עבודה זו נתמכה על ידי המענק שוויצרי Sinergia קרן המדע הלאומית CRSII3 147697, Stiftung לדנציג Krebsforschung לאומנות Krebsliga ציריך.

1. הכנת חלבון Cytosolic וגרעיני שבר
<ol><li>צלחת 4 x 106 ACC-MESO-4 תאים בקבוקון תרבות תא T150 גדל RPMI - 1640 בינוני בתוספת 10% FBS, x 1 פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ). כאשר תאים מגיעים זרימה של 80-90% (~5-5.5 x 106 תאים), להמשיך עם חלבון החילוץ של שבר גרעינית, cytosolic. הערה: ACC-MESO-4 תאים בטור היה המתקבלים מרכז BioResource RIKEN11.</li>
	<li>האחות בינוני, לשטוף את התאים על-ידי הוספת 15 מ"ל של PBS 1 x, להטות את הצלחת בעדינות מספר פעמים, מחוק לגמרי מגניב 1 x. להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA דגירה את הבקבוקון תרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הערה: תראו התאים במיקרוסקופ לחיפוש ניתוק; אם עדיין מחובר ברז הבקבוקון נגד בכף יד 3 פעמים.</li>
	<li>להוסיף 7 מ של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ), לאסוף את התאים בשפופרת 15 מ"ל, ספין למטה ב g x 200 במשך 5 דקות.</li>
	<li>האחות בינוני, resuspend תא גלולה עם 1.5 מ של 1 x PBS, לאחר מכן להעביר התאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. ספין למטה ב 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך תגובת שיקוע. הערה: משלב זה ואילך, לבצע את כל השלבים צנטריפוגה ב 4 ° C ולשמור כל ריאגנטים על קרח.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא קר כקרח 1.5 מ של 1 x PBS וזורקים ספין למטה התאים ב 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות את תגובת שיקוע. הערה: הסכומים הנדרשים הועידה אני, השני CER ו נר ריאגנטים הם 10, 0.55 ו- 5 כרכים של גלולה תא מוערך ארוז נפח, בהתאמה; הפרוטוקול הבא מבוסס על ההנחה נפח של 20 µL. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של ריאגנט CER אני.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של ריאגנט החילוץ cytoplasmic כקרח (CER אני) בתוספת 2 µL 1 x proteinase מעכב, למשל, לדלל 1 טבליה של מעכב פרוטאז (חינם EDTA) ב- 500 µL של מים כדי להשיג 100 x מניות. כמות זו של ריאגנט CER אני מספיקה כדי lyse µL 20 של גלולה תא ארוז נפח.<ol>
<li>כדי להעריך צניפה ארוז נפח התאים, להשוות את הצינור המכיל בגדר תא עם צינור 1.5 mL מלא עם µL 10, 20, 50 או 100 ל- PBS 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend בגדר תא על-ידי נמרצות vortexing הצינור עבור 15 s דגירה הצינור על קרח במשך 10 דקות להוסיף 11 µL של ריאגנט החילוץ cytoplasmic כקרח II (CER II) אל הרכבת התחתית, נמרצות מערבולת עבור 5 s, דגירה 1 דקות על קרח.</li>
	<li>מערבולת נמרצות במשך 5 s ו צנטריפוגה הצינור ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להעביר את תגובת שיקוע הצינור טרום מקורר נקי על קרח. תגובת שיקוע הוא השבר cytoplasmic זה נוספים המשמשים את הניסוי RNA-הנפתח.</li>
	<li>Resuspend בגדר הנותרים ב 100 µL של ריאגנט החילוץ גרעיני קרח (נר) בתוספת 1 µL של proteinase מעכב (100 x), נמרצות מערבולת 15 s. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של ריאגנט נר עם מעכבי פרוטאז.</li>
	<li>דגירה המדגם על קרח למשך 40 דקות עם vortexing ומדי פעם 15 s (כל 10 דקות).</li>
	<li>Centrifuge הצינור ב- 16,000 x g עבור 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע (זהו השבר חלבון גרעיני) לרכבת התחתית טרום מקורר נקי.</li>
	<li>המשך מיד על ידי מדידת ריכוז חלבון בשיטת bicinchoninic (BCA) (ראה טבלה של חומרים). כדי לשלוט על חלבון הטוהר של כל שבר, לבצע immunoblotting (איור 1) נגד α-טובולין (זיהוי חיובי רק ב השבר cytosolic), Poly ADP-ריבוז פולימראז - PARP (זיהוי חיובי רק ב השבר הגרעין). להמחשת חלבון, עיין בסעיף 4.</li>
	<li>על מנת לשמור על פעילות החלבון. והמדינה מקורית שלהם, להכין 25 µL של aliquots של תמציות cytosolic וגרעיני. Snap-הקפאת אלה aliquots על-ידי הצבתם חנקן נוזלי עבור 5 s ומאגר ישירות ב- 80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. תיוג של RNA עם Desthiobiotin
<ol><li>הגששים RNA מסחרית מסונתז, HPLC מטוהרים. Resuspend במים נטולי נוקלאז-10 מיקרומטר. הערה: רצפים בדיקה מפורטים בטבלה 1.</li>
	<li>השתמש pmol 50 של RNA לפי התגובה RNA-הנפתח. הפשרת ולשמור כל ריאגנטים על קרח חוץ עבור פג 30%, נהגה תווית 3' הסופית של RNA oligo.</li>
	<li>העברת µL 5 של 10 הגששים RNA מיקרומטר, כאנטי CALB2 3' UTR (הם), CALB2 3' UTR (mtARE), והכעס Unrelated-RNA (), לתוך 0.5 mL קיר דק microcentrifuge צינורות, דגירה במכונת ה-PCR ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דק במקום הצינורות מיד על קרח. הערה: השלב זה חשוב, כפי שהיא מקדמת את הנגישות של המכשיר RNA עבור תיוג רוגע.</li>
	<li>לתגובה 30 µL יחיד, להוסיף הצינור המכיל RNA המיקס 10 µL הבאים: 3 µL של נוקלאז מים חינם, 3 µL של 10 x רנ א ליגאז התגובה מאגר, µL 1 של RNase מעכב (40 U/µL), µL 1 של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 מ) , ו- 2 µL של T4 RNA ליגאז (U 20/µL). הערה: כדי להכין מיקס מאסטר א 3 דגימות עודף (3.2), לערבב µL 9.6 של נוקלאז מים חינם, 9.6 µL של 10 x רנ א ליגאז התגובה מאגר, µL 3.2 של RNase מעכב (40 U/µL), µL 3.2 של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 מ מ), ו- 6.4 µL של T4 RNA ליגאז (U 20/µL).</li>
	<li>להוסיף בזהירות 15 µL של פג 30% להתגובה. השתמש עצה נוספת כדי לערבב את התגובה. דגירה התגובה בין לילה ב-16 ° c</li>
	<li>למחרת, להכין את הדברים הבאים: 5 M NaCl (רעננה/נוקלאז חינם), כלורופורם: אלכוהול isoamyl ב- 24:1 יחס (למשל, לפי התגובה - 96 µL כלורופורם וב µL 4 isoamyl אלכוהול), אתנול 100% קר כקרח, אתנול 70% קר כקרח.</li>
	<li>להוסיף 70 µL של מים נטולי נוקלאז הצינורות התגובה תיוג-RNA. להוסיף 100 µL של כלורופורם: isoamyl אלכוהול, מערבולת בקצרה. ספין למטה ב 13,000 x g עבור 3 מינימלית הסר בזהירות רק את השלב העליון ואת העברת צינור ללא נוקלאז mL 1.5; להימנע מלגעת השלב התחתון.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של NaCl 5 מ', µL 1 של גליקוגן µL 300 של אתנול 100% קר כקרח. מקם את הצינור ב-20 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. הערה: בשלב זה, הניסוי ניתן המשיך למחרת היום.</li>
	<li>צנטריפוגה-13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להתעלם בקפידה את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. הוסף µL 300 של אתנול 70% קר כקרח, צנטריפוגה שוב ב 13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>למחוק לחלוטין את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר (15 דקות). Resuspend בגדר ב 20 µL של נוקלאז ללא מים. הערה: להמשיך עם ה-RNA-הנפתח באותו יום.</li>
	<li>דגירה את הרנ א ב 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ומניחים על קרח. מניחים את לוחיות ההסבר-RNA על קרח במהלך השלב הבא של קדם כביסה של חרוזים מגנטי streptavidin. הערה: זמן דגירה ארוך עשוי לפגום החללית ה-RNA.</li>
</ol>3. ה-RNA-חלבון הנפתח
<ol><li>
הדגירה עם desthiobiotin-RNA ושרשרות streptavidin-מגנטי כביסה קדם
	<ol>
<li>השתמש µL 50 של streptavidin beads מגנטי לכל 50 pmol RNA. עם זאת, זה צריך להיות מוטבת בהתאם הניסוי.</li>
		<li>מערבולת ברכבת התחתית עם חרוזי streptavidin-מגנטית 15 s, ובמהירות µL הסר 200 (מיקס מאסטר; מספיק תגובות 3 + 1) לתוך מנעול כספת צינור נקי mL 1.5 באמצעות חתך טיפים פיפטה. המקום את הצינורית על דוכן מגנטי כך החרוזים לאסוף על הצד של הצינור ולחכות דק 1. הסר הנוזל resuspension.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים, להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, להוסיף µL 400 של 0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl פתרון בעדינות pipet לאורך מספר פעמים. מקם את הצינור בחזרה על הדוכן מגנטי. חכה 1דקות. ולאסוף את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה שוב.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים עם µL 200 מ"מ NaCl. הסר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של 20 מ מ טריס (pH 7.5), resuspend חרוזים מאת pipetting, למקם את הצינורית על הדוכן מגנטי, לחכות 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על השלב.</li>
		<li>להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, להוסיף µL 200 1 x מאגר לכידת RNA, resuspend beads מגנטי streptavidin על ידי vortexing בקצרה. להסיר µL 50 של beads מגנטי streptavidin ולהוסיף כל שפופרת הנקרא-RNA באמצעות טיפ פיפטה לחתוך. דגירה הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגלת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
איגוד של חלבון ל RNA
	<ol>
<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לחכות 1 דקות, ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>µL 50 מ מ 20 טריס (pH 7.5) להוסיף החרוזים, resuspend על ידי pipetting. למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לחכות 1 דקות והסר תגובת שיקוע. חזור על שלב זה.</li>
		<li>להוסיף 100 µL 1 x מאגר מחייב חלבון-RNA החרוזים, resuspend על ידי pipetting.</li>
		<li>בינתיים, מכינים את התערובת הבאה: µL 10 של 10 x מאגר מחייב חלבון-RNA, 30 µL של גליצרול 50%, 50 µg של חלבונים cytoplasmic, ונטולת נוקלאז מים עד 100 µL. הערה: להכין מיקס מאסטר B 3 דגימות עודף (3.3) כדלקמן: 33 µL של 10 x מאגר מחייב חלבון-RNA, µL 99 של 50% גליצרול, 165 µg של חלבונים cytoplasmic ומים ללא נוקלאז עד 330 µL. לשמור את הצינורית של מיקס מאסטר B על קרח.</li>
		<li>למקם את הצינורות מעמד מגנטי, לחכות 1דקות. ולאסוף את תגובת שיקוע. להוסיף 100 µL של מיקס מאסטר B, resuspend על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה, הימנע מיצירת בועות. דגירה התגובה צינורות עבור 60 דקות ב 4 ° C על גלגלת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כביסה ו • תנאי
	<ol>
<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לאסוף את תגובת שיקוע (וזה לזרום - מטרים), ולהעביר לתוך צינור חדש. הערה: שמור זה מטרים על הקרח לניתוח בשלב מאוחר יותר.</li>
		<li>פיפטה µL 100 1 x שטיפת מאגר על החרוזים, resuspend בעדינות, להחזיר לתוך העמדה מגנטי, לחכות 1 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פי 2.</li>
		<li>להוסיף 40 µL • תנאי המאגר החרוזים מגנטי, לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה-37 מעלות צלזיוס על מטרף צינור (950 סל ד) למשך 30 דקות.</li>
		<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, המתן 1 דקות, ולאחר איסוף הדגימה eluted (אשר eluate - E). הצב בקירור והשתמש לניתוח במורד הזרם. הערה: בשלב זה, כל נבדק בדיקה RNA מורכב (FT) זרימה דרך הדגימה eluate (E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לזיהוי אלקטרופורזה ומערביות כתם ניתוח
הערה: ראה טבלה 2 מתכונים המאגרים נעשה שימוש בסעיף זה. לבצע מערבון כתם על פי שיטת Laemmli12.
<ol><li>Handcast ג'לים של מרחביות-דף 12% (10-ולס, מרווח 1.5 מ מ, 66 µL). להכין תערובת ג'ל ריצה: 4 מ"ל של 30% אקרילאמיד-bisacrylamide פתרון מניות, 2.4 מ של טריס התחתון מאגר, 3.2 מ"ל של dH2O, 9.6 µL של TEMED, µL 96 של 10% אמוניום persulfate פתרון (APS). להכין תערובת ג'ל הערימה: 3.25 מ ל dH2O, 0.5 מיליליטר 30% אקרילאמיד - פתרון מניות bisacrylamide, 1.3 מ של מאגר טריס העליון, 10 µL של TEMED, µL 20 10% APS.</li>
	<li>להוסיף µL 16.6 מאגר x Laemmli 6 (למשל, 14 מ"ל של טריס/HCl/מרחביות pH 6.8 (מאגר טריס העליון), דור 2 למען חברה דמוקרטית, 1.86 גר' DTT, 6 מ של גליצרול, 0.012% bromophenol כחולות; מאוחסן ב-20 ° C) לתוך הדגימה מטרים, µL 6.6 6 מאגר x Laemmli לתוך מדגם E. דגירה הדוגמאות עבור 5 דקות ב 95 ° C.</li>
	<li>לטעון את הדגימות (µL 20 מטרים ואת כל Elute µL ~ 40) ולהפעיל אותם למשך 30 דקות 60 V, ממשיכים עם 20 וי לילה.</li>
	<li>באמצעות מערכת electroblotting חצי יבש, העברת החלבונים לתוך קרום PVDF במשך 80 דקות בגיל 15 V. הערה: קרום PVDF עליהן להיות מופעלות לפני ביצוע העברה חלבון. דגירה הקרום ב- 100% מתנול עבור 1 דקות, ואחריו דגירה 2 דקות במים הנדסה גנטית.</li>
	<li>לאחר המעבר חלבון, דגירה הג'ל מרחביות-דף עם פתרון Coomassie h 3, ואחריו שלושה שלבים של שטיפה עם מים הנדסה גנטית, בכל 30 דקות.</li>
	<li>בסוף חלבון העברה, תן את הקרום PVDF יבש עבור ה 1 להפעיל מחדש את הקרום כפי שמצוין בשלב 4.5. לחסום את הקרום h 1 עם 5% BSA ב 1 x TTBS.</li>
	<li>דגירה הקרום עם הנוגדן הראשון: חור או mesothelin, שניהם מדולל 1:1000 ב 5% BSA ב 1 x TTBS במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף את הקרום שלוש פעמים במשך 7 דקות ב- 1 x TTBS, דגירה עם ארנב עכבר נגד חזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת מדולל 1:10,000 ב 5% BSA, 1 x TTBS.</li>
	<li>הצג באופן חזותי באמצעות chemiluminescence משופר ו- imager דיגיטלי של חלבונים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation.">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress:+a+matter+of+survival.">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li><li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AREsite2:+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU/GU/U-rich+elements.">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li><li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma.">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biotin-(strept)avidin+system:+principles+and+applications+in+biotechnology.">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+Uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>. Magnetic bead technology for better assay development Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013)</li><li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients.">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis/transport+of+nuclear+ferritin+RNAs.">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li><li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+function+in+disease.">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+regulatory+RNA.">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li><li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

3' UTRs שייך הגנום ללא קידוד3, כל אי קידוד RNAs יכול לקיים אינטראקציה עם חלבונים כדי להפעיל את פונקציית7. כאשר הגנום יונקים נמצאה pervasively יש לשעתק והפיק חלק ניכר RNAs זמן noncoding16, המתעוררים עדויות הדגימו כי אלה RNAs לונג-noncoding מתפקד בוויסות ביטוי גנים כפי שהם אינטר...

ביטוי גנים ואת רמת הסופי של המוצר ג'ין יכול להיות צמוד מוסדר על ידי המשפיעים על יציבות mRNA של mRNA תרגום שיעור1. מנגנונים רגולטוריים post-transcriptional אלה הם המופעל באמצעות פעולת הגומלין בין ללא קידוד RNA ו/או RNA מחייב חלבונים (RBPs) עם ה-mRNA יישוב. בדרך כלל זה 3' לא מתורגם האזור של ה-mRNA (3' UTR - השייכים החלק ללא קידוד של הגנום2) המכיל ספציפי cis-אלמנטים רגולטוריות (CRE), אשר מוכרים על ידי טרנס-מתנהג גורמים כגון miRNA או RBPs 3. הטוב ביותר למד cis-רכיב 3' UTR, אינו המוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), אשר הוכר על ידי AU מחייבת ספציפי חלבונים (AUBP), בתורו, גורם גם mRNA השפלה/deadenylation (בתיווך הם ריקבון) או mRNA מייצב4.
הגודל של 3' UTR של calretinin ה-mRNA (CALB2) הוא 573 bp ארוך ומכיל בשם AUUUA pentamer, כפי שחזיתי מאת AREsite2, כלי bioinformatic5. בקנה אחד עם הנוכחות של מוטיב הם בשם, וזמינותו וקטור-כתב pmirGLO הפגינו תפקיד ייצוב של רכיב זה בתוך ה-mRNA CALB26. לבסוף, ה- במבחנה RNA-הנפתח שימש כדי לזהות את AUBP זה מייצב calretinin mRNA דרך מוטיב הם.
מאז כל אי קידוד RNAs אינטראקציה עם חלבונים7, ה במבחנה RNA-הנפתח היא דרך טובה הראשון-של-בחירה וזמינותו לזיהוי RNA-interactors כדי לסייע בפענוח המנגנונים המולקולריים. בשיטה זו RNA-הנפתח ', הגששים RNA מסונתז באופן מסחרי, אשר הודבקו תוויות עם צורה שונה של ביוטין (desthiobiotin) התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, שימשו. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם המאוגד-RNA עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. כזה חלבונים מאוגד-RNA הם eluted של החרוזים מגנטי, לרוץ דרך ג'ל מרחביות-דף 12%, הועבר קרום, שנבדק עם נוגדנים שונים.
במסגרת ההליך טיהור זיקה streptavidin סטנדרטי-ביוטין, דנטורציה קשים תנאים נדרשים כדי לשבש את הקשר חזק בלתי הפיך ביוטין-streptavidin elute חלבונים מאוגד8, אשר יכול להוביל הדיסוציאציה של מתחמי חלבון. בניגוד ביוטין, desthiobiotin הפיכה נקשר streptavidin, שנעקרו מבתיהם תחרותי עם פתרון במאגר של ביוטין, המאפשר • תנאי עדין של חלבונים, והימנעות בידודו של באופן טבעי biotinylated מולקולות9, רומז הטכניקה הוא אידיאלי עבור בידוד חלבון יליד מתחמי בתנאים מקורית.
במבחנה מחייב תנאים, לכתחילה, אשר נקבע על ידי ריכוז המלחים, צמצום סוכנים ואחוז דטרגנט, צריך להיות קרוב הנוכחים בהקשר הסלולר כדי לזהות נכון ויוו אינטראקציות. התנאים המחייבים מיושמת בזאת בעבר הוכחו באופן המתאים הזיהוי חור חלבון מחייב AU10. גישה זו יכולה לחסוך זמן, מאז אופטימיזציה של תנאי מחייב נכונה יכול להיות זמן רב ומאתגר. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש פרוטוקול התחלה לניסוי RNA-הנפתח כלשהו, ניתן למטב בהדרגה על-ידי שינוי ריכוז מלחים, דטרגנטים, שינוי אחוז גליצרול והוספת מלחים אחרים. יתר על כן, אנחנו הראו כי אפילו קצר 25-נוקלאוטיד RNA-בדיקה מחסה pentamer הם מוטיב יכול לשמש כדי להדגים את האינטראקציה עם AUBP ספציפיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:124px;">78833</td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20164</td>
			<td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pierce RNA 3&#8217; End Desthiobiotinylation Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20163</td>
			<td style="width:468px;">The kit is a part of the &#34;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#34;, and needs to be stored at -20 &#176;C unlike the pull-down kit (4 &#176;C).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2,&#160; magnetic stand</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:453px;">Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td style="width:468px;">The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - &#945; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td style="width:124px;">8035</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&#160;</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>200-301-A87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:295px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:124px;">7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary rabbit anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A-9044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RPMI - 1640 medium</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FBS - Filtrated Bovine Serum</td>
			<td style="width:295px;">Pan Biotech&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin - streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">L-Glutamine solution (200 mM)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:295px;">Gibco by Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:124px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN 3 Cell</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini Protean System Glass Plates&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &#181;L</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1658050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:453px;">Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td>
			<td style="width:295px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">3029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">20% SDS&#160;</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td>A3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:124px;">NEF1002</td>
			<td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FusionFX&#160; Digital Imager</td>
			<td style="width:295px;">Vilber</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNA oligo synthesis</td>
			<td style="width:295px;">Mycrosynth AG, Switzerland</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td>the synthesis scale - 0.04 &#181;mol - HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">182883.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Glycerol&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td>50% sterile aliquots to be stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:453px;">Pierce Streptavidin magnetic beads&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">88817</td>
			<td style="width:468px;">Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &#181;m (range from 0.5 - 1.5 &#181;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &#181;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">TEMED</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ammonium persulfate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coomassie G-250</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A3480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">368458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ortho-phosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A0637</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

ה במבחנה RNA-הנפתח עדיין משמש את הצעדים הראשונים של פרוטוקולים שמטרתם זיהוי חלבונים RNA מחייב לזהות ספציפית RNA מבנים ומוטיבים. ב פרוטוקול זה RNA-הנפתח, הגששים RNA מסחרית מסונתז מסומנות עם צורה שונה של ביוטין, desthiobiotin, התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, אשר נקשר הפיכה streptavidin, ובכך מאפשרת • תנאי של חלבונים תחת יותר פיזיולוגית תנאים. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם הרנ א עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. ניתן להחיל את השיטה המתוארת כאן כדי לזהות את האינטראקציה בין הידועים RNA מחייב חלבונים 25-נוקלאוטיד (nt) ארוך RNA בדיקה המכיל רצף של עניין. פעולה זו שימושית להשלים אפיון פונקציונלי ייצוב או לערער יציבות אלמנטים נוכח מולקולות RNA הושג ע י שימוש assay וקטור של הכתב.

בניסוי זה, קטע ארוך 25-nt של calretinin 3' UTR מחסה הם מוטיב (CALB2 3' UTR (הם) 25-nt) נעשה שימוש כדי לבדוק אם זה באופן ספציפי נקשר חלבון R האדם-אנטיגן (חור), מייצב mRNA ידוע. כדי לבדוק את ייחודה של רכיב הן, RNA 25-nt בדיקה CALB2 3' UTR (mtARE) הכוללת של מוטציה הם מוטיב, אשר הוצג בעבר לבטל את השפעת ייצוב הם מוטיב, ...

Watch this Scientific Journal Video about Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells at JoVE.com

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.9K Views.  University Hospital Zurich. Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.

Video: Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential anti-cancer drugs. Multicellular tumor spheroids (MCTSes) effectively mimic the physiological conditions of solid tumors, making them excellent in vitro models for lead optimization and target validation. Out of the various techniques available for MCTS culture, the liquid-overlay method on agarose is one of the most inexpensive methods for MCTS generation. However, the reliable transfer of MCTS cultures using liquid-overlay for high-throughput screening may be compromised by a number of limitations, including the coating of microtiter plates (MPs) with agarose and the irreproducibility of uniform MCTS formation across wells. MPs are significantly prone to edge effects that result from excessive evaporation of medium from the exterior of the plate, preventing the use of the entire plate for drug tests. This manuscript provides detailed technical improvements to the liquid-overlay technique to increase the scalability and reproducibility of uniform MCTS formation. Additionally, details on a simple, semi-automatic, and universally applicable software tool for the evaluation of MCTS features after drug treatment is presented.

The uneven loss of medium from microtiter plates affects the reproducibility of uniform multicellular tumor spheroid formation. Improving culture conditions to reduce significant medium loss will improve the reproducibility of spheroid formation and the results of spheroid-based assays using the liquid-overlay technique.

אידוי צמצום מצב התרבות מגביר את השחזור של גיבוש התאי אליפטית צלחות microtiter טובות

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

דגם פרה העכבר של אוסטאוסרקומה כדי להגדיר את התקשורת חוץ-תאית שלפוחית בתיווך בין גידול בתאי גזע Mesenchymal

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as drug resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and metastasis. Intratumoral eATP is 103 to 104 times higher in concentration than in normal tissues. While eATP functions as a messenger to activate purinergic signaling for EMT induction, it is also internalized by cancer cells through upregulated macropinocytosis, a specific type of endocytosis, to perform a wide variety of biological functions. These functions include providing energy to ATP-requiring biochemical reactions, donating phosphate groups during signal transduction, and facilitating or accelerating gene expression as a transcriptional cofactor. ATP is readily available, and its study in cancer and other fields will undoubtedly increase. However, eATP study remains at an early stage, and unresolved questions remain unanswered before the important and versatile activities played by eATP and internalized intracellular ATP can be fully unraveled.
These authors&#39; laboratories&#39; contributions to these early eATP studies include microscopic imaging of non-hydrolysable fluorescent ATP, coupled with high- and low-molecular weight fluorescent dextrans, which serve as macropinocytosis and endocytosis tracers, as well as various endocytosis inhibitors, to monitor and characterize the eATP internalization process. This imaging modality was applied to tumor cell lines and to immunodeficient mice, xenografted with human cancer tumors, to study eATP internalization in vitro and in vivo. This paper describes these in vitro and in vivo protocols, with an emphasis on modifying and finetuning assay conditions so that the macropinocytosis-/endocytosis-mediated eATP internalization assays can be successfully performed in different systems.

We developed a reproducible method to visualize the internalization of nonhydrolyzable fluorescent adenosine triphosphate (ATP), an ATP surrogate, with high cellular resolution. We validated our method using independent in vitro and in vivo assays-human tumor cell lines and immunodeficient mice xenografted with human tumor tissue.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להפנמת ATP בתיווך מקמפונוציטוזיס בתאי גידול אנושיים ועכברים קסנוגרפטים

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary tumor cells from surgically resected, malignant pleural mesothelioma (MPM) by providing a complete overview of the process from digestion to enrichment, expansion, cryopreservation, and phenotypic characterization. In addition, this protocol introduces concepts for tumor generation that may be useful for multiple tumor types such as differential trypsinization and the impact of dissociation methods on the detection of cell surface markers for phenotypic characterization. The major limitation of this study is the selection of tumor cells that will expand in a two-dimensional (2D) culture system. Variations to this protocol, including three-dimensional (3D) culture systems, media supplements, plate coating to improve adhesion, and alternate disaggregation methods, could improve this technique and the overall success rate of establishing a tumor line. Overall, this protocol provides a base method for establishing and characterizing tumor cells from this rare tumor.

The goal of this method paper is to demonstrate a robust and reproducible methodology for the enrichment, generation, and expansion of primary tumor cell lines from surgically resected pleural mesothelioma.

ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של Pleural

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

הדמיה סימולטנית וזיהוי מבוסס זרימה-ציטומטריה של סמני סנסנציה פלואורסצנטיים מרובים בתאי סרטן סנסנטיים המושרים על ידי טיפול

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...