この作品は、スイス国立科学財団 Sinergia グラント CRSII3 147697、財団毛皮アメリカ Krebsforschung、チューリッヒ Krebsliga によって支えられました。

1. ゾル性細胞質、核タンパク質画分の調製
<ol><li>プレート 4 × 106 ACC-メソ-4 RPMI - 1640 媒体で育つ T150 細胞培養用フラスコ細胞 10 %fbs、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (100 x) 2 mM L-グルタミン (200 mM) と補われます。細胞が 80-90% (~5-5.5 x 106セル) の合流点に達したら、核と細胞質画分の蛋白質の抽出を続行します。 注: ACC-メソ-4 セルの行は、理化学研究所バイオ リソース センター11から得られました。</li>
	<li>培地を吸引、洗浄し、15 mL の 1x PBS を追加することによって、セル、プレートを軽く数回に傾け、1 × PBS を吸引します。0.25% の 3 mL を加えてトリプシン-EDTA と 3 分の 37 ° C で培養用フラスコを孵化させなさい。 注: 剥離の顕微鏡で細胞を見てください。タップをまだ接続 3 の手の手のひらにフラスコは回します。</li>
	<li>10 %fbs、1 x ペニシリン/ストレプトマイシン (100 x) 2 mM L-グルタミン (200 mM) と RPMI 1640 培の 7 mL を追加し、15 mL チューブに細胞を収集し、5 分の 200 x g でスピンダウンします。</li>
	<li>培地を吸引し、1.5 ml の 1x PBS の細胞ペレットを再懸濁します、1.5 mL 遠心チューブにセルを転送します。スピン ・ ダウン 500 × g で 5 分破棄上清の 4 ° C。 注: このステップから 4 ° C で遠心分離手順をすべて実行して、氷の上すべての試薬。</li>
	<li>冷たい 1.5 ml の 1x PBS の細胞ペレットを再懸濁します、スピン ・ ダウン (500 g) x および 4 ° C で 3 分間のセルは、上澄みを廃棄します。 注: CER の必要量 I、CER II、および NER 試薬、10、0.55、ボリュームをそれぞれパック推定細胞ペレットの 5 冊次のプロトコルは、20 μ L のボリュームを想定しています。CER の試薬の必要量のみを準備をお勧めします私。</li>
	<li>冷たい細胞質抽出試薬を 200 μ l 添加 (CER 私) 100 x の在庫を入手するために水を 500 μ l 添加のプロテアーゼ阻害剤 (EDTA 無添加) 1 タブレットを希釈プロテイナーゼ阻害剤、例えば、x 1 の 2 μ L で補われます。この試薬 CER の量私は 20 μ L のボリューム満載細胞ペレットを溶解するのに十分です。<ol>
<li>細胞ペレット充填量を見積もるには、10、20、50、100 μ L の 1x PBS でいっぱい 1.5 mL チューブ管内細胞ペレットを比較します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>精力的にボルテックス 15 管細胞ペレットを再懸濁します s 管、積極的に 5 の渦に冷たい細胞質抽出試薬 (CER II) の 10 分追加 11 μ L の氷のチューブをインキュベートし、s、氷で 1 分を孵化させなさいと。</li>
	<li>5 s と g x 16,000 でチューブを遠心分離機は積極的に渦と 4 ° C、5 分は、氷の上きれいな中古冷蔵チューブに上清を転送します。上清はさらに細胞質画分は、RNA プルダウン実験で使用されます。</li>
	<li>プロティナーゼの抑制剤 (100 x) と精力的に 15 の渦の 1 μ L を添加した氷核抽出試薬 (NER) の 100 μ L の残りのペレットを再懸濁します s。プロテアーゼ阻害剤を添加した NER 試薬の必要量のみの準備をお勧めします。</li>
	<li>15 時折ボルテックスと 40 分の氷のサンプルをインキュベート s (10 分毎)。</li>
	<li>きれいな中古冷蔵チューブに (これは核タンパク質画分) 清 16,000 x g で 10 分間転送でチューブを遠心します。</li>
	<li>ビシンコニン (BCA) 法を用いたタンパク質の濃度を測定することによってすぐに進む (材料の表を参照してください)。各フラクションのタンパク質の純度を制御するためには、α-チューブリン (細胞質画分にのみ肯定的な検出) とポリ ADP リボース ポリメラーゼ - PARP (核分画でのみ検出) 免疫ブロット (図 1) を実行します。蛋白質の視覚化、セクション 4 を参照してください。</li>
	<li>蛋白質の活動と自分の本来の状態を維持するために細胞質および核エキスの因数の 25 μ L を準備します。5 s-80 ° C で直接ストアに液体窒素でそれらを配置することによってこれらの因数に凍結</li>
</ol>2. Desthiobiotin をもつ RNA のラベリング
<ol><li>市販合成 RNA プローブと HPLC 精製があります。ヌクレアーゼ フリー水 10 μ M を再懸濁します。 メモ: プローブの順序は、表 1に表示されます。</li>
	<li>RNA プルダウン反応あたり RNA の 50 pmol を使用します。氷上のペグ 30%、RNA オリゴのラベル 3' 末端に使用される点を除いてすべての試薬を解凍しています。</li>
	<li>CALB2 としてラベル 3' UTR は 10 μ M RNA プローブの 5 μ L を転送、CALB2 3' UTR (mtARE) と無関係な RNA (怒り) に 0.5 mL 薄肉・遠心管し氷のチューブの場所すぐに 5 分の 85 ° C で PCR 機で孵化させなさい。 注: この手順は重要ですが、リラクゼーションと標識 RNA プローブのアクセシビリティを推進。</li>
	<li>RNA を含むチューブ、次の 10 μ L ミックスに追加シングル 30 μ L 反応: ヌクレアーゼ フリー水の 3 μ L、3 μ L の RNA リガーゼの反応バッファー、RNase 阻害剤の 1 μ L x 10 (40 U/μ L)、Desthiobiotinylated シチジン二リン酸 (1 mM) の 1 μ L、と T4 RNA リガーゼ (20 U/μ L) の 2 μ L。 注: マスター ミックス A 過剰 (3.2) に 3 サンプルで、ミックスを準備するヌクレアーゼの 9.6 μ L 無料水、9.6 μ L の RNA リガーゼの反応バッファー、RNase 阻害剤 3.2 μ x 10 (40 U/μ L)、Desthiobiotinylated シチジン二リン酸 (1 mM) の 3.2 μ L と T4 RNA リガーゼ (20 U/μ L) の 6.4 μ L。</li>
	<li>慎重に 15 μ L の反応に 30% のペグを追加します。別のヒントを使用して、反応をミックスします。16 ° C で一晩反応を孵化させなさい</li>
	<li>次の日、次の準備: 5 M の NaCl (新鮮な/ヌクレアーゼ フリー)、クロロホルム: イソアミル アルコール (例えば反応 - 96 μ L のクロロホルム ・ イソアミル アルコールの 4 μ L あたり)、24:1 の比率で冷たい 100% エタノールと氷 70% エタノール。</li>
	<li>RNA 標識反応管にヌクレアーゼ フリー水の 70 μ L を追加します。100 μ L のクロロホルムを追加: イソアミル アルコールと渦を簡潔に。スピンダウン 13,000 x g で 3 分は慎重に上部段階と; 新しいヌクレアーゼ フリー 1.5 mL チューブへの転送のみを削除下相は触れないでください。</li>
	<li>5 M NaCl、グリコーゲンの 1 μ L と冷えた 100% エタノールの 300 μ L の 10 μ L を追加します。2 時間-20 ° C でチューブを配置します。 注: この手順では、次の日に実験を継続できます。</li>
	<li>13,000 g x と 4 ° C で 15 分間遠心する慎重にペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。冷たい 70% エタノールや 5 分間遠心する 13,000 x g で再度、4 ° C の 300 μ L を追加します。</li>
	<li>完全に上澄みを廃棄し、空気乾燥ペレット (15 分)。ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L にペレットを再懸濁します。 注: は、同じ日に RNA プルダウンに進みます。</li>
	<li>2 分間 90 ° C で RNA を孵化し、氷の場所します。ストレプトアビジン磁気ビーズの前洗浄の次のステップの間に氷の上標識 RNA を配置します。 注: 長いインキュベーション時間は、RNA プローブを損傷があります。</li>
</ol>3. RNA 蛋白質プルダウン
<ol><li>
前洗浄ストレプトアビジン磁気ビーズと desthiobiotin RNA の孵化
	<ol>
<li>ストレプトアビジン磁気ビーズ 50 pmol RNA あたりの 50 μ L を使用します。ただし、これは、実験によって最適化する必要があります。</li>
		<li>渦 15 s、かつ迅速にきれいな 1.5 mL 安全ロック チューブに削除 200 μ L (マスター ミックス; 3 + 1 の反応を十分) のストレプトアビジン磁気ビーズのチューブは、ピペット チップをカットしました。マグネット スタンドにチューブを置き、ビーズ、チューブの側で収集し、1 分削除再懸濁液を待ちます。</li>
		<li>ビーズを洗浄、マグネット スタンドからチューブを削除、0.1 M NaOH、0.05 M の食塩、ピペットで移しなさい優しく数回上下の 400 μ L を追加します。マグネット スタンドにチューブを置きます。1 分を待ち、上澄みを収集します。この手順をもう一度繰り返します。</li>
		<li>100 mM の NaCl の 200 μ L でビーズを洗浄します。上澄みを除去します。</li>
		<li>トリス (pH 7.5)、ピペッティングでビードを再停止しなさい、マグネット スタンドにチューブを配置、1 分待つ、上澄みを除去 20 mm 200 μ L を追加します。手順を繰り返します。</li>
		<li>マグネット スタンドからチューブを削除 200 μ L の RNA キャプチャ バッファー x 1 を追加して、簡単にボルテックス ストレプトアビジン磁気ビーズを再懸濁します。ストレプトアビジン磁気ビーズの 50 μ L を削除し、各標識 RNA チューブのカットのピペット チップを使用して追加します。チューブ ローラーに室温で 30 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA に蛋白質の結合
	<ol>
<li>マグネット スタンドにチューブを置き、1 分待って、上澄みを除去します。</li>
		<li>ビーズに 20 mM トリス (pH 7.5) の 50 μ L を追加し、ピペッティングで再懸濁します。マグネット スタンドにチューブを置き、1 分待って、上清を除去します。この手順を繰り返します。</li>
		<li>ビーズにタンパク質-RNA 結合バッファー x 1 の 100 μ L を追加し、ピペッティングで再懸濁します。</li>
		<li>一方で、次のミックスを準備: タンパク質-RNA 結合バッファー、50% のグリセロールの 30 μ L、50 μ g 細胞質蛋白質のヌクレアーゼ フリー x 10 の 10 μ L の水に 100 μ L。 注: 次のように超過分 (3.3) の 3 サンプルのマスター ミックス B の準備: タンパク質-RNA 結合バッファー x 10 の 33 μ L、50% のグリセロールの 99 μ L、細胞質タンパク質とヌクレアーゼ フリー水 330 μ L. までの 165 μ g マスター ミックス B 氷の上の管を維持します。</li>
		<li>マグネット スタンドにチューブを置いて、1 分待って、上清を収集します。マスター ミックス B の 100 μ L を加えて優しく上下、ピペッティングで再懸濁します泡を作成しないように。ローラーに 4 ° C で 60 分の反応管を孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
洗うと溶出
	<ol>
<li>マグネット スタンドにチューブを配置 (これは流れる - FT) 上清を収集し、新しいチューブに移します。 注意: この FT より遅い分析のための氷の上。</li>
		<li>ビーズの洗浄バッファー x 1 の 100 μ L をピペット、優しく再懸濁します、マグネット スタンドに戻す、1 分を待ち、上澄みを廃棄します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>磁気ビーズに 40 μ L の溶出バッファーを追加、上下、ピペッティングで混ぜる、37 ° C で 30 分間チューブ シェーカー (950 rpm) で孵化させなさい。</li>
		<li>マグネット スタンドにチューブを配置、1 分待ってし、(これは溶出液 - E) 溶出のサンプルを収集します。氷の場所し、下流の分析に使用します。 注: この手順では、各テストの RNA プローブ フロースルー (フィート) と (E) 溶出液のサンプルから成ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ポリアクリルアミド電気泳動および西部のしみの分析
注: このセクションで使用されるバッファーのためのレシピの表 2 を参照してください。西洋を実行塩化物方法12によるとしみ。
<ol><li>Handcast 12% の SDS ページのゲル (10 井戸、1.5 mm のスペーサー、66 μ L)。実行中のゲル ミックスを準備: 4 mL 原液 30% アクリルアミド-bisacrylamide、低いトリスの 2.4 mL のバッファー、dH2O、TEMED 96 μ 10% アンモニア過硫酸 (APS) の 9.6 μ L の 3.2 mL。スタッキングのゲルのミックスを準備: 3.25 mL dH2O、30% アクリルアミド - bisacrylamide 原液 1.3 mL の上部 Tris バッファーの 0.5 mL、TEMED、10% の 20 μ L の 10 μ L の AP。</li>
	<li>6 x Laemmli バッファーの 16.6 μ L を追加 (例えばトリス/塩酸/SDS pH 6.8 14 mL (上部 Tris バッファー)、SDS、地デジ、6 mL、グリセリン、0.012% ブロモフェノール ブルー; 1.86 g の 2 g-20 ° C で保存) FT サンプルとサンプル E 6 x Laemmli バッファーの 6.6 μ L に。95 ° C で 5 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>(20 μ L フィートと全体の溶出 〜 40 μ L) サンプルをロードし、60 V、20 V を一晩続行で 30 分間実行します。</li>
	<li>半乾式電気的ブロッティング法を用いた、15 V で 80 分の PVDF 膜に蛋白質を転送します。 注: PVDF 膜はタンパク質の転送を実行する前にアクティブ化する必要があります。1 分、超純水で 2 分間インキュベーションによって続いて 100% メタノールで膜を孵化させなさい。</li>
	<li>タンパク質の転送後は、Coomassie ソリューション各 30 分、超純水で洗浄の 3 つのステップに続いて、3 h の SDS ページのゲルを孵化させなさい。</li>
	<li>タンパク質の転送の終わりに、4.5 の手順で示されているように、1 h. は膜を再アクティブ化のための乾燥 PVDF 膜ができます。膜 1 h と 1 x TTBS 5 %bsa をブロックします。</li>
	<li>最初の抗体を持つ膜を孵化させなさい: ハーや mesothelin、両方の希釈 4 時間室温でまたは一晩 4 ° C で 1 x TTBS で 5 %bsa で 1: 1000</li>
	<li>1 x TTBS で 3 回は 7 分間膜を洗浄し、ウサギ抗マウス ペルオキシダーゼ (HRP) を孵化させなさい-共役二次抗体希釈 5 %bsa、1 x TTBS、1: 10,000。</li>
	<li>化学発光、デジタル イメージャを用いたタンパク質を視覚化します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation.">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress:+a+matter+of+survival.">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li><li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AREsite2:+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU/GU/U-rich+elements.">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li><li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma.">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biotin-(strept)avidin+system:+principles+and+applications+in+biotechnology.">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+Uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>. Magnetic bead technology for better assay development Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013)</li><li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients.">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis/transport+of+nuclear+ferritin+RNAs.">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li><li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+function+in+disease.">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+regulatory+RNA.">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li><li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

3' UTRs は非コーディング ゲノム3に属し、すべての非コード Rna 蛋白質7彼らの機能を発揮するために対話できます。哺乳類のゲノムは行き渡って転写されることがわかったし、長鎖非コード Rna16のかなりの部分を生成、これらの長い非コード Rna 機能と対話する遺伝子発現を調節することを示した証拠を新興クロマチン再構築複合体<sup class...

MRNA の安定性と mRNA 翻訳レート1に影響を与える遺伝子の発現と遺伝子産物の最後のレベルをしっかりと調節できます。非コーディングの RNA や RNA 結合タンパク質 (Rbp) の標的 mRNA との対話を通じてこれらの転写後調節機構が加わる。それは通常 (3' UTR -2ゲノムの非コーディングの部分に属する) 特定cisを含む mRNA の 3' 非翻訳領域-トランスによって認識される規制要素 (CRE)-miRNA や Rbp などの要因を演技3最高研究cis-3' UTR、内の要素は、アデニンの豊富な要素 (は) モチーフには、特定の AU 結合蛋白質 (AUBP) し、順番が認識誘導か mRNA の分解/deadenylation (は崩壊) または。mRNA 安定4。
サイズ 3' UTR カルレチニンの mRNA (CALB2) は 573 長い bp、AREsite2、bioinformatic ツール5によって予測された、推定 AUUUA いくつが含まれます。推定はモチーフの存在と一貫性のある、pmirGLO ベクトル レポーターアッセイ CALB2 mRNA6要素の安定化の役割を示した。最後にの in vitro RNA プルダウン カルレチニンが安定 AUBP を識別するために使用された mRNA はモチーフを。
すべての非コーディングの Rna とタンパク質7の対話、以来体外RNA プルダウンは分子メカニズムの解読を支援するための良い方法と RNA インターアクターを識別するための最初の選択の試金。この RNA プルダウン法市販合成 RNA プローブは、RNA 鎖の 3' 末端をビオチン (desthiobiotin) の修正された形で付けられましたが使用されていました。RNA desthiobiotin が特に関心のバインド RNA と相互作用するタンパク質をプルダウンに使用される磁気ビーズのストレプトアビジンとの相互作用を介して固定します。中皮腫細胞の細胞質画分から非変性とアクティブな蛋白質は蛋白質のソースとして使用されます。このような RNA 結合タンパク質は、12 %sds ページのゲルを実行、膜に転送され、異なる抗体をプローブの磁気ビーズから溶出されます。
過酷な変性条件は8バインドされたタンパク質を溶出への強力な不可逆的なビオチン ストレプトアビジン結合を破壊するために必要な標準的なストレプトアビジン-ビオチン アフィニティ精製手順での解離を引き起こす可能性蛋白質の複合体。異なり、ビオチン、desthiobiotin は可逆的ストレプトアビジンにバインド、ビオチン、蛋白質の穏やかな溶出を可能にして当然のことながらビオチン化分子の9分離を回避するバッファー溶液で避難は競争力のあります。技法が原産の条件の下でネイティブ蛋白質の複合体を分離するために理想的なことを示唆しています。
体外結合条件と逼迫、塩濃度、還元剤、洗剤の割合によって決定されますが真生体内での相互作用を識別するために携帯電話のコンテキストで現在のものに近いはずです。本実装バインド条件実証されている以前 AU 結合タンパク質10として、ハーを識別するために適切です。このアプローチは、適切な結合条件の最適化は時間がかかり、挑戦をすることができますので、時間を節約できます。さらに、このメソッドは、任意の RNA プルダウン実験開始プロトコルとして使用することができる、塩と洗剤の濃度を変化させ、グリセリンの割合を変更して他の塩を追加することによって徐々 に最適化することができます。さらに、こともいくつをかくまっている短い 25 ヌクレオチド RNA プローブはモチーフに使える特定の AUBP との相互作用を示すデモンストレーションを行った。

<table><tbody><tr><td>NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pierce RNA 3&amp;rsquo; End Desthiobiotinylation Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>The kit is a part of the &quot;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&quot;, and needs to be stored at -20 &amp;deg;C unlike the pull-down kit (4 &amp;deg;C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&amp;nbsp; magnetic stand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&amp;nbsp; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &amp;alpha; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9542</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&amp;nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Secondary goat anti-rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Secondary rabbit anti-mouse antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Filtrated Bovine Serum</td><td>Pan Biotech&amp;nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin - streptomycin (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life technologies&amp;nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean System Glass Plates&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &amp;micro;L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&amp;nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&amp;nbsp; Digital Imager</td><td>Vilber</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>RNA oligo synthesis</td><td>Mycrosynth AG, Switzerland</td><td>-</td><td>the synthesis scale - 0.04 &amp;micro;mol - HPLC purified</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50% sterile aliquots to be stored at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin magnetic beads&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &amp;micro;m (range from 0.5 - 1.5 &amp;micro;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &amp;micro;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>ortho-phosphoric acid&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

In vitro RNA プルダウン、まだ主目的で特定の RNA の構造とモチーフを認識 RNA 結合蛋白質を識別するプロトコルの最初の手順で使用されます。この RNA プルダウン プロトコルで市販合成 RNA プローブがビオチン、ストレプトアビジンに可逆的に結合しより下で蛋白質の溶出がように rna の 3' 末端に、desthiobiotin の変更されたフォームと分類される生理条件。RNA desthiobiotin が特に関心の RNA と相互作用するタンパク質をプルダウンに使用される磁気ビーズのストレプトアビジンとの相互作用を介して固定します。中皮腫細胞の細胞質画分から非変性とアクティブな蛋白質は蛋白質のソースとして使用されます。ここで説明する方法は、知られている RNA 結合タンパク質との興味のシーケンスを含む 25 ヌクレオチド (nt) 長い RNA プローブ間の相互作用の検出に適用できます。これは安定しているか不安定要素ベクトル レポーターアッセイを使用して達成する RNA 分子の存在の機能の解析を完了するのに役立ちます。

この実験では、カルレチニン 3' UTR 遺伝子がモチーフ (CALB2 3' UTR (は) 25 nt) の 25 nt 長いフラグメントはそれは既知 mRNA 安定人間抗原 R (ハー) 蛋白質にとりわけ結合するかどうかをテストするため使用されました。25 nt RNA は要素の特異性をテストするには、プローブ CALB2 3' UTR (mtARE) がモチーフの安定化効果を廃止する以前に示されて、あるモチーフの突然変異を含むだ?...

Watch this Scientific Journal Video about Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells at JoVE.com

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

Desthiobiotin ラベル アデニンの豊富な要素 (は) モチーフが含まれている、合成 25 ヌクレオチド RNA oligo のゾル性細胞質が結合タンパク質の特異的結合をことができます。

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.0K ビュー.  University Hospital Zurich. Desthiobiotin ラベル アデニンの豊富な要素 (は) モチーフが含まれている、合成 25 ヌクレオチド RNA oligo のゾル性細胞質が結合タンパク質の特異的結合をことができます。

ビデオ: Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

遺伝学

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

生化学

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate regulation of these processes. A strategy called CLIP-seq (cross-linking and immunoprecipitation) has been developed to capture endogenous protein-RNA interactions with UV cross-linking followed by immunoprecipitation. Despite the wide use of conventional CLIP-seq method in RBP study, the CLIP method is limited by the availability of high-quality antibodies, potential contaminants from the copurified RBPs, requirement of isotope manipulation, and potential loss of information during a tedious experimental procedure. Here we describe a modified CLIP-seq method called FbioCLIP-seq using the FLAG-biotin tag tandem purification. Through tandem purification and stringent wash conditions, almost all the interacting RNA-binding proteins are removed. Thus, the RNAs interacting indirectly mediated by these copurified RBPs are also reduced. Our FbioCLIP-seq method allows efficient detection of direct protein-bound RNAs without SDS-PAGE and membrane transfer procedures in an isotope-free and protein-specific antibody-free manner.

Here we present a modified CLIP-seq protocol called FbioCLIP-seq with FLAG-biotin tandem purification to determine the RNA targets of RNA-binding proteins (RBPs) in mammalian cells.

FLAG-ビオチンタンデム精製による架橋と免疫沈降によるタンパク質RNA相互作用のトランスクリプトーム全体プロファイリング

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis by antibiotics and during nascent polypeptide synthesis. Some of these antibiotics, and regulatory nascent polypeptides mostly in the form of peptidyl-tRNAs, inhibit either peptide bond formation or translation termination1-7. These inhibitory events can stop the movement of the ribosome, a phenomenon termed "translational arrest". Translation arrest induced by either an antibiotic or a nascent polypeptide has been shown to regulate the expression of genes involved in diverse cellular functions such as cell growth, antibiotic resistance, protein translocation and cell metabolism8-13. Knowledge of how antibiotics and regulatory nascent polypeptides alter ribosome function is essential if we are to understand the complete role of the ribosome in translation, in every organism.
Here, we describe a simple methodology that can be used to purify, exclusively, for analysis, those ribosomes translating a specific mRNA and containing a specific peptidyl-tRNA14. This procedure is based on selective isolation of translating ribosomes bound to a biotin-labeled mRNA. These translational complexes are separated from other ribosomes in the same mixture, using streptavidin paramagnetic beads (SMB) and a magnetic field (MF). Biotin-labeled mRNAs are synthesized by run-off transcription assays using as templates PCR-generated DNA fragments that contain T7 transcriptional promoters. T7 RNA polymerase incorporates biotin-16-UMP from biotin-UTP; under our conditions approximately ten biotin-16-UMP molecules are incorporated in a 600 nt mRNA with a 25% UMP content. These biotin-labeled mRNAs are then isolated, and used in in vitro translation assays performed with release factor 2 (RF2)-depleted cell-free extracts obtained from Escherichia coli strains containing wild type or mutant ribosomes. Ribosomes translating the biotin-labeled mRNA sequences are stalled at the stop codon region, due to the absence of the RF2 protein, which normally accomplishes translation termination. Stalled ribosomes containing the newly synthesized peptidyl-tRNA are isolated and removed from the translation reactions using SMB and an MF. These beads only bind biotin-containing messages.
The isolated, translational complexes, can be used to analyze the structural and functional features of wild type or mutant ribosomal components, or peptidyl-tRNA sequences, as well as determining ribosome interaction with antibiotics or other molecular factors 1,14-16. To examine the function of these isolated ribosome complexes, peptidyl-transferase assays can be performed in the presence of the antibiotic puromycin1. To study structural changes in translational complexes, well established procedures can be used, such as i) crosslinking to specific amino acids14 and/or ii) alkylation protection assays1,14,17.

A major impediment to biochemical analyses of ribosomes containing nascent peptidyl-tRNAs has been the presence of other ribosomes in the same samples, ribosomes not involved in the translation of the specific mRNA sequence being analyzed. We developed a simple methodology to purify, exclusively, the ribosomes containing the nascent peptidyl-tRNA of interest.

機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

生物学

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; RNAプルダウン

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

要約

さらに動画を探す

この動画の章

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

ビオチンベースプルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングルステップ浄化

FLAG-ビオチンタンデム精製による架橋と免疫沈降によるタンパク質RNA相互作用のトランスクリプトーム全体プロファイリング

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

RNA結合タンパク質の検出によって、

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

要約

さらに動画を探す

この動画の章

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングル ステップ浄化

FLAG-ビオチンタンデム精製による架橋と免疫沈降によるタンパク質RNA相互作用のトランスクリプトーム全体プロファイリング

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

RNA結合タンパク質の検出によって、

ビオチンベースプルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

ビオチンと写真分解リンカーに接続されている RNA を用いた高分子複合体のシングルステップ浄化