Name: desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
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Diese Arbeit wurde von der Swiss National Science Foundation Sinergia Grant CRSII3 147697, die Stiftung Für Angewandte Krebsforschung und Zürich Krebsliga unterstützt.

1. Vorbereitung der cytosolischen und nukleare Proteinfraktion
<ol><li>Platte 4 x 106 ACC-MESO-4 Zellen in einem T150 Zelle Kultur Kolben angebaut in RPMI - 1640 Medium mit 10 % FBS, 1 X Penicillin/Streptomycin (100 X) und 2 mM L-Glutamin (200 mM) ergänzt. Wenn Zellen einen Zusammenfluss von 80-90 % (~5-5.5 X 106 Zellen) erreicht haben, fahren Sie mit Proteingewinnung von Kernenergie und cytosolische Fraktion. Hinweis: ACC-MESO-4-Zell-Linie wurde aus dem RIKEN BioResource Zentrum11erhalten.</li>
	<li>Aspirieren Medium, Waschen der Zellen durch Zugabe von 15 mL 1 X PBS, kippen Sie die Platte vorsichtig ein paar Mal und 1 X PBS Aspirieren. Geben Sie 3 mL von 0,25 % Trypsin-EDTA und den Kultur-Kolben bei 37 ° C für 3 min inkubieren. Hinweis: Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop für Ablösung; Wenn noch Wasserhahn angebracht Mal der Kolben gegen die Handfläche einer Hand 3.</li>
	<li>7 mL RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10 % FBS, 1 X Penicillin/Streptomycin (100 X) und 2 mM L-Glutamin (200 mM) hinzufügen, sammeln die Zellen in einer 15 mL Tube und spin-down bei 200 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medium und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet mit 1,5 mL 1 X PBS, dann übertragen Sie die Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Spin-down bei 500 X g und 4 ° C für 5 min. überstand verwerfen. Hinweis: Von diesem Schritt ab, führen Sie alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C und halten Sie alle Reagenzien auf Eis.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet mit eiskalten 1,5 mL 1 X PBS und Spin-down der Zellen bei 500 X g und 4 ° C für 3 min. Überstands verwerfen. Hinweis: Die benötigten Mengen an CER sind I, CER II und NER Reagenzien 10, 0,55 und 5 Bände geschätzten Zelle Pellet-Volumen, bzw. verpackt; Das folgende Protokoll nimmt ein Volumen von 20 µL. Wir empfehlen nur die erforderliche Menge an Reagenz CER Vorbereitung ich.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL des eiskalten zytoplasmatischen Extraktion Reagenz (CER ich) ergänzt mit 2 µL 1 x Proteinase Inhibitor, z.B., verdünnen Sie 1 Tablette der Protease-Inhibitor (EDTA-frei) in 500 µL Wasser, 100 X Lager zu erhalten. Diese Menge Reagens CER ich reicht, 20 µL eines Pellet-Zelle Volumen verpackt zu lösen.<ol>
<li>Um das Zellvolumen Pellets verpackt abschätzen zu können, vergleichen Sie die Röhrchen mit der Zelle-Pellet mit einem 1,5 mL Schlauch gefüllt mit 10, 20, 50 oder 100 µL 1 X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet durch kräftig aufschütteln der Röhre für 15 s und inkubieren Sie das Rohr auf dem Eis für 10 min. hinzufügen 11 µL eiskalte zytoplasmatischen Extraktion Reagenz II (CER II) am Rohr energisch Wirbel für 5 s, und inkubieren Sie 1 min auf Eis.</li>
	<li>Vortex energisch für 5 s und Zentrifuge das Rohr auf 16.000 x g und 4 ° C für 5 min. übertragen überstand auf sauberes vorgekühlt Röhrchen auf dem Eis. Der Überstand wird der zytoplasmatischen Bruch, die weiter in der RNA-Pulldown-Experiment verwendet.</li>
	<li>Aufschwemmen der restlichen Pellets in 100 µL der eiskalte nuklearen Extraktion Reagenz (NER) ergänzt mit 1 µL Proteinase Inhibitor (100 X) und kräftig Vortexen 15 s. Es wird empfohlen, nur die erforderliche Menge an NER Reagenz ergänzt mit Protease-Inhibitoren vorbereiten.</li>
	<li>Inkubation die Probe auf dem Eis für 40 min mit gelegentlichen Vortexen für 15 s (alle 10 min).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 16.000 x g für 10 min. Transfer des Überstands (Dies ist die nukleare Proteinfraktion) in ein sauberes Röhrchen vorgekühlt.</li>
	<li>Unverzüglich durch die Messung der Konzentration des Proteins mit der Methode Bicinchoninic (BCA) (siehe Tabelle der Materialien). Um Protein Reinheit der einzelnen Fraktionen zu kontrollieren, führen Sie Immunoblotting (Abbildung 1) gegen α-Tubulin (positive Erkennung nur in die cytosolische Fraktion) und Poly-ADP-Ribose-Polymerase - PARP (positive Erkennung nur im nuklearen Bruch). Protein-Visualisierung finden Sie in Abschnitt 4.</li>
	<li>Um die proteinaktivität und ihrem nativen Zustand zu halten, bereiten Sie 25 µL Aliquots der cytosolischen und nukleare Extrakte. Snap-Freeze dieser Aliquote indem man sie in flüssigem Stickstoff für 5 s und Store direkt bei-80 ° C.</li>
</ol>2. Kennzeichnung der RNA mit Desthiobiotin
<ol><li>RNA-Sonden kommerziell synthetisiert und HPLC gereinigt. Aufschwemmen Sie mit Nuklease-freies Wasser bei 10 µM. Hinweis: Sonde Sequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
	<li>Verwenden Sie 50 Pmol RNA pro RNA-Pulldown Reaktion. Tauen Sie auf und halten Sie alle Reagenzien auf Eis, außer für 30 %, zum Label 3' Endstation der RNA Oligo PEG.</li>
	<li>5 µL 10 µM RNA-Sonden, gekennzeichnet als CALB2 3' UTR (sind) zu übertragen, CALB2 3' UTR (MtARE) und unabhängige-RNA (IRE), in 0,5 mL dünnwandige Microcentrifuge Rohre und brüten in einer PCR-Maschine bei 85 ° C für 5 min. legen die Rohre sofort auf Eis. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, da sie die Entspannung und die Zugänglichkeit der RNA-Sonde für die Beschriftung fördert.</li>
	<li>Für einen einzigen 30 µL Reaktion hinzufügen das RNA-haltigen Rohr den folgenden 10 µL-Mix: 3 µL Nuklease freies Wasser, 3 µL 10 x RNA Ligase Reaktion Puffer, 1 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL) 1 µL Desthiobiotinylated Cytidin Bisphosphate (1 mM) , und 2 µL T4 RNA Ligase (20 U/µL). Hinweis: Um master-Mix A 3 Proben im Übermaß (3.2) vorzubereiten, 9,6 µL Nuklease kostenloses Wasser mischen, 9,6 µL 10 x RNA Ligase Reaktion Puffer, 3,2 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL), 3,2 µL Desthiobiotinylated Cytidin Bisphosphate (1 mM) und 6,4 µL T4 RNA Ligase (20 U/µL).</li>
	<li>Fügen Sie sorgfältig 15 µL PEG 30 % auf die Reaktion. Verwenden Sie ein weiterer Tipp, um die Reaktion zu mischen. Die Reaktion über Nacht bei 16 ° c inkubieren</li>
	<li>Am nächsten Tag bereiten Sie Folgendes: 5 M NaCl (frisch/Nuklease-frei), Chloroform: Isoamyl Alkohol in 24:1-Verhältnis (z.B.pro Reaktion - 96 µL Chloroform und 4 µL Isoamyl Alkohol), eiskalte 100 % Ethanol und eiskalte 70 % Ethanol.</li>
	<li>Die RNA-Kennzeichnung Reaktionsgefäßen 70 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen. Hinzufügen von 100 µL Chloroform: Isoamyl Alkohol und Vortex kurz. Spin-Down bei 13.000 x g für 3 min. vorsichtig entfernen, nur die obere Phase und Übertragung auf eine neue Nuklease-freie 1,5 mL Tube; berühren Sie die untere Phase.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL 5 M NaCl, 1 µL von Glykogen und 300 µL eiskalte 100 % Ethanol. Platzieren Sie das Rohr bei-20 ° C für 2 h. Hinweis: Bei diesem Schritt kann das Experiment am nächsten Tag fortgesetzt werden.</li>
	<li>Zentrifuge auf 13.000 x g und 4 ° C für 15 min. sorgfältig entsorgen den überstand ohne zu stören das Pellet. 300 µL der eiskalte 70 % Ethanol und Zentrifuge wieder bei 13.000 x g und 4 ° C für 5 min hinzufügen.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand vollständig zu und trocknen Sie das Pellet (15 min). Das Pellet in 20 µL Nuklease-freies Wasser aufschwemmen. Hinweis: Fahren Sie fort mit RNA-Pulldown am selben Tag.</li>
	<li>Inkubieren Sie die RNA bei 90 ° C für 2 min und auf Eis. Legen Sie die gekennzeichnet-RNA auf Eis im folgenden Schritt der Vorreinigung der Streptavidin magnetische Beads. Hinweis: Eine längere Inkubationszeit kann die RNA-Sonde beschädigen.</li>
</ol>(3) RNS-Protein-Pulldown
<ol><li>
Vorwäsche Streptavidin-magnetische Beads und Inkubation mit Desthiobiotin-RNA
	<ol>
<li>Verwenden Sie 50 µL Streptavidin magnetische Beads pro 50 Pmol RNA. Jedoch sollte dies je nach Experiment optimiert werden.</li>
		<li>Wirbel der Röhre mit Streptavidin-magnetische Beads für 15 s und schnell entfernen 200 µL (master-Mix; genug für 3 + 1 Reaktionen) in eine saubere 1,5 mL Safe-Lock-Rohr mit Schneiden Pipettenspitzen. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ, so dass die Perlen sammeln sich an der Seite des Rohres und 1 min. entfernen die Wiederfreisetzung Flüssigkeit warten.</li>
		<li>Um die Perlen zu waschen, entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ, fügen Sie 400 µL 0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl-Lösung und sanft pipettieren nach oben und unten mehrmals hinzu. Setzen Sie den Schlauch wieder auf die Magnetstativ. Warten Sie 1 Minute und sammeln Sie den überstand zu. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen mit 200 µL 100 mm NaCl. Den überstand zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL 20 mm Tris (pH 7,5), Aufschwemmen Perlen durch pipettieren, setzen das Rohr auf die magnetische Halterung, 1 min warten und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie den Schritt.</li>
		<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ, fügen Sie 200 µL 1 x RNA Sammlungspuffer und Aufschwemmen Sie Streptavidin magnetische Beads von kurz aufschütteln. Entfernen Sie 50 µL Streptavidin magnetische Beads zu und fügen Sie jedes beschriftet-RNA-Rohr mit einem Schnitt PIPETTENSPITZE hinzu. Inkubieren Sie die Rohre für 30 min bei Raumtemperatur auf einer Walze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bindung von RNA-protein
	<ol>
<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und entfernen Sie den überstand zu.</li>
		<li>Die Perlen 50 µL 20 mm Tris (pH 7,5) hinzu und erneut durch pipettieren. Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und entfernen Sie überstand zu. Wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
		<li>Die Perlen 100 µL 1 x Protein-RNA-bindende-Puffer hinzu und Aufschwemmen durch pipettieren.</li>
		<li>In der Zwischenzeit bereiten die folgende Mischung: 10 µL 10 x Protein-RNA-bindende-Puffer, 30 µL 50 % Glycerin, 50 µg von zytoplasmatischen Proteinen und Nuklease-freie Wasser bis zu 100 µL. Hinweis: Bereiten Sie master-Mix B für 3 Proben im Übermaß (3.3) wie folgt: 33 µL 10 x Protein-RNA-bindende-Puffer, 99 µL 50 % Glycerin, 165 µg von zytoplasmatischen Proteinen und Nuklease-freies Wasser bis zu 330 µL. halten Sie das Rohr des master-Mix B auf Eis.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre in Magnetstativ, warten Sie 1 min und sammeln Sie den überstand zu. 100 µL der master-Mix B hinzufügen, Aufschwemmen von sanft auf und ab pipettieren und Luftblasen vermeiden. Inkubieren Sie Reaktionsgefäße für 60 min bei 4 ° C auf einer Walze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waschen und elution
	<ol>
<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, sammeln des Überstands (die Durchströmung - FT) und in einen neuen Schlauch übertragen. Hinweis: Bewahren Sie diese FT auf Eis für die spätere Analyse.</li>
		<li>Pipette 100 µL 1 x Waschpuffer auf die Perlen, Aufschwemmen sanft, setzen Sie wieder in die Magnetstativ, 1 min warten und den überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal.</li>
		<li>Magnetische Beads 40 µL Elution Buffer hinzu, mischen Sie, indem Sie pipettieren rauf und runter, und bei 37 ° C auf ein Rohr Shaker (950 u/min) für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und sammeln Sie eluierten Probe (das Eluat - E). Auf Eis legen und für nachgelagerte Analyse verwenden. Hinweis: Bei diesem Schritt besteht jede getestete RNA-Sonde aus einem Durchflussverfahren (FT) und Eluat (E) Probe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Polyacrylamid-Elektrophorese und Western Blot Analyse
Hinweis: Siehe Tabelle 2 nach Rezepten für die in diesem Abschnitt verwendeten Puffer. Führen Sie einen Western Blot nach Laemmli Methode12.
<ol><li>Handcast 12 % SDS-PAGE Gelen (10-Brunnen, 1,5 mm Spacer, 66 µL). Bereiten Sie eine laufende Gel-Mischung: 4 mL 30 % Acrylamid-Bisacrylamide Stammlösung 2,4 mL niedriger Tris-Puffer, 3,2 mL dH2O, 9,6 µL TEMED, 96 µL 10 % Ammonium-bleichen-Lösung (APS). Bereiten Sie stapeln Gel Mischung: 3,25 mL dH2O, 0,5 mL 30 % Acrylamid - Stammlösung Bisacrylamide, 1,3 mL oberen Tris-Puffer, 10 µL TEMED, 20 µL 10 % APS.</li>
	<li>Hinzufügen von 16,6 µL 6 X Laemmli-Puffer (z.B. 14 mL Tris/HCl/SDS pH 6,8 (obere Tris-Puffer), 2 g SDS, 1,86 g von DVB-t, 6 mL Glycerin und 0,012 % Bromophenol blue; bei-20 ° C gelagert) in der FT-Probe und 6,6 µL 6 X Laemmli Puffer in E Probe. Inkubieren Sie Beispiele für 5 min bei 95 ° c</li>
	<li>Laden Sie die Proben (20 µL FT und ganze eluieren ~ 40 µL) und für 30 min bei 60 V, mit 20 V über Nacht weiter laufen.</li>
	<li>Mit einem semi-dry Elektroblotting-System übertragen Sie Proteine auf einer PVDF-Membran für 80 min bei 15 V. Anmerkung: Die PVDF-Membran muss aktiviert werden, bevor Sie Protein Transfer durchführen. Inkubieren Sie die Membran in 100 % Methanol für 1 min, gefolgt von einer 2 min Inkubation in Reinstwasser.</li>
	<li>Nach dem Transfer Protein inkubieren der SDS-PAGE-Gel mit Coomassie-Lösung für 3 h, gefolgt von drei Stufen der Reinigung mit Reinstwasser, jeweils 30 Minuten.</li>
	<li>Am Ende des Protein-Transfer lassen Sie die PVDF-Membran trocknen für 1 h. reaktivieren die Membran wie in Schritt 4.5 angegeben. Blockieren Sie die Membran 1 h mit 5 % BSA in 1 X TTBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit dem ersten Antikörper: HuR oder Mesothelin, beides verdünnt 1: 1000 in 5 % BSA in 1 X TTBS für 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran dreimal für 7 min in 1 X TTBS und inkubieren Sie mit Kaninchen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper verdünnt 1: 10.000 in 5 % BSA, 1 X TTBS.</li>
	<li>Proteine mit verstärkte Chemilumineszenz und digital Imager zu visualisieren.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

3' wo gehören die nicht-kodierenden Genom3, und alle nicht-kodierende RNAs können mit Proteinen interagieren, um ihre Funktion7ausüben. Wenn das Säugetier-Genom wurde festgestellt, dass durchdringend transkribiert werden und einen Großteil der lange Forensisches RNAs16 produziert, neue Beweise gezeigt, dass diese lange Forensisches RNAs in der Genexpression regulieren, wie sie interagieren funktionieren Chromatin-Umbau komplexe...

Genexpression und die letzte Stufe des genprodukts können streng reguliert werden, durch Einwirkung auf die Stabilität der mRNA und mRNA Übersetzung Satz1. Diese Posttranskriptionale Regulationsmechanismen sind durch die Wechselwirkungen von nicht-kodierende RNA und/oder RNA-bindende Proteine (RBPs) mit gezielten mRNA ausgeübt. Es ist in der Regel 3' untranslatierten Region der mRNA (3' UTR - gehören zu den nicht-kodierenden Teil des Genoms2), die spezifische Cisenthält-regulatorischen Elementen (CRE), die von Transerkannt werden-wirkenden Faktoren wie MiRNA oder RBPs 3. der am besten untersuchten Cis-Element innerhalb der 3' UTR, ist die Adenin-HTML-Elements (sind)-Motiv, das durch spezifische AU-bindende Proteine (AUBP), und dies wiederum erkannt wird, induziert entweder mRNA Abbau/Deadenylation (sind vermittelte Zerfall) oder mRNA-Stabilisierung-4.
Die Größe der 3' UTR von Calretinin ist mRNA (CALB2) 573 bp lang und enthält eine vermeintliche AUUUA-pentamère wie von AREsite2, einem Bioinformatic Hilfsmittel5vorhergesagt. In Übereinstimmung mit der Anwesenheit eines vermeintlichen sind Motivs, Rolle unter Beweis gestellt PmirGLO Vektor-Reporter Assay eine Stabilisierung dieses Elements innerhalb CALB2 mRNA-6. Zu guter Letzt die in Vitro RNA-Pulldown wurde verwendet, um die AUBP zu identifizieren, die Calretinin stabilisiert mRNA durch das Motiv sind.
Da alle nicht-kodierende RNAs mit Proteinen7interagieren, ist der in-vitro- RNA-Pulldown ein guter Weg und erste Wahl-Test zur Identifizierung von RNA-Interaktoren zur Unterstützung bei der Entschlüsselung der molekularer Mechanismen. Bei diesem RNA-Pulldown-Verfahren wurden kommerziell synthetisierte RNA-Sonden, die mit einer veränderten Form von Biotin (Desthiobiotin) an das 3' Ende der RNA-Strang gekennzeichnet wurden, verwendet. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der gebundenen RNA von Interesse interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Diese RNA-gebundene Proteine sind von der magnetischen Beads, durchlaufen eine 12 % SDS-PAGE Gel auf eine Membran übertragen und sondiert mit verschiedenen Antikörpern eluiert.
In der standard Streptavidin-Biotin-Affinität Reinigungsprozedur, rauen Denaturierung, die Voraussetzungen erforderlich sind, um die starke irreversible Biotin-Streptavidin-Anleihe um die gebundenen Proteine8eluieren stören die zur Dissoziation von führen könnten Proteinkomplexe. Im Gegensatz zu Biotin Desthiobiotin reversibel bindet an Streptavidin und wird mit einer gepufferten Lösung von Biotin, zulassend die sanfte Elution von Proteinen und die Vermeidung von der Isolation natürlich biotinylierte Moleküle9kompetitiv verdrängt, was darauf hindeutet, dass die Technik ideal für systemeigene Proteinkomplexen unter heimischen Bedingungen zu isolieren.
In-vitro- verbindliche Auflagen und Stringenz, die Salzkonzentration, Reduktionsmittel und Waschmittel Prozentsatz ermittelt werden, sollte in der Nähe von den anwesenden im Zusammenhang mit zellulären, um wahre in Vivo Interaktionen zu identifizieren. Die verbindlichen Bedingungen hierin umgesetzt wurden zuvor als angemessen für die Identifizierung der HuR als eine AU-bindende Protein10nachgewiesen. Dieser Ansatz könnte Zeit zu sparen, da die Optimierung der richtige Bindung Bedingungen zeitaufwändig und anspruchsvoll sein kann. Darüber hinaus ist diese Methode könnte als Ausgangspunkt Protokoll für jedes Experiment RNA-Pulldown verwendet werden und kann durch Veränderung der Konzentration von Salzen und Reinigungsmittel, Ändern des Glycerin-Anteils und andere Salze schrittweise optimiert werden. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass sogar eine kurze 25-Nukleotid RNA-Sonde beherbergen ein pentamère sind-Motiv verwendet werden, um Interaktion mit einer spezifischen AUBP zu demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pierce RNA 3&amp;rsquo; End Desthiobiotinylation Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>The kit is a part of the &quot;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&quot;, and needs to be stored at -20 &amp;deg;C unlike the pull-down kit (4 &amp;deg;C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&amp;nbsp; magnetic stand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&amp;nbsp; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &amp;alpha; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9542</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&amp;nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Secondary goat anti-rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Secondary rabbit anti-mouse antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Filtrated Bovine Serum</td><td>Pan Biotech&amp;nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin - streptomycin (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life technologies&amp;nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean System Glass Plates&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &amp;micro;L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&amp;nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&amp;nbsp; Digital Imager</td><td>Vilber</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>RNA oligo synthesis</td><td>Mycrosynth AG, Switzerland</td><td>-</td><td>the synthesis scale - 0.04 &amp;micro;mol - HPLC purified</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50% sterile aliquots to be stored at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin magnetic beads&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &amp;micro;m (range from 0.5 - 1.5 &amp;micro;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &amp;micro;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>ortho-phosphoric acid&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

Die in-vitro- RNA-Pulldown wird noch weitgehend verwendet in den ersten Schritten der Protokolle, die auf die Identifizierung von RNA-bindende Proteine, die spezifisch RNA-Strukturen und Motive zu erkennen. In diesem Protokoll RNA-Pulldown kommerziell synthetisierte RNA-Sonden sind beschriftet mit einer modifizierten Form von Biotin, Desthiobiotin, an das 3' Ende der RNA-Strang, die reversibel bindet an Streptavidin und ermöglicht somit Elution von Proteinen unter mehr physiologische Bedingungen. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der RNA des Interesses interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Die hier beschriebene Methode kann angewendet werden, um die Interaktion zwischen bekannten RNA-bindende Proteine und eine 25-Nukleotid (nt) lange RNA-Sonde mit einer Sequenz von Interesse zu erkennen. Dies ist nützlich, um die funktionelle Charakterisierung der stabilisieren oder destabilisieren Elementen in RNA-Moleküle mit einem Reporter-Vektor-Assay erreicht abzuschließen.

In diesem Experiment wurde ein 25-nt lange Fragment des Calretinin 3' UTR beherbergen sind Motiv (CALB2 3' UTR (sind) 25-nt) verwendet, zu testen, ob es speziell für das Human-Antigen R (HuR) Protein, einem bekannten mRNA-Stabilisator bindet. Um zu testen, die Spezifität des Elements sind, eine 25-nt-RNA wurde Sonde CALB2 3' UTR (MtARE), enthält eine sind-Motiv-Mutation, die bisher gezeigt wurde, um den Stabilisierungseffekt des Motivs sind abzuschaffen, gebrauchte6</...

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Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

Desthiobiotin Kennzeichnung von einer synthetischen 25-Nukleotid RNA Oligo, enthält ein Motiv Adenin-HTML-Elements (sind), kann spezifische Bindung der cytosolischen sind-bindendes Protein.

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.9K Aufrufe.  University Hospital Zurich. Desthiobiotin Kennzeichnung von einer synthetischen 25-Nukleotid RNA Oligo, enthält ein Motiv Adenin-HTML-Elements (sind), kann spezifische Bindung der cytosolischen sind-bindendes Protein.

Serie: Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Forschung

Genetik

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Biochemie

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate regulation of these processes. A strategy called CLIP-seq (cross-linking and immunoprecipitation) has been developed to capture endogenous protein-RNA interactions with UV cross-linking followed by immunoprecipitation. Despite the wide use of conventional CLIP-seq method in RBP study, the CLIP method is limited by the availability of high-quality antibodies, potential contaminants from the copurified RBPs, requirement of isotope manipulation, and potential loss of information during a tedious experimental procedure. Here we describe a modified CLIP-seq method called FbioCLIP-seq using the FLAG-biotin tag tandem purification. Through tandem purification and stringent wash conditions, almost all the interacting RNA-binding proteins are removed. Thus, the RNAs interacting indirectly mediated by these copurified RBPs are also reduced. Our FbioCLIP-seq method allows efficient detection of direct protein-bound RNAs without SDS-PAGE and membrane transfer procedures in an isotope-free and protein-specific antibody-free manner.

Here we present a modified CLIP-seq protocol called FbioCLIP-seq with FLAG-biotin tandem purification to determine the RNA targets of RNA-binding proteins (RBPs) in mammalian cells.

Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of the role of the tumor microenvironment in treatment response, collectively point to the need for immune-competent orthotopic models for pre-clinical testing of these new therapies. This paper demonstrates how to establish an orthotopic immune-competent rat model of pleural malignant mesothelioma. Monitoring disease progression in orthotopic models is confounded by the internal location of the tumors. To longitudinally monitor disease progression and its effect on circulating immune cells in this and other rat models of cancer, a single tube flow cytometry assay requiring only 25 &#181;l whole blood is described. This provides accurate quantification of seven immune parameters: total lymphocytes, monocytes and neutrophils, as well as the T-cell subsets CD4 and CD8, B-cells and Natural Killer cells. Different subsets of these parameters are useful in different circumstances and models, with the neutrophil to lymphocyte ratio having the greatest utility for monitoring disease progression in the mesothelioma model. Analyzing circulating immune cell levels using this single tube method may also assist in monitoring the response to immune-based treatments and understanding the underlying mechanisms leading to success or failure of treatment.

The generation of an orthotopic rat model of pleural malignant mesothelioma by implantation of II-45 mesothelioma cells into the pleural cavity of immune competent rats is presented. A flow cytometric method to analyze seven immune cell subsets in these animals from a 25 &#181;l&#160;blood sample is also described.

Orthotopen Implantation und der peripheren Immunzellenüberwachung in der II-45 Syngene Rat Mesotheliom Modell

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

Medizin

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis by antibiotics and during nascent polypeptide synthesis. Some of these antibiotics, and regulatory nascent polypeptides mostly in the form of peptidyl-tRNAs, inhibit either peptide bond formation or translation termination1-7. These inhibitory events can stop the movement of the ribosome, a phenomenon termed "translational arrest". Translation arrest induced by either an antibiotic or a nascent polypeptide has been shown to regulate the expression of genes involved in diverse cellular functions such as cell growth, antibiotic resistance, protein translocation and cell metabolism8-13. Knowledge of how antibiotics and regulatory nascent polypeptides alter ribosome function is essential if we are to understand the complete role of the ribosome in translation, in every organism.
Here, we describe a simple methodology that can be used to purify, exclusively, for analysis, those ribosomes translating a specific mRNA and containing a specific peptidyl-tRNA14. This procedure is based on selective isolation of translating ribosomes bound to a biotin-labeled mRNA. These translational complexes are separated from other ribosomes in the same mixture, using streptavidin paramagnetic beads (SMB) and a magnetic field (MF). Biotin-labeled mRNAs are synthesized by run-off transcription assays using as templates PCR-generated DNA fragments that contain T7 transcriptional promoters. T7 RNA polymerase incorporates biotin-16-UMP from biotin-UTP; under our conditions approximately ten biotin-16-UMP molecules are incorporated in a 600 nt mRNA with a 25% UMP content. These biotin-labeled mRNAs are then isolated, and used in in vitro translation assays performed with release factor 2 (RF2)-depleted cell-free extracts obtained from Escherichia coli strains containing wild type or mutant ribosomes. Ribosomes translating the biotin-labeled mRNA sequences are stalled at the stop codon region, due to the absence of the RF2 protein, which normally accomplishes translation termination. Stalled ribosomes containing the newly synthesized peptidyl-tRNA are isolated and removed from the translation reactions using SMB and an MF. These beads only bind biotin-containing messages.
The isolated, translational complexes, can be used to analyze the structural and functional features of wild type or mutant ribosomal components, or peptidyl-tRNA sequences, as well as determining ribosome interaction with antibiotics or other molecular factors 1,14-16. To examine the function of these isolated ribosome complexes, peptidyl-transferase assays can be performed in the presence of the antibiotic puromycin1. To study structural changes in translational complexes, well established procedures can be used, such as i) crosslinking to specific amino acids14 and/or ii) alkylation protection assays1,14,17.

A major impediment to biochemical analyses of ribosomes containing nascent peptidyl-tRNAs has been the presence of other ribosomes in the same samples, ribosomes not involved in the translation of the specific mRNA sequence being analyzed. We developed a simple methodology to purify, exclusively, the ribosomes containing the nascent peptidyl-tRNA of interest.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Quantitative Analyse der RPA-ssDNA-Bindungskinetik mit markierungsfreien Methoden

Analyzing DNA-Protein Interactions with Streptavidin-Based Biolayer Interferometry

Protein-DNA interactions underpin essential cellular processes. Understanding these interactions is critical for elucidating the molecular mechanisms of various pathways. Key factors such as the structure, sequence, and length of a DNA molecule can significantly influence protein binding. Bio-layer interferometry (BLI) is a label-free technique that measures binding kinetics between molecules, offering a straightforward and precise approach to quantitatively study protein-DNA interactions. A major advantage of BLI over traditional gel-based methods is its ability to provide real-time data on binding kinetics, enabling accurate measurement of the equilibrium dissociation constant (KD) for dynamic protein-DNA interactions. This article presents a basic protocol for determining the KD value of the interaction between a DNA replication protein, replication protein A (RPA), and a single-stranded DNA (ssDNA) substrate. RPA binds ssDNA with high affinity but must also be easily displaced to facilitate subsequent protein interactions within biological pathways. In the described BLI assay, biotinylated ssDNA is immobilized on a streptavidin-coated biosensor. The binding kinetics (association and dissociation) of RPA to the biosensor-bound DNA are then measured. The resulting data are analyzed to derive precise values for the association rate constant (ka), dissociation rate constant (kd), and equilibrium binding constant (KD) using system software.

<meta charset="utf8"></head><body>Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

This article describes a protocol for studying DNA-protein interactions using a streptavidin-based biolayer interferometry (BLI) system. It outlines the essential steps and considerations for utilizing either basic or advanced binding kinetics to determine the equilibrium binding affinity (KD) of the interaction.

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Protein-DNA interactions underpin essential cellular processes. Understanding these interactions is critical for elucidating the molecular mechanisms of ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

Zusammenfassung

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Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Orthotopen Implantation und der peripheren Immunzellenüberwachung in der II-45 Syngene Rat Mesotheliom Modell

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

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Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Orthotopen Implantation und der peripheren Immunzellenüberwachung in der II-45 Syngene Rat Mesotheliom Modell

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik