Diese Arbeit wurde von der Swiss National Science Foundation Sinergia Grant CRSII3 147697, die Stiftung Für Angewandte Krebsforschung und Zürich Krebsliga unterstützt.

1. Vorbereitung der cytosolischen und nukleare Proteinfraktion
<ol><li>Platte 4 x 106 ACC-MESO-4 Zellen in einem T150 Zelle Kultur Kolben angebaut in RPMI - 1640 Medium mit 10 % FBS, 1 X Penicillin/Streptomycin (100 X) und 2 mM L-Glutamin (200 mM) ergänzt. Wenn Zellen einen Zusammenfluss von 80-90 % (~5-5.5 X 106 Zellen) erreicht haben, fahren Sie mit Proteingewinnung von Kernenergie und cytosolische Fraktion. Hinweis: ACC-MESO-4-Zell-Linie wurde aus dem RIKEN BioResource Zentrum11erhalten.</li>
	<li>Aspirieren Medium, Waschen der Zellen durch Zugabe von 15 mL 1 X PBS, kippen Sie die Platte vorsichtig ein paar Mal und 1 X PBS Aspirieren. Geben Sie 3 mL von 0,25 % Trypsin-EDTA und den Kultur-Kolben bei 37 ° C für 3 min inkubieren. Hinweis: Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop für Ablösung; Wenn noch Wasserhahn angebracht Mal der Kolben gegen die Handfläche einer Hand 3.</li>
	<li>7 mL RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10 % FBS, 1 X Penicillin/Streptomycin (100 X) und 2 mM L-Glutamin (200 mM) hinzufügen, sammeln die Zellen in einer 15 mL Tube und spin-down bei 200 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medium und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet mit 1,5 mL 1 X PBS, dann übertragen Sie die Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Spin-down bei 500 X g und 4 ° C für 5 min. überstand verwerfen. Hinweis: Von diesem Schritt ab, führen Sie alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C und halten Sie alle Reagenzien auf Eis.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet mit eiskalten 1,5 mL 1 X PBS und Spin-down der Zellen bei 500 X g und 4 ° C für 3 min. Überstands verwerfen. Hinweis: Die benötigten Mengen an CER sind I, CER II und NER Reagenzien 10, 0,55 und 5 Bände geschätzten Zelle Pellet-Volumen, bzw. verpackt; Das folgende Protokoll nimmt ein Volumen von 20 µL. Wir empfehlen nur die erforderliche Menge an Reagenz CER Vorbereitung ich.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL des eiskalten zytoplasmatischen Extraktion Reagenz (CER ich) ergänzt mit 2 µL 1 x Proteinase Inhibitor, z.B., verdünnen Sie 1 Tablette der Protease-Inhibitor (EDTA-frei) in 500 µL Wasser, 100 X Lager zu erhalten. Diese Menge Reagens CER ich reicht, 20 µL eines Pellet-Zelle Volumen verpackt zu lösen.<ol>
<li>Um das Zellvolumen Pellets verpackt abschätzen zu können, vergleichen Sie die Röhrchen mit der Zelle-Pellet mit einem 1,5 mL Schlauch gefüllt mit 10, 20, 50 oder 100 µL 1 X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet durch kräftig aufschütteln der Röhre für 15 s und inkubieren Sie das Rohr auf dem Eis für 10 min. hinzufügen 11 µL eiskalte zytoplasmatischen Extraktion Reagenz II (CER II) am Rohr energisch Wirbel für 5 s, und inkubieren Sie 1 min auf Eis.</li>
	<li>Vortex energisch für 5 s und Zentrifuge das Rohr auf 16.000 x g und 4 ° C für 5 min. übertragen überstand auf sauberes vorgekühlt Röhrchen auf dem Eis. Der Überstand wird der zytoplasmatischen Bruch, die weiter in der RNA-Pulldown-Experiment verwendet.</li>
	<li>Aufschwemmen der restlichen Pellets in 100 µL der eiskalte nuklearen Extraktion Reagenz (NER) ergänzt mit 1 µL Proteinase Inhibitor (100 X) und kräftig Vortexen 15 s. Es wird empfohlen, nur die erforderliche Menge an NER Reagenz ergänzt mit Protease-Inhibitoren vorbereiten.</li>
	<li>Inkubation die Probe auf dem Eis für 40 min mit gelegentlichen Vortexen für 15 s (alle 10 min).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 16.000 x g für 10 min. Transfer des Überstands (Dies ist die nukleare Proteinfraktion) in ein sauberes Röhrchen vorgekühlt.</li>
	<li>Unverzüglich durch die Messung der Konzentration des Proteins mit der Methode Bicinchoninic (BCA) (siehe Tabelle der Materialien). Um Protein Reinheit der einzelnen Fraktionen zu kontrollieren, führen Sie Immunoblotting (Abbildung 1) gegen α-Tubulin (positive Erkennung nur in die cytosolische Fraktion) und Poly-ADP-Ribose-Polymerase - PARP (positive Erkennung nur im nuklearen Bruch). Protein-Visualisierung finden Sie in Abschnitt 4.</li>
	<li>Um die proteinaktivität und ihrem nativen Zustand zu halten, bereiten Sie 25 µL Aliquots der cytosolischen und nukleare Extrakte. Snap-Freeze dieser Aliquote indem man sie in flüssigem Stickstoff für 5 s und Store direkt bei-80 ° C.</li>
</ol>2. Kennzeichnung der RNA mit Desthiobiotin
<ol><li>RNA-Sonden kommerziell synthetisiert und HPLC gereinigt. Aufschwemmen Sie mit Nuklease-freies Wasser bei 10 µM. Hinweis: Sonde Sequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
	<li>Verwenden Sie 50 Pmol RNA pro RNA-Pulldown Reaktion. Tauen Sie auf und halten Sie alle Reagenzien auf Eis, außer für 30 %, zum Label 3' Endstation der RNA Oligo PEG.</li>
	<li>5 µL 10 µM RNA-Sonden, gekennzeichnet als CALB2 3' UTR (sind) zu übertragen, CALB2 3' UTR (MtARE) und unabhängige-RNA (IRE), in 0,5 mL dünnwandige Microcentrifuge Rohre und brüten in einer PCR-Maschine bei 85 ° C für 5 min. legen die Rohre sofort auf Eis. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, da sie die Entspannung und die Zugänglichkeit der RNA-Sonde für die Beschriftung fördert.</li>
	<li>Für einen einzigen 30 µL Reaktion hinzufügen das RNA-haltigen Rohr den folgenden 10 µL-Mix: 3 µL Nuklease freies Wasser, 3 µL 10 x RNA Ligase Reaktion Puffer, 1 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL) 1 µL Desthiobiotinylated Cytidin Bisphosphate (1 mM) , und 2 µL T4 RNA Ligase (20 U/µL). Hinweis: Um master-Mix A 3 Proben im Übermaß (3.2) vorzubereiten, 9,6 µL Nuklease kostenloses Wasser mischen, 9,6 µL 10 x RNA Ligase Reaktion Puffer, 3,2 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL), 3,2 µL Desthiobiotinylated Cytidin Bisphosphate (1 mM) und 6,4 µL T4 RNA Ligase (20 U/µL).</li>
	<li>Fügen Sie sorgfältig 15 µL PEG 30 % auf die Reaktion. Verwenden Sie ein weiterer Tipp, um die Reaktion zu mischen. Die Reaktion über Nacht bei 16 ° c inkubieren</li>
	<li>Am nächsten Tag bereiten Sie Folgendes: 5 M NaCl (frisch/Nuklease-frei), Chloroform: Isoamyl Alkohol in 24:1-Verhältnis (z.B.pro Reaktion - 96 µL Chloroform und 4 µL Isoamyl Alkohol), eiskalte 100 % Ethanol und eiskalte 70 % Ethanol.</li>
	<li>Die RNA-Kennzeichnung Reaktionsgefäßen 70 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen. Hinzufügen von 100 µL Chloroform: Isoamyl Alkohol und Vortex kurz. Spin-Down bei 13.000 x g für 3 min. vorsichtig entfernen, nur die obere Phase und Übertragung auf eine neue Nuklease-freie 1,5 mL Tube; berühren Sie die untere Phase.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL 5 M NaCl, 1 µL von Glykogen und 300 µL eiskalte 100 % Ethanol. Platzieren Sie das Rohr bei-20 ° C für 2 h. Hinweis: Bei diesem Schritt kann das Experiment am nächsten Tag fortgesetzt werden.</li>
	<li>Zentrifuge auf 13.000 x g und 4 ° C für 15 min. sorgfältig entsorgen den überstand ohne zu stören das Pellet. 300 µL der eiskalte 70 % Ethanol und Zentrifuge wieder bei 13.000 x g und 4 ° C für 5 min hinzufügen.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand vollständig zu und trocknen Sie das Pellet (15 min). Das Pellet in 20 µL Nuklease-freies Wasser aufschwemmen. Hinweis: Fahren Sie fort mit RNA-Pulldown am selben Tag.</li>
	<li>Inkubieren Sie die RNA bei 90 ° C für 2 min und auf Eis. Legen Sie die gekennzeichnet-RNA auf Eis im folgenden Schritt der Vorreinigung der Streptavidin magnetische Beads. Hinweis: Eine längere Inkubationszeit kann die RNA-Sonde beschädigen.</li>
</ol>(3) RNS-Protein-Pulldown
<ol><li>
Vorwäsche Streptavidin-magnetische Beads und Inkubation mit Desthiobiotin-RNA
	<ol>
<li>Verwenden Sie 50 µL Streptavidin magnetische Beads pro 50 Pmol RNA. Jedoch sollte dies je nach Experiment optimiert werden.</li>
		<li>Wirbel der Röhre mit Streptavidin-magnetische Beads für 15 s und schnell entfernen 200 µL (master-Mix; genug für 3 + 1 Reaktionen) in eine saubere 1,5 mL Safe-Lock-Rohr mit Schneiden Pipettenspitzen. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ, so dass die Perlen sammeln sich an der Seite des Rohres und 1 min. entfernen die Wiederfreisetzung Flüssigkeit warten.</li>
		<li>Um die Perlen zu waschen, entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ, fügen Sie 400 µL 0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl-Lösung und sanft pipettieren nach oben und unten mehrmals hinzu. Setzen Sie den Schlauch wieder auf die Magnetstativ. Warten Sie 1 Minute und sammeln Sie den überstand zu. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen mit 200 µL 100 mm NaCl. Den überstand zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL 20 mm Tris (pH 7,5), Aufschwemmen Perlen durch pipettieren, setzen das Rohr auf die magnetische Halterung, 1 min warten und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie den Schritt.</li>
		<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ, fügen Sie 200 µL 1 x RNA Sammlungspuffer und Aufschwemmen Sie Streptavidin magnetische Beads von kurz aufschütteln. Entfernen Sie 50 µL Streptavidin magnetische Beads zu und fügen Sie jedes beschriftet-RNA-Rohr mit einem Schnitt PIPETTENSPITZE hinzu. Inkubieren Sie die Rohre für 30 min bei Raumtemperatur auf einer Walze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bindung von RNA-protein
	<ol>
<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und entfernen Sie den überstand zu.</li>
		<li>Die Perlen 50 µL 20 mm Tris (pH 7,5) hinzu und erneut durch pipettieren. Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und entfernen Sie überstand zu. Wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
		<li>Die Perlen 100 µL 1 x Protein-RNA-bindende-Puffer hinzu und Aufschwemmen durch pipettieren.</li>
		<li>In der Zwischenzeit bereiten die folgende Mischung: 10 µL 10 x Protein-RNA-bindende-Puffer, 30 µL 50 % Glycerin, 50 µg von zytoplasmatischen Proteinen und Nuklease-freie Wasser bis zu 100 µL. Hinweis: Bereiten Sie master-Mix B für 3 Proben im Übermaß (3.3) wie folgt: 33 µL 10 x Protein-RNA-bindende-Puffer, 99 µL 50 % Glycerin, 165 µg von zytoplasmatischen Proteinen und Nuklease-freies Wasser bis zu 330 µL. halten Sie das Rohr des master-Mix B auf Eis.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre in Magnetstativ, warten Sie 1 min und sammeln Sie den überstand zu. 100 µL der master-Mix B hinzufügen, Aufschwemmen von sanft auf und ab pipettieren und Luftblasen vermeiden. Inkubieren Sie Reaktionsgefäße für 60 min bei 4 ° C auf einer Walze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waschen und elution
	<ol>
<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, sammeln des Überstands (die Durchströmung - FT) und in einen neuen Schlauch übertragen. Hinweis: Bewahren Sie diese FT auf Eis für die spätere Analyse.</li>
		<li>Pipette 100 µL 1 x Waschpuffer auf die Perlen, Aufschwemmen sanft, setzen Sie wieder in die Magnetstativ, 1 min warten und den überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal.</li>
		<li>Magnetische Beads 40 µL Elution Buffer hinzu, mischen Sie, indem Sie pipettieren rauf und runter, und bei 37 ° C auf ein Rohr Shaker (950 u/min) für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und sammeln Sie eluierten Probe (das Eluat - E). Auf Eis legen und für nachgelagerte Analyse verwenden. Hinweis: Bei diesem Schritt besteht jede getestete RNA-Sonde aus einem Durchflussverfahren (FT) und Eluat (E) Probe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Polyacrylamid-Elektrophorese und Western Blot Analyse
Hinweis: Siehe Tabelle 2 nach Rezepten für die in diesem Abschnitt verwendeten Puffer. Führen Sie einen Western Blot nach Laemmli Methode12.
<ol><li>Handcast 12 % SDS-PAGE Gelen (10-Brunnen, 1,5 mm Spacer, 66 µL). Bereiten Sie eine laufende Gel-Mischung: 4 mL 30 % Acrylamid-Bisacrylamide Stammlösung 2,4 mL niedriger Tris-Puffer, 3,2 mL dH2O, 9,6 µL TEMED, 96 µL 10 % Ammonium-bleichen-Lösung (APS). Bereiten Sie stapeln Gel Mischung: 3,25 mL dH2O, 0,5 mL 30 % Acrylamid - Stammlösung Bisacrylamide, 1,3 mL oberen Tris-Puffer, 10 µL TEMED, 20 µL 10 % APS.</li>
	<li>Hinzufügen von 16,6 µL 6 X Laemmli-Puffer (z.B. 14 mL Tris/HCl/SDS pH 6,8 (obere Tris-Puffer), 2 g SDS, 1,86 g von DVB-t, 6 mL Glycerin und 0,012 % Bromophenol blue; bei-20 ° C gelagert) in der FT-Probe und 6,6 µL 6 X Laemmli Puffer in E Probe. Inkubieren Sie Beispiele für 5 min bei 95 ° c</li>
	<li>Laden Sie die Proben (20 µL FT und ganze eluieren ~ 40 µL) und für 30 min bei 60 V, mit 20 V über Nacht weiter laufen.</li>
	<li>Mit einem semi-dry Elektroblotting-System übertragen Sie Proteine auf einer PVDF-Membran für 80 min bei 15 V. Anmerkung: Die PVDF-Membran muss aktiviert werden, bevor Sie Protein Transfer durchführen. Inkubieren Sie die Membran in 100 % Methanol für 1 min, gefolgt von einer 2 min Inkubation in Reinstwasser.</li>
	<li>Nach dem Transfer Protein inkubieren der SDS-PAGE-Gel mit Coomassie-Lösung für 3 h, gefolgt von drei Stufen der Reinigung mit Reinstwasser, jeweils 30 Minuten.</li>
	<li>Am Ende des Protein-Transfer lassen Sie die PVDF-Membran trocknen für 1 h. reaktivieren die Membran wie in Schritt 4.5 angegeben. Blockieren Sie die Membran 1 h mit 5 % BSA in 1 X TTBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit dem ersten Antikörper: HuR oder Mesothelin, beides verdünnt 1: 1000 in 5 % BSA in 1 X TTBS für 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran dreimal für 7 min in 1 X TTBS und inkubieren Sie mit Kaninchen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper verdünnt 1: 10.000 in 5 % BSA, 1 X TTBS.</li>
	<li>Proteine mit verstärkte Chemilumineszenz und digital Imager zu visualisieren.</li>
</ol>

<ol>
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L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation.">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

3' wo gehören die nicht-kodierenden Genom3, und alle nicht-kodierende RNAs können mit Proteinen interagieren, um ihre Funktion7ausüben. Wenn das Säugetier-Genom wurde festgestellt, dass durchdringend transkribiert werden und einen Großteil der lange Forensisches RNAs16 produziert, neue Beweise gezeigt, dass diese lange Forensisches RNAs in der Genexpression regulieren, wie sie interagieren funktionieren Chromatin-Umbau komplexe...

Genexpression und die letzte Stufe des genprodukts können streng reguliert werden, durch Einwirkung auf die Stabilität der mRNA und mRNA Übersetzung Satz1. Diese Posttranskriptionale Regulationsmechanismen sind durch die Wechselwirkungen von nicht-kodierende RNA und/oder RNA-bindende Proteine (RBPs) mit gezielten mRNA ausgeübt. Es ist in der Regel 3' untranslatierten Region der mRNA (3' UTR - gehören zu den nicht-kodierenden Teil des Genoms2), die spezifische Cisenthält-regulatorischen Elementen (CRE), die von Transerkannt werden-wirkenden Faktoren wie MiRNA oder RBPs 3. der am besten untersuchten Cis-Element innerhalb der 3' UTR, ist die Adenin-HTML-Elements (sind)-Motiv, das durch spezifische AU-bindende Proteine (AUBP), und dies wiederum erkannt wird, induziert entweder mRNA Abbau/Deadenylation (sind vermittelte Zerfall) oder mRNA-Stabilisierung-4.
Die Größe der 3' UTR von Calretinin ist mRNA (CALB2) 573 bp lang und enthält eine vermeintliche AUUUA-pentamère wie von AREsite2, einem Bioinformatic Hilfsmittel5vorhergesagt. In Übereinstimmung mit der Anwesenheit eines vermeintlichen sind Motivs, Rolle unter Beweis gestellt PmirGLO Vektor-Reporter Assay eine Stabilisierung dieses Elements innerhalb CALB2 mRNA-6. Zu guter Letzt die in Vitro RNA-Pulldown wurde verwendet, um die AUBP zu identifizieren, die Calretinin stabilisiert mRNA durch das Motiv sind.
Da alle nicht-kodierende RNAs mit Proteinen7interagieren, ist der in-vitro- RNA-Pulldown ein guter Weg und erste Wahl-Test zur Identifizierung von RNA-Interaktoren zur Unterstützung bei der Entschlüsselung der molekularer Mechanismen. Bei diesem RNA-Pulldown-Verfahren wurden kommerziell synthetisierte RNA-Sonden, die mit einer veränderten Form von Biotin (Desthiobiotin) an das 3' Ende der RNA-Strang gekennzeichnet wurden, verwendet. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der gebundenen RNA von Interesse interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Diese RNA-gebundene Proteine sind von der magnetischen Beads, durchlaufen eine 12 % SDS-PAGE Gel auf eine Membran übertragen und sondiert mit verschiedenen Antikörpern eluiert.
In der standard Streptavidin-Biotin-Affinität Reinigungsprozedur, rauen Denaturierung, die Voraussetzungen erforderlich sind, um die starke irreversible Biotin-Streptavidin-Anleihe um die gebundenen Proteine8eluieren stören die zur Dissoziation von führen könnten Proteinkomplexe. Im Gegensatz zu Biotin Desthiobiotin reversibel bindet an Streptavidin und wird mit einer gepufferten Lösung von Biotin, zulassend die sanfte Elution von Proteinen und die Vermeidung von der Isolation natürlich biotinylierte Moleküle9kompetitiv verdrängt, was darauf hindeutet, dass die Technik ideal für systemeigene Proteinkomplexen unter heimischen Bedingungen zu isolieren.
In-vitro- verbindliche Auflagen und Stringenz, die Salzkonzentration, Reduktionsmittel und Waschmittel Prozentsatz ermittelt werden, sollte in der Nähe von den anwesenden im Zusammenhang mit zellulären, um wahre in Vivo Interaktionen zu identifizieren. Die verbindlichen Bedingungen hierin umgesetzt wurden zuvor als angemessen für die Identifizierung der HuR als eine AU-bindende Protein10nachgewiesen. Dieser Ansatz könnte Zeit zu sparen, da die Optimierung der richtige Bindung Bedingungen zeitaufwändig und anspruchsvoll sein kann. Darüber hinaus ist diese Methode könnte als Ausgangspunkt Protokoll für jedes Experiment RNA-Pulldown verwendet werden und kann durch Veränderung der Konzentration von Salzen und Reinigungsmittel, Ändern des Glycerin-Anteils und andere Salze schrittweise optimiert werden. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass sogar eine kurze 25-Nukleotid RNA-Sonde beherbergen ein pentamère sind-Motiv verwendet werden, um Interaktion mit einer spezifischen AUBP zu demonstrieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:124px;">78833</td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20164</td>
			<td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pierce RNA 3&#8217; End Desthiobiotinylation Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20163</td>
			<td style="width:468px;">The kit is a part of the &#34;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#34;, and needs to be stored at -20 &#176;C unlike the pull-down kit (4 &#176;C).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2,&#160; magnetic stand</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:453px;">Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td style="width:468px;">The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - &#945; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td style="width:124px;">8035</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&#160;</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>200-301-A87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:295px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:124px;">7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary rabbit anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A-9044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RPMI - 1640 medium</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FBS - Filtrated Bovine Serum</td>
			<td style="width:295px;">Pan Biotech&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin - streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">L-Glutamine solution (200 mM)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:295px;">Gibco by Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:124px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN 3 Cell</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini Protean System Glass Plates&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &#181;L</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1658050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:453px;">Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td>
			<td style="width:295px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">3029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">20% SDS&#160;</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td>A3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:124px;">NEF1002</td>
			<td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FusionFX&#160; Digital Imager</td>
			<td style="width:295px;">Vilber</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNA oligo synthesis</td>
			<td style="width:295px;">Mycrosynth AG, Switzerland</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td>the synthesis scale - 0.04 &#181;mol - HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">182883.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Glycerol&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td>50% sterile aliquots to be stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:453px;">Pierce Streptavidin magnetic beads&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">88817</td>
			<td style="width:468px;">Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &#181;m (range from 0.5 - 1.5 &#181;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &#181;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">TEMED</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ammonium persulfate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coomassie G-250</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A3480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">368458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ortho-phosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A0637</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

Die in-vitro- RNA-Pulldown wird noch weitgehend verwendet in den ersten Schritten der Protokolle, die auf die Identifizierung von RNA-bindende Proteine, die spezifisch RNA-Strukturen und Motive zu erkennen. In diesem Protokoll RNA-Pulldown kommerziell synthetisierte RNA-Sonden sind beschriftet mit einer modifizierten Form von Biotin, Desthiobiotin, an das 3' Ende der RNA-Strang, die reversibel bindet an Streptavidin und ermöglicht somit Elution von Proteinen unter mehr physiologische Bedingungen. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der RNA des Interesses interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Die hier beschriebene Methode kann angewendet werden, um die Interaktion zwischen bekannten RNA-bindende Proteine und eine 25-Nukleotid (nt) lange RNA-Sonde mit einer Sequenz von Interesse zu erkennen. Dies ist nützlich, um die funktionelle Charakterisierung der stabilisieren oder destabilisieren Elementen in RNA-Moleküle mit einem Reporter-Vektor-Assay erreicht abzuschließen.

In diesem Experiment wurde ein 25-nt lange Fragment des Calretinin 3' UTR beherbergen sind Motiv (CALB2 3' UTR (sind) 25-nt) verwendet, zu testen, ob es speziell für das Human-Antigen R (HuR) Protein, einem bekannten mRNA-Stabilisator bindet. Um zu testen, die Spezifität des Elements sind, eine 25-nt-RNA wurde Sonde CALB2 3' UTR (MtARE), enthält eine sind-Motiv-Mutation, die bisher gezeigt wurde, um den Stabilisierungseffekt des Motivs sind abzuschaffen, gebrauchte6</...

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Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

Desthiobiotin Kennzeichnung von einer synthetischen 25-Nukleotid RNA Oligo, enthält ein Motiv Adenin-HTML-Elements (sind), kann spezifische Bindung der cytosolischen sind-bindendes Protein.

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.9K Aufrufe.  University Hospital Zurich. Desthiobiotin Kennzeichnung von einer synthetischen 25-Nukleotid RNA Oligo, enthält ein Motiv Adenin-HTML-Elements (sind), kann spezifische Bindung der cytosolischen sind-bindendes Protein.

Serie: Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential anti-cancer drugs. Multicellular tumor spheroids (MCTSes) effectively mimic the physiological conditions of solid tumors, making them excellent in vitro models for lead optimization and target validation. Out of the various techniques available for MCTS culture, the liquid-overlay method on agarose is one of the most inexpensive methods for MCTS generation. However, the reliable transfer of MCTS cultures using liquid-overlay for high-throughput screening may be compromised by a number of limitations, including the coating of microtiter plates (MPs) with agarose and the irreproducibility of uniform MCTS formation across wells. MPs are significantly prone to edge effects that result from excessive evaporation of medium from the exterior of the plate, preventing the use of the entire plate for drug tests. This manuscript provides detailed technical improvements to the liquid-overlay technique to increase the scalability and reproducibility of uniform MCTS formation. Additionally, details on a simple, semi-automatic, and universally applicable software tool for the evaluation of MCTS features after drug treatment is presented.

The uneven loss of medium from microtiter plates affects the reproducibility of uniform multicellular tumor spheroid formation. Improving culture conditions to reduce significant medium loss will improve the reproducibility of spheroid formation and the results of spheroid-based assays using the liquid-overlay technique.

Verdunstungsmindernde Kultur Zustand Erhöht die Reproduzierbarkeit von mehrzelligen Sphäroidformation in Mikrotiterplatten

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Forschung

Krebsforschung

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Invasive Verhalten von menschlichen Brustkrebszellen in embryonalem Zebrabärbling

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

Eine präklinische Mausmodell der Osteosarkom, die extrazelluläre Vesikel-vermittelter Kommunikation zwischen Tumor und mesenchymalen Stammzellen zu definieren

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

Funktionsbewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as drug resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and metastasis. Intratumoral eATP is 103 to 104 times higher in concentration than in normal tissues. While eATP functions as a messenger to activate purinergic signaling for EMT induction, it is also internalized by cancer cells through upregulated macropinocytosis, a specific type of endocytosis, to perform a wide variety of biological functions. These functions include providing energy to ATP-requiring biochemical reactions, donating phosphate groups during signal transduction, and facilitating or accelerating gene expression as a transcriptional cofactor. ATP is readily available, and its study in cancer and other fields will undoubtedly increase. However, eATP study remains at an early stage, and unresolved questions remain unanswered before the important and versatile activities played by eATP and internalized intracellular ATP can be fully unraveled.
These authors&#39; laboratories&#39; contributions to these early eATP studies include microscopic imaging of non-hydrolysable fluorescent ATP, coupled with high- and low-molecular weight fluorescent dextrans, which serve as macropinocytosis and endocytosis tracers, as well as various endocytosis inhibitors, to monitor and characterize the eATP internalization process. This imaging modality was applied to tumor cell lines and to immunodeficient mice, xenografted with human cancer tumors, to study eATP internalization in vitro and in vivo. This paper describes these in vitro and in vivo protocols, with an emphasis on modifying and finetuning assay conditions so that the macropinocytosis-/endocytosis-mediated eATP internalization assays can be successfully performed in different systems.

We developed a reproducible method to visualize the internalization of nonhydrolyzable fluorescent adenosine triphosphate (ATP), an ATP surrogate, with high cellular resolution. We validated our method using independent in vitro and in vivo assays-human tumor cell lines and immunodeficient mice xenografted with human tumor tissue.

Fluoreszenzmikroskopie für ATP-Internalisierung, vermittelt durch Makropinozytose in menschlichen Tumorzellen und tumor-xenografierten Mäusen

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary tumor cells from surgically resected, malignant pleural mesothelioma (MPM) by providing a complete overview of the process from digestion to enrichment, expansion, cryopreservation, and phenotypic characterization. In addition, this protocol introduces concepts for tumor generation that may be useful for multiple tumor types such as differential trypsinization and the impact of dissociation methods on the detection of cell surface markers for phenotypic characterization. The major limitation of this study is the selection of tumor cells that will expand in a two-dimensional (2D) culture system. Variations to this protocol, including three-dimensional (3D) culture systems, media supplements, plate coating to improve adhesion, and alternate disaggregation methods, could improve this technique and the overall success rate of establishing a tumor line. Overall, this protocol provides a base method for establishing and characterizing tumor cells from this rare tumor.

The goal of this method paper is to demonstrate a robust and reproducible methodology for the enrichment, generation, and expansion of primary tumor cell lines from surgically resected pleural mesothelioma.

Erzeugung und Erweiterung primärer, maligner pleuraler Mesotheliom-Tumorlinien

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...