elde edilebilir, diploitler, triploids ve sadece genom kopya sayısı farklı tetraploids arasında bir karşılaştırma için benzersiz ve benzeri görülmemiş bir fırsat sağlar farklı genom büyüklüğündeki (veya gen doz) hayvanlar/organ/hücre eşdeğer değerlendirin. Esneklik ve kolay burada tanımlanan düzenini tetraploid suşları onlarca farklı genetik diploit arka planlar veya karyotypes oluşturmak bize izin verdi. Bu suşların bazıları zaten mayoz27sırasında homolog kromozom çifti ve synapsis sorgu mekanizmaları için kullanılmıştır.
Flüoresan işaretler taşıyan vahşi türü ve mutant tetraploid suşları soruşturma hücre içi/cep/organ ve tüm hayvan ölçekleme, tüm genom genom büyüklüğü ve nükleer/sitozol oranına arasındaki ilişkileri anlamak için yeni yollar sağlar adaptasyon, Türleşme, gen doz ve ifade ve doku ve organ kalkınma polyploidization. Biyolojik ölçekleme eğitime ek olarak, tetraploid suşları üretimi önemli ölçüde daha fazla sorgular ilgili ekstraselüler sinyal, genom istikrarsızlık, endoreduplication, tüm genom temel biyolojik sorulardan olacak çoğaltma, gen dozaj, onaylandığı stres, ilaçlar ve mekanizma Türleşme direnci gelişimi.

Tüm genom poliploidi çapında doğa var ve çoğu zaman gerekli bir adım uyum, Türleşme, organogenesis, yara iyileşmesi ve biyolojik ölçekleme; Ayrıca kanser ve direnç uyuşturucu1,2,3,4,5,6,7,8, tanıtmak bilinmektedir 9 , 10 , 11 , 12. Tarım ve balıkçılık sanayi oluşturmak polyploid bitkiler, Balık ve kabuklu deniz ürünleri kimyasal arıtma (örneğin, safran ve orzalin) daha hızlı büyüme oranları ve hantal bitkileri ve Hayvancılık13, almak için 14,15. Deneysel ve verimsiz üretim tetraploids, fare ve Zebra balığı model sistemleri16,17için bulunmaktadır. Ancak, üretilen çoğu veya hepsi polyploid çok hücreli hayvanlar embryonically ölümcül ya da steril ve böylece çok hücreli bir organizma poliploidi etkileri üzerinde laboratuar çalışmaları için ideal değil. Sonuç olarak, tüm genom polyploidization çok hücreli organizmalarda herhangi bir anlayış için yakından ilişkili tür evrimsel son polyploidization olaylar18,19,20 sınırlı olmuştur . Biyolojik rolü sorguları veya polyploidization sonuçlarını ilerlemek için bir yolu C. elegans modeli sistemi kullanılır. Önemlisi, C. elegans normalde bir diploid var, sadece beş autosomes (A) ve bir cinsiyet kromozomu (X) başına genom içerir, saydam vivo biyolojik süreçler, müşahede sağlayan bir uysal genetik sistemidir ve 3-4 gün (yumurtadan cinsel olgun yetişkin) kısa bir ömrü vardır. C. elegans tüm genom doğada poliploidi en sık görülen tipidir bir tetraploid olarak çoğaltmak mümkün olduğu gösterilmiştir. Triploid hayvanlar ile diploitler, tetraploids kapısı tarafından oluşturulabilir ama onların Ploitlik istikrarlı değil ve suşların birkaç kuşak içinde diploit haline.
Son birkaç on yıl içinde sadece bir avuç uygun ve verimli C. elegans zahmetli ve suşların21,22, yalnızca sınırlı türde üretir bir strateji kullanarak laboratuvarda tetraploids suşların izole 23. bu strateji C. elegans tetraploids ısı-şok tedavileri tarafından muhtemelen genetik işaretler kullanarak sözde polyploid hayvanlar için bir tarama ardından gamet, kromozom segregasyon miktarını etkiler üretir. Bu tetraploids soruşturma değerini nasıl bu Yuvarlak solucanlar erkek veya hermafrodit olabilmek için son derece yararlı. Daha sonraki çalışmalar mevcut suşları synapsis düzenlenmesi bu nematodunun21,24,25,26mayoz sırasında gen doz ve büyüme araştırmak için kullanılır. Ne yazık ki, bu çalışmalar yeni tetraploid suşları ve arka plan genetik işaretler bulunan bu suşlar üreten zorluk Antlaşmasına neredeyse uygundu. Burada gösterilen bu synapsis düzenlenmesi sırasında mayoz27çalışmaya suşları üretmek için kullanılan istikrarlı tetraploids oluşturmak için bir basit ve hızlı iletişim kuralıdır.
Doğa olduğu gibi polyploidization tarafından diploid yerine haploit gamet oluşumu ortaya çıkabilir. Mayoz özgü cohesin bileşen mutant rec-8 diploit sperm oluşturur ve yumurtalar bu rec-8 gen knocking belirtilen bizim bulgu tetraploid döl (şekil 1)27üretiminde neden olur, 28,29. Tetraploid suşları üreten sadece mutant diploit gamet phenocopy rec-8 amacıyla iki kuşağın uyumu için RNA girişim (RNAi) tarafından rec-8 knocking içerir. Sözde polyploids kolayca belirlenebilir onların daha uzun tarafından normal vücut boyuttan daha küçük. Polyploids tam veya kısmi tetraploids kez kararlı hatları kurulan kromozomlar çekirdek başına sayılması tarafından onaylanır.
Burada açıklanan stratejisi herhangi bir ilk diploit genetik arka plan veya genetik işaretler kullanmadan karyotip istikrarlı tetraploid Caenorhabditis nematodunun suşları nesil sağlar. Bu iletişim kuralı daha verimli, çok yönlü ve daha önceden kullanılan düzeni basit olduğu için geliştirme, genom istikrar ve evrim çok hücreli temel süreçlerde polyploidization rollerini sorgulamak için gereken araçları genişleyecektir organizmalar. Bu protokol kullanımında sınırlama yalnızca öngörülebilir genetik geçmiş RNAi için dayanıklı mevcuttur.

<table><tbody><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Motic Microscopy</td><td>SMZ171</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NGM agar plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td><td>Tritech Research</td><td>T3305</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile</td><td>Tritech Research</td><td>T3500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological Agar, 5 kg</td><td>VWR</td><td>89140-850</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride, Biotechnology Grade</td><td>VWR</td><td>97061-278</td><td></td></tr><tr><td>Peptone, BD Bacto</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate</td><td>VWR</td><td>97062-300</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, dioxane-free</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Lennox Broth</td><td>IBI Scientific</td><td>89126-176</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB Agar plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Lennox</td><td>IBI Scientific</td><td>89126-182</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibiotics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin Trihydrate</td><td>VWR</td><td>97062-300</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrate</td><td>Biotium</td><td>40045</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ethanol Fixation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP</td><td>Koptec, VWR</td><td>89125-166</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;M9 Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, Biotechnology Grade</td><td>VWR</td><td>97061-278</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate, monobasic dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC271750025</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi Clones&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td><td>Source Bioscience</td><td>W02A2.6</td><td></td></tr><tr><td>HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA</td><td>Dharmacon</td><td>RCE1182-202299820</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulation of ploidy in caenorhabditis elegans

Tüm genom poliploidi dahil mekanizmaları geliştirme ve evrim önemli rol oynarlar; Ayrıca, tetraploid hücreleri anormal bir nesil kanser progresyon ve ilaç direnci gelişimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Şimdiye kadar kolayca çok hücreli bir hayvan Ploitlik çoğunlukla steril döl oluşturmadan işlemek mümkün olmamıştır. Sunulan tetraploid Caenorhabditis elegans oluşturmak için basit ve hızlı bir iletişim kuralı işte hayvanlar diploit herhangi bir zorlanma. Bu yöntem kullanıcının kromozom segregasyon sonuçta Ploitlik C. elegansiçinde artan mayoz sırasında içinde bir önyargı oluşturmasına izin verir. Bu strateji diploit gamet oluşturmak için rec-8 gen ifadesi geçici azaltılması üzerinde dayanır. Rec-8 mutant tetraploids döllenme üzerine potansiyel üretebilir diploit gamet oluşturur. Uysal bu düzeni tetraploid suşları mutasyonlar ve eþleþtirme ve synapsis mayoz sırasında kromozom dinamikleri ve etkileşimleri bir anlayış kazanmak için kromozom düzenlemeler taşıyan oluşturmak için kullanılmıştır. Bu yöntem kararlı tetraploid suşların genetik işaretler olmadan oluşturmak için verimli, diploit herhangi bir zorlanma için uygulanabilir ve triploid C. eleganstüretmek için kullanılan. Bu basit yöntem diğer temel biyolojik soru genom istikrarsızlık, gen dozaj, biyolojik ölçekleme, hücre dışı sinyal, adaptasyon stres, ilaçlar, direnç gelişimi için ilgili soruşturma için yararlıdır ve Türleşme mekanizmaları.

Rec-8 segregasyonun Cohesin bileşeni işlev sonuçlarında diploit gamet bozulma:
Cohesin bileşeni mutant rec-8 segregasyonun yapılanması Imaging sperm ve yumurta tetraploid hayvan (şekil 1)27,29,33oluşturmak için olası mekanizmaları ortaya koydu. Mechanistically, rec-8 mutant sperm ve yumurta segregasyonun bölümü kusurlarý farklıdır; Ancak, hem erkek hem de dişi diploit gamet rec-8 mutant tarafından üretilmektedir.
Vahşi türü mayoz, homolog kromozomlar geçici olarak birbirine crossover rekombinasyon tarafından bağlı olmak ve ilk segregasyonun bölümü bir birim veya bivalent (şekil 1A) olarak girin34. İlk bölümü sırasında ise uzak bir başka homolog kromozomlar (homologs) ayırmak kardeş her homolog chromatids kalır birlikte kadar ikinci bölümü. Kromozom segregasyon desen kadın ve erkek gamet aynı olsa da, spermatocyte bölümler simetrik ve özel sitokinez tabi oosit bölünmeler asimetrik olanlardır. Her bölümde, oosit bölümü ürün yarısı küçük bir kutup gövde atar. Böylece, her oosit öncü bir tek haploit oosit ve iki kutup organları (şekil 1B, C)35artış sağlar. Bunun tersi olarak, bir tek spermatocyte habercisi yükselişi için dört işlevsel spermatids iki simetrik bölümler geçiren tarafından verir. İkinci bölümü dört spermatids kapalı kalan bir vücuttan tomurcuklanma ile culminates. Desen ve spermatids sayısı belirlenir centrosomes36tarafından bu sitokinez özel olmamasıdır.
Rec-8 mutant gamet habercisi, crossover rekombinasyon homolog kromozomlar arasında yer almaz ve homologs bir bivalent ilk segregasyonun bölümü29,34başında olarak bağlı değil. Onlar vahşi tip gametler içinde olduğu gibi her homolog kardeş chromatids uzak bir başka ikinci bölümü kadar kalan yerine ilk bölümü ayırmak. Nispeten normal sitokinez (şekil 1B- spermatocytes geçmesi ise sitokinez geçmesi yumurta başarısız ilginçtir, rec-8 mutant fenotip ikinci bölümü sırasında kadın ve erkek gamet farklı olmamasıdır F) 27 , 28 , 29. diploit yumurta ortaya da ikinci bölümde onlar kromozom segregasyon ve sitokinez başarısız olmaları nedeniyle, bu nedenle onlar ikinci kutup vücut (şekil 1B, C) yükseltme değil. Rec-8 germlines spermatocytes spermatid tomurcuklanma veya sitokinez tabi ama kez kromozom diploit spermatid ve Kromatin eksik bir spermatid vermeye spermatids biri için her iki kümesini ayırmak (şekil 1 d- F)27. Kromatin eksik rec-8 sperm oranı miktar şekil 1Fiçinde gösterilir.
Rec-8 mutantlar kadın ve erkek diploit gamet oluşumu bu mutant fenotip potansiyel tam genom tetraploid suşları oluşturmak için kullanılan olabilir önerdi.
Tetraploid C. elegans suşları nesil:
Geçici RNAi29,37tarafından rec-8 knocking tarafından oluşturulan tetraploid suşları rec-8 gen bir mutasyon varlığı önlenebilir. Bu gibi rec-8 mutantlar29,37RNAi işleviyle rec-8 azalma artış tüm genom tetraploid hayvan için potansiyel olarak verebilir diploit gamet oluşturmak istiyorsunuz varsayar. Bu iletişim kuralı için temel rec-8 mutantlar hem diploit gamet ortaya çıkmasına ve makul sayıda genç, aneuploid gamet ve çoğunlukla steril veya embriyonik/larva için ölümcül ortaya çıkmasına diğer segregasyonun mutantlar aksine efendim olmasıdır.
Birden fazla tetraploid suşları rec-8 dsRNA (bkz: iletişim kuralı, Şekil 2ve Tablo 1) iki stratejiden birini kullanarak ifade C. elegans bakteri besleme tarafından oluşturulan27. Tetraploids tarafından kendi kendine Gübreden hünsa Petri yemeklerinde iki ya da üç nesiller için rec-8 dsRNA ifade bakteri ile oluşturulabilir. Hermafrodit taze yerleştirilir bu strateji tarafından yapılan rec-8 RNAi plakaları ve onun soyunu taze indüklenen rec-8 RNAi ifade bakteri ( protokolübkz:) ile yeni plakalar üzerine daha sonra birkaç gün transfer. Buna ek olarak, tetraploids rec-8 dsRNA Petri yemeklerinde aynı genotip tedavi edilmezse erkek rec-8 dsRNA ( ifade bakteri ile ifade bakteri beslenen hünsa ilk nesil kapısı aracılığıyla oluşturulabilir Şekil 2). Bu durumda, çapraz erkeklerde rec-8 RNAi bakteri L4 Sahne Alanı'ndan itibaren çiftleşme sırasında maruz kalır. Her iki düzenleri tetraploid hayvan27için neden olmaktadır. Tablo 1 tetraploid suşları burada sunulan düzeni kullanılarak elde gösterir. Triploid ve tetraploid C. elegans diploitler boyutu büyük, ama triploid suşları kararsız ve tetraploid suşları nispeten istikrarlı22,23ise bir ya da iki generations diploit olma eğilimindedir. Sözde tetraploid suşları sadece Lon döl (şekil 3A) çocuğu özgün baskı (Lon) hünsa daha büyük olarak tespit edilmiştir. Lon hayvanlar kolayca tanımlanır - vahşi türü diploit hayvan üçte ikisi tetraploids uzunluğu ve vücutlarını ileri sinüsoidal hareketi (şekil 3A) sırasında fark edilebilir bir ilave bend yapmak değil.
Tetraploid suşları 12 yumurta içinde altı kromozom çiftleri diploit hünsa (şekil 3B, Cve film 1) için yumurta içinde karşılaştırıldığında tetraploid hünsa çift kromozom varlığı için tarama tarafından teyit edildi.
Tetraploid sınıflar:
İki tür tetraploid hünsa tespit edildi: diploit hünsa diğeri benzer frekanslarda bir çocuğu erkek çocuğu erkek çok daha yüksek frekanslarda (Tablo 1). Bu iki tür tetraploid hünsa üreten sınıf yüksek frekanslarda erkeklerin ise üreten sınıf Frekanslar diploit erkekler benzer tüm onun kromozom için (4A, 4 X), tetraploid farklıdır gösterilmiştir autosomes ama triploid kromozomal (4, 3 X) için için tetraploid hünsa. Tetraploids daha sonra sınıf stabildir ve 4A, 3 X hünsa ve 4A, 2 X erkek üretmek.
Tetraploid suşları daha yavaş büyür ve damızlık boyutta önceki yöntem22,23ile oluşturulan suşları için görüldüğü gibi onlar, elde edilmiştir diploitler göre üretmek. Madl ve Herman22 önerilen tetraploid suşları ölü embriyo artan oranda oosit anöploidi nedeni olabilir, ancak tetraploid suşlarının yüzeysel muayene yeterli düzeyde olmadığını göstermiştir yüksek sayıda aneuploid Yumurtalar ne anormal yumurta veya damızlık boyutu (Movie 2ve şekil 3 c, D) gözlenen azalma hesaba spermatocyte bölümler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig1.jpg"> Resim 1: Rec-8 mutant Gametogenesis istikrarlı polyploid lekeleri oluşturmak için olası mekanizmalar ima ediyor. (A)diyagram vahşi türü ve rec-8 mutant segregasyonun bölünmeler kromozom organizasyon ve segregasyon desen. Vahşi türü mayoz homolog kromozomlar ilk segregasyonun kategorisinde ayırın. Kardeş chromatids her homolog aynı Milli direk doğru yönlendirmek ve birlikte ikinci bölümü kadar kalır. Rec-8 mutantlar, homologs kesişim oluşturmaz ve böylece takılmamıştır. Buna ek olarak için vahşi türü, chromatids uzak bir başka yönlendirmek ve ilk segregasyonun bölümde ayrı rec-8 kız kardeşi. Vahşi türü ve mutant yumurtalar kadın pronucleus ve haddelenmiş kutup organları (erkek pronucleus değil tasvir) gösterilen (B) diyagramı. Vahşi türü yumurta, iki kutup ceset ekstrüzyon içinde iki asimetrik segregasyonun bölünmeler neden. Rec-8 mutantlar ancak diploit bir oosit sonuçlanan ikinci kutup vücut ekstrüzyon başarısız olur. (C) görüntülerini vahşi türü ve rec-8 mutant yumurta mCherry::histone H2B ifade. Oklar, vahşi türü oosit iki kutup gövdelerinde ve rec-8 mutant birinde gösterir. Ölçek çubuğu 5 µm. (D ve E) canlı görüntüleri spermatids mCherry::histone H2B (macenta) ifade vahşi türü ve rec-8 mutant hayvanlar üzerinden olduğunu. Ok uçları anucleate spermatids gösterir. Ölçek çubuğu (tomurcuklanma) lig vahşi türü ve rec-8 mutant geçiren 2 µm. (D) Spermatocytes olduğunu. Vahşi türü spermatocytes simetrik bölümler dört tomurcuklanma spermatids, her bir haploit kromozom tamamlayıcı ile sonuçlanan tabi. Rec-8 mutant spermatocytes, kromozom ayrımı da ikinci bölümde bozulmuş. En sık Kromatin tek bir kitle spermatids ikinci segregasyonun bölümü kalıntı vücuttaki (RB) veya bir iki kız kardeşi kalır. Bu anucleate rec-8 mutant sperm (ok uçları tarafından belirtilir) veya diploit sperm açmaktadır. (E) canlı görüntüleri sonrası erken spermatids vahşi türü ve rec-8 mutantlar fark girişim kontrast (DIC) ve floresan mikroskopisi kullanılarak görüntülenir. Vahşi türü spermatids tüm benzer Kromatit kitleler var. Rec-8 mutant spermatids anucleate sperm oluştururlar. (F) miktar vahşi türü ve rec-8 mutant anucleate sperm. Rec-8 mutantlar anucleate sperm vahşi yazın daha az % 1.6 karşılaştırıldığında % 38.5 üretti. Fisher'ın tam test bir rec-8 mutant anucleate sperm (p ≤0.0001) vahşi türüne göre anlamlı olarak daha yüksek insidansı sahip olduğunu gösterir. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig2.jpg"> Resim 2: oluşturma ve Yalıtma tetraploid C. elegans herhangi bir zorlanma düzeni. Sağındaki oku zaman çizelgesi gün 1'den başlayarak ve gün 17'ye ilerliyor Protokolü'nün temsil eder. Geçiş hünsa gün 9 tedavi edilmezse erkekler için benzer sonuçlar elde edilebilir. Parantez bir adım tasviri çizelgesine bağlanın. Tedavi edilmemiş hayvan turuncu, kırmızı tedavi hayvanlardır, boyutu büyük Lon hayvanlardır, şeffaf pilakalar ve kırmızı arka plan şeffaf ve düzenli OP50 bakteri tasvir gibi şeffaf gri bakteri ifade rec-8 dsRNA tasvir edilir arka plan tabaklar. Yordam 15 ° C'de aksi belirtilmedikçe yapılır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57296/57296fig3v2.jpg"> Şekil 3: Tetraploid örnekler. (A)parlak alan görüntüsünü bir tetraploid (MSC2) hayvan ve diploit zorlanma (AV740) elde edildi. Tetraploid C. elegans diploid daha genel olarak daha büyük ve daha uzun (Lon) vardır. Vücut büyüklüğü bu farklılığı hareketli tetraploid gövdesini ek bir sinüs eğrisi sonuçları ve tetraploid türevleri için ekran için ölçüt olarak kullanılabilir. Ölçek çubuğu 0,1 mm. (B, C) floresan diploid (AV740) ve görüntülerini tetraploid (MSC1) en olgun döllenmemiş yumurta nulcei, önce segregasyonun bölümler var. İkincil tarama kurulan Lon suşlarının, Mcherry::H2B ve GFP::β-tübülin germline içinde ifade bir MSC1 zorlanma için film 1 gösterildiği gibi döllenmemiş yumurta içinde kromozom çiftlerinin sayısı gözlemci tarafından gerçekleştirilir. Ölçek çubuğu genellikle normaldir mayoz tasvir tetraploid oosit segregasyonun yapılanması zaman atlamalı (Movie 2) üzerinden 5 µm. (D) resim var. Ok uçları kutup ceset işaretlemek ve noktalı bir çizgi spermatheca içinde yumurta korteks işaretler ve sperm tarafından çevrili; t = zaman dakika içinde lapsed. Ölçek çubuğu var. 10 µm <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/57296fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Genotip</td>
			<td>Tetraploid türev (ayarlar Autosomes: # X-chromosomes) *</td>
			<td>Ebeveyn zorlanma (diploid)</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs16 [pasta-1p::mCherry:: O'nun-58 + unc-119(+)];</td>
			<td>MSC1 (4A:4 X)</td>
			<td rowspan="6">MSC0</td>
		</tr>
<tr>
<td>
ruIs57 [pasta-1p::GFP::b-tübülin + unc-119(+)]
</td>
			<td>MSC2 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC3 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC5 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC6 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>MSC8 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">UNC-119(ed3) III; ddIs6; ddIs6 [tbg-1::GFP + unc-119(+)]; ltIs37; ltIs37 [pAA64; pasta-1p::mCherry::HIS-58 + unc-119(+)] IV</td>
			<td>MSC14 (4A:3 X)</td>
			<td rowspan="3">TMR17</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSC15 (4A:3 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MSC16 (4A:4 X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DPT-11 (me44) / nT1 IV; +/ nT1 [qIs51 [myo-2::gfp Ppes-10::gfp, PF22B7.9::gfp]] V</td>
			<td>AV800&
</td>
			<td>AV776</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs8 [pasta-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II;</td>
			<td rowspan="3">AV809&
</td>
			<td rowspan="3">AV727</td>
		</tr>
<tr>
<td>ltIs37 [pasta-1p::mCherry:: O'nun-58 + unc-119(+)] IV;</td>
		</tr>
<tr>
<td>ltIs38 [pie-1p::gfp::ph(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td>
		</tr>
<tr>
<td>meIs8 [pasta-1p::gfp::cosa-1 + unc-119(+)] II; mnT12 (X; IV)</td>
			<td>AV826&
</td>
			<td>AV695</td>
		</tr>
<tr>
<td>mIn1 [dpy-10(e128) mIs14 [myo-2::gfp pes-10::gfp]] /</td>
			<td rowspan="2">AV810&
</td>
			<td rowspan="2">DR2078</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Bli-2(e768) unc-4(e120) II </td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">
ruIs32 [pasta-1::GFP::H2B + unc-119(+)] III </td>
			<td>AV822&
</td>
			<td rowspan="2">AZ212</td>
		</tr>
<tr>
<td>AV823&
</td>
		</tr>
<tr>
<td>C. briggsae - mfIs42 [Cel-sid-2 + Cel-myo-2::DsRed]</td>
			<td>AV824&
</td>
			<td>JU1018</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: oluşturulan Tetraploid suşları. * Erkek çocuğu oranının yanı sıra segregasyonun bölümler önce yumurta sayısı bivalents (bağlı homolog çiftleri) ve univalents (bireysel homologs) puanlama tarafından çıkarılabilir.
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57296/57296video1.jpg"> Film 1: tarama istikrarlı Lon suşları tam olup veya kısmi tetraploids onaylamak için. Bölge vurgulayarak vahşi türü cinsiyetli bir diyagram ile film başlar (döllenmemiş yumurta) kromozom çiftleri sayarak tetraploids tanımlamak için görüntüsü. Aşağıdaki diyagramda, Z-yığın film ve tahminler bir dizi gonads diploit ve tetraploid hayvan sabit ve lekeli DAPI gösterme veya Mcherry::H2B Histon ifade suşları görüntülerini canlı. Tarama döllenmemiş yumurta bağlı homolog kromozom çiftleri sayısını sayarak yapılır. MCherry veya DAPI sayım lekeli organları yapılıyor döllenmemiş yumurta spermatheca ("-1 yumurta") depolama sperm yakın. Bu yumurta içinde kromozomlar en yoğun ve birbirinden ayrılmış sayıları daha doğru homolog çiftleri için izin. Zorlanma başına 10'dan fazla hayvanlar-1 yumurta kromozom sayıları doğru olduğunu emin olmak için gösterildi. Yığın kalınlığı 0.2 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/Movie1.mov" target="_blank">burayı tıklayın bu videoyu izlemek için olduğunu. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57296/57296video2.jpg"> Movie 2: Tetraploid oosit bölümler normal görünür. Zaman atlamalı oosit tetraploid zorlanma Mcherry::H2B Histon ve GFP::β-tübülin ifade bölme. Zamanlama ve bölünmeler paterni normal görünüyor. Her 2.5 dk. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57296/Movie2.mov" target="_blank">lütfen çekilen görüntüleri bu videoyu izlemek için tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Bu yöntemi tetraploid ve triploid Caenorhabditis nematodlar diploit herhangi bir zorlanma nesil olanak sağlar. Bu yöntemle üretilen polyploid suşları segregasyonun profaz etkileşimlerde kromozom çalışma için kullanılan ve bu yöntem hücre, gelişimsel, evrim, ve kanser Biyoloji önemli temel sorular incelenmesi için yararlı olur.

Caenorhabditis elegans Ploitlik manipülasyon

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

manipulation-of-ploidy-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Genetics

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

10.9K Görüntüleme.  City University of New York. Bu yöntemi tetraploid ve triploid Caenorhabditis nematodlar diploit herhangi bir zorlanma nesil olanak sağlar. Bu yöntemle üretilen polyploid suşları segregasyonun profaz etkileşimlerde kromozom çalışma için kullanılan ve bu yöntem hücre, gelişimsel, evrim, ve kanser Biyoloji önemli temel sorular incelenmesi için yararlı olur.

Video: Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Gelişim Biyolojisi

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. Whole mount preparations preserve the structure of meiotic nuclei, and importantly, each gonad arm contains all stages of meiosis, organized in a temporal-spatial progression that makes it easy to identify nuclei at different stages. Adult hermaphrodites have two gonad arms, each organized as a closed tube with proliferating germline stem cells at the distal closed end and cellularized oocytes at the proximal open end, which join in the center at the uterus. Dissection releases one or both gonad arms from the body cavity, allowing the entirety of meiosis to be visualized. Here, a common protocol for immunofluorescence against a protein of interest is presented, followed by DAPI staining to mark all chromosomes. Young adults are immobilized in levamisole and quickly dissected using two syringe needles. After germline extrusion, the sample is fixed before undergoing a freeze crack in liquid nitrogen, which helps permeabilize the cuticle and other tissues. The sample can then be dehydrated in ethanol, rehydrated, and incubated with primary and secondary antibodies. DAPI is added to the sample in the mounting medium, which allows reliable visualization of DNA and makes it easy to find animals to image under a fluorescent microscope. This technique is readily adopted by those familiar with handling C. elegans after a few hours spent practicing the dissection method itself. This protocol has been taught to high-schoolers and undergraduates working in a research lab and incorporated into a course-based undergraduate research experience at a liberal arts college.

C. elegans Gonad Dissection and Freeze Crack for Immunofluorescence and DAPI Staining

This is a commonly used method for C. elegans gonad dissection followed by freeze crack, which produces germline samples for immunofluorescence via antibody staining, or for simple DAPI staining to visualize DNA. This protocol has been successful for undergraduates in a research lab and in a course-based undergraduate research experience.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

The C. elegans germline makes an excellent model for studying meiosis, in part due to the ease of conducting cytological analyses on dissected animals. ...

Genetik

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as self-fertilizing hermaphrodites, which produce large broods of progeny-when males are present, they can produce even larger broods of cross progeny. Errors in meiosis, fertilization, and embryogenesis can be rapidly assessed as phenotypes of sterility, reduced fertility, or embryonic lethality. This article describes a method to determine embryonic viability and brood size in C. elegans. We demonstrate how to set up this assay by picking a worm onto an individual Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plate, establish the appropriate timeframe to count viable progeny and non-viable embryos, and explain how to accurately count live worm specimens. This technique can be used to determine viability in self-fertilizing hermaphrodites as well as cross-fertilization by mating pairs. These relatively simple experiments are easily adoptable for new researchers, such as undergraduate students and first-year graduate students.

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Here, we present a general method to determine the embryonic viability and total number of embryos produced (brood) using the model organism C. elegans.

Caenorhabditis elegans'ta embriyonik canlılık ve yavru büyüklüğünün ölçülmesi

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode research community, there is a need for an affordable and effective way to maintain large, age-matched populations of C. elegans. Here, we present a methodology for mechanically sorting and cleaning C. elegans. Our aim is to provide a cost-effective, efficient, fast, and simple process to obtain animals of uniform sizes and life stages for their use in experiments. This tool, the Caenorhabditis Sieve, uses a custom-built lid system that threads onto common conical lab tubes and sorts C. elegans based on body size. We also demonstrate that the Caenorhabditis Sieve effectively transfers animals from one culture plate to another allowing for a rapid sorting, synchronizing, and cleaning without impacting markers of health, including motility and stress-inducible gene reporters. This accessible and innovative tool is a fast, efficient, and non-stressful option for maintaining C. elegans populations.

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

The current protocol includes a methodology for the sorting and cleaning of age-matched populations of Caenorhabditis elegans. It uses a simple, inexpensive, and efficient custom-made tool to obtain a large experimental population of nematodes for research.

Caenorhabditis Elek: Bir düşük teknoloji enstrüman ve küçük çok hücreli organizmalar sıralama yöntemi

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biyoloji

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

C. elegans Development and Reproduction

Ceanorhabditis elegans is a powerful tool to help understand how organisms develop from a single cell into a vast interconnected array of functioning tissues. Early work in C. elegans traced the complete cell lineage and structure at the electron microscopy level, allowing researchers unprecedented insight into the connection between genes, development and disease. Appreciating the stereotyped development and reproductive program of C. elegans is essential to using this model organism to its experimental fullest.
This video will give you a peek into the development of a worm from fertilization to hatching, and walk you though the life stages of the newly hatched larvae on its journey to reproductive maturity. The video will detail how the major axes are established, which founder cells give rise to what tissues in the developing embryo and how to discriminate between the four larval stages. Finally, you will learn how to set up a genetic cross and we&quot;ll visit a few applications that manipulate the development and reproduction of C. elegans to experimental benefit.

Development and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Ceanorhabditis elegans is a powerful tool to help understand how organisms develop from a single cell into a vast interconnected array of functioning ...