עבודה זו נתמכה על ידי המענק שוויצרי Sinergia קרן המדע הלאומית CRSII3 147697, Stiftung לדנציג Krebsforschung לאומנות Krebsliga ציריך.

1. הכנת חלבון Cytosolic וגרעיני שבר
<ol><li>צלחת 4 x 106 ACC-MESO-4 תאים בקבוקון תרבות תא T150 גדל RPMI - 1640 בינוני בתוספת 10% FBS, x 1 פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ). כאשר תאים מגיעים זרימה של 80-90% (~5-5.5 x 106 תאים), להמשיך עם חלבון החילוץ של שבר גרעינית, cytosolic. הערה: ACC-MESO-4 תאים בטור היה המתקבלים מרכז BioResource RIKEN11.</li>
	<li>האחות בינוני, לשטוף את התאים על-ידי הוספת 15 מ"ל של PBS 1 x, להטות את הצלחת בעדינות מספר פעמים, מחוק לגמרי מגניב 1 x. להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA דגירה את הבקבוקון תרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הערה: תראו התאים במיקרוסקופ לחיפוש ניתוק; אם עדיין מחובר ברז הבקבוקון נגד בכף יד 3 פעמים.</li>
	<li>להוסיף 7 מ של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ), לאסוף את התאים בשפופרת 15 מ"ל, ספין למטה ב g x 200 במשך 5 דקות.</li>
	<li>האחות בינוני, resuspend תא גלולה עם 1.5 מ של 1 x PBS, לאחר מכן להעביר התאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. ספין למטה ב 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך תגובת שיקוע. הערה: משלב זה ואילך, לבצע את כל השלבים צנטריפוגה ב 4 ° C ולשמור כל ריאגנטים על קרח.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא קר כקרח 1.5 מ של 1 x PBS וזורקים ספין למטה התאים ב 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות את תגובת שיקוע. הערה: הסכומים הנדרשים הועידה אני, השני CER ו נר ריאגנטים הם 10, 0.55 ו- 5 כרכים של גלולה תא מוערך ארוז נפח, בהתאמה; הפרוטוקול הבא מבוסס על ההנחה נפח של 20 µL. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של ריאגנט CER אני.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של ריאגנט החילוץ cytoplasmic כקרח (CER אני) בתוספת 2 µL 1 x proteinase מעכב, למשל, לדלל 1 טבליה של מעכב פרוטאז (חינם EDTA) ב- 500 µL של מים כדי להשיג 100 x מניות. כמות זו של ריאגנט CER אני מספיקה כדי lyse µL 20 של גלולה תא ארוז נפח.<ol>
<li>כדי להעריך צניפה ארוז נפח התאים, להשוות את הצינור המכיל בגדר תא עם צינור 1.5 mL מלא עם µL 10, 20, 50 או 100 ל- PBS 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend בגדר תא על-ידי נמרצות vortexing הצינור עבור 15 s דגירה הצינור על קרח במשך 10 דקות להוסיף 11 µL של ריאגנט החילוץ cytoplasmic כקרח II (CER II) אל הרכבת התחתית, נמרצות מערבולת עבור 5 s, דגירה 1 דקות על קרח.</li>
	<li>מערבולת נמרצות במשך 5 s ו צנטריפוגה הצינור ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להעביר את תגובת שיקוע הצינור טרום מקורר נקי על קרח. תגובת שיקוע הוא השבר cytoplasmic זה נוספים המשמשים את הניסוי RNA-הנפתח.</li>
	<li>Resuspend בגדר הנותרים ב 100 µL של ריאגנט החילוץ גרעיני קרח (נר) בתוספת 1 µL של proteinase מעכב (100 x), נמרצות מערבולת 15 s. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של ריאגנט נר עם מעכבי פרוטאז.</li>
	<li>דגירה המדגם על קרח למשך 40 דקות עם vortexing ומדי פעם 15 s (כל 10 דקות).</li>
	<li>Centrifuge הצינור ב- 16,000 x g עבור 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע (זהו השבר חלבון גרעיני) לרכבת התחתית טרום מקורר נקי.</li>
	<li>המשך מיד על ידי מדידת ריכוז חלבון בשיטת bicinchoninic (BCA) (ראה טבלה של חומרים). כדי לשלוט על חלבון הטוהר של כל שבר, לבצע immunoblotting (איור 1) נגד α-טובולין (זיהוי חיובי רק ב השבר cytosolic), Poly ADP-ריבוז פולימראז - PARP (זיהוי חיובי רק ב השבר הגרעין). להמחשת חלבון, עיין בסעיף 4.</li>
	<li>על מנת לשמור על פעילות החלבון. והמדינה מקורית שלהם, להכין 25 µL של aliquots של תמציות cytosolic וגרעיני. Snap-הקפאת אלה aliquots על-ידי הצבתם חנקן נוזלי עבור 5 s ומאגר ישירות ב- 80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. תיוג של RNA עם Desthiobiotin
<ol><li>הגששים RNA מסחרית מסונתז, HPLC מטוהרים. Resuspend במים נטולי נוקלאז-10 מיקרומטר. הערה: רצפים בדיקה מפורטים בטבלה 1.</li>
	<li>השתמש pmol 50 של RNA לפי התגובה RNA-הנפתח. הפשרת ולשמור כל ריאגנטים על קרח חוץ עבור פג 30%, נהגה תווית 3' הסופית של RNA oligo.</li>
	<li>העברת µL 5 של 10 הגששים RNA מיקרומטר, כאנטי CALB2 3' UTR (הם), CALB2 3' UTR (mtARE), והכעס Unrelated-RNA (), לתוך 0.5 mL קיר דק microcentrifuge צינורות, דגירה במכונת ה-PCR ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דק במקום הצינורות מיד על קרח. הערה: השלב זה חשוב, כפי שהיא מקדמת את הנגישות של המכשיר RNA עבור תיוג רוגע.</li>
	<li>לתגובה 30 µL יחיד, להוסיף הצינור המכיל RNA המיקס 10 µL הבאים: 3 µL של נוקלאז מים חינם, 3 µL של 10 x רנ א ליגאז התגובה מאגר, µL 1 של RNase מעכב (40 U/µL), µL 1 של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 מ) , ו- 2 µL של T4 RNA ליגאז (U 20/µL). הערה: כדי להכין מיקס מאסטר א 3 דגימות עודף (3.2), לערבב µL 9.6 של נוקלאז מים חינם, 9.6 µL של 10 x רנ א ליגאז התגובה מאגר, µL 3.2 של RNase מעכב (40 U/µL), µL 3.2 של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 מ מ), ו- 6.4 µL של T4 RNA ליגאז (U 20/µL).</li>
	<li>להוסיף בזהירות 15 µL של פג 30% להתגובה. השתמש עצה נוספת כדי לערבב את התגובה. דגירה התגובה בין לילה ב-16 ° c</li>
	<li>למחרת, להכין את הדברים הבאים: 5 M NaCl (רעננה/נוקלאז חינם), כלורופורם: אלכוהול isoamyl ב- 24:1 יחס (למשל, לפי התגובה - 96 µL כלורופורם וב µL 4 isoamyl אלכוהול), אתנול 100% קר כקרח, אתנול 70% קר כקרח.</li>
	<li>להוסיף 70 µL של מים נטולי נוקלאז הצינורות התגובה תיוג-RNA. להוסיף 100 µL של כלורופורם: isoamyl אלכוהול, מערבולת בקצרה. ספין למטה ב 13,000 x g עבור 3 מינימלית הסר בזהירות רק את השלב העליון ואת העברת צינור ללא נוקלאז mL 1.5; להימנע מלגעת השלב התחתון.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של NaCl 5 מ', µL 1 של גליקוגן µL 300 של אתנול 100% קר כקרח. מקם את הצינור ב-20 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. הערה: בשלב זה, הניסוי ניתן המשיך למחרת היום.</li>
	<li>צנטריפוגה-13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להתעלם בקפידה את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. הוסף µL 300 של אתנול 70% קר כקרח, צנטריפוגה שוב ב 13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>למחוק לחלוטין את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר (15 דקות). Resuspend בגדר ב 20 µL של נוקלאז ללא מים. הערה: להמשיך עם ה-RNA-הנפתח באותו יום.</li>
	<li>דגירה את הרנ א ב 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ומניחים על קרח. מניחים את לוחיות ההסבר-RNA על קרח במהלך השלב הבא של קדם כביסה של חרוזים מגנטי streptavidin. הערה: זמן דגירה ארוך עשוי לפגום החללית ה-RNA.</li>
</ol>3. ה-RNA-חלבון הנפתח
<ol><li>
הדגירה עם desthiobiotin-RNA ושרשרות streptavidin-מגנטי כביסה קדם
	<ol>
<li>השתמש µL 50 של streptavidin beads מגנטי לכל 50 pmol RNA. עם זאת, זה צריך להיות מוטבת בהתאם הניסוי.</li>
		<li>מערבולת ברכבת התחתית עם חרוזי streptavidin-מגנטית 15 s, ובמהירות µL הסר 200 (מיקס מאסטר; מספיק תגובות 3 + 1) לתוך מנעול כספת צינור נקי mL 1.5 באמצעות חתך טיפים פיפטה. המקום את הצינורית על דוכן מגנטי כך החרוזים לאסוף על הצד של הצינור ולחכות דק 1. הסר הנוזל resuspension.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים, להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, להוסיף µL 400 של 0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl פתרון בעדינות pipet לאורך מספר פעמים. מקם את הצינור בחזרה על הדוכן מגנטי. חכה 1דקות. ולאסוף את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה שוב.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים עם µL 200 מ"מ NaCl. הסר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של 20 מ מ טריס (pH 7.5), resuspend חרוזים מאת pipetting, למקם את הצינורית על הדוכן מגנטי, לחכות 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על השלב.</li>
		<li>להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, להוסיף µL 200 1 x מאגר לכידת RNA, resuspend beads מגנטי streptavidin על ידי vortexing בקצרה. להסיר µL 50 של beads מגנטי streptavidin ולהוסיף כל שפופרת הנקרא-RNA באמצעות טיפ פיפטה לחתוך. דגירה הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגלת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
איגוד של חלבון ל RNA
	<ol>
<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לחכות 1 דקות, ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>µL 50 מ מ 20 טריס (pH 7.5) להוסיף החרוזים, resuspend על ידי pipetting. למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לחכות 1 דקות והסר תגובת שיקוע. חזור על שלב זה.</li>
		<li>להוסיף 100 µL 1 x מאגר מחייב חלבון-RNA החרוזים, resuspend על ידי pipetting.</li>
		<li>בינתיים, מכינים את התערובת הבאה: µL 10 של 10 x מאגר מחייב חלבון-RNA, 30 µL של גליצרול 50%, 50 µg של חלבונים cytoplasmic, ונטולת נוקלאז מים עד 100 µL. הערה: להכין מיקס מאסטר B 3 דגימות עודף (3.3) כדלקמן: 33 µL של 10 x מאגר מחייב חלבון-RNA, µL 99 של 50% גליצרול, 165 µg של חלבונים cytoplasmic ומים ללא נוקלאז עד 330 µL. לשמור את הצינורית של מיקס מאסטר B על קרח.</li>
		<li>למקם את הצינורות מעמד מגנטי, לחכות 1דקות. ולאסוף את תגובת שיקוע. להוסיף 100 µL של מיקס מאסטר B, resuspend על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה, הימנע מיצירת בועות. דגירה התגובה צינורות עבור 60 דקות ב 4 ° C על גלגלת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כביסה ו • תנאי
	<ol>
<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לאסוף את תגובת שיקוע (וזה לזרום - מטרים), ולהעביר לתוך צינור חדש. הערה: שמור זה מטרים על הקרח לניתוח בשלב מאוחר יותר.</li>
		<li>פיפטה µL 100 1 x שטיפת מאגר על החרוזים, resuspend בעדינות, להחזיר לתוך העמדה מגנטי, לחכות 1 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פי 2.</li>
		<li>להוסיף 40 µL • תנאי המאגר החרוזים מגנטי, לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה-37 מעלות צלזיוס על מטרף צינור (950 סל ד) למשך 30 דקות.</li>
		<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, המתן 1 דקות, ולאחר איסוף הדגימה eluted (אשר eluate - E). הצב בקירור והשתמש לניתוח במורד הזרם. הערה: בשלב זה, כל נבדק בדיקה RNA מורכב (FT) זרימה דרך הדגימה eluate (E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לזיהוי אלקטרופורזה ומערביות כתם ניתוח
הערה: ראה טבלה 2 מתכונים המאגרים נעשה שימוש בסעיף זה. לבצע מערבון כתם על פי שיטת Laemmli12.
<ol><li>Handcast ג'לים של מרחביות-דף 12% (10-ולס, מרווח 1.5 מ מ, 66 µL). להכין תערובת ג'ל ריצה: 4 מ"ל של 30% אקרילאמיד-bisacrylamide פתרון מניות, 2.4 מ של טריס התחתון מאגר, 3.2 מ"ל של dH2O, 9.6 µL של TEMED, µL 96 של 10% אמוניום persulfate פתרון (APS). להכין תערובת ג'ל הערימה: 3.25 מ ל dH2O, 0.5 מיליליטר 30% אקרילאמיד - פתרון מניות bisacrylamide, 1.3 מ של מאגר טריס העליון, 10 µL של TEMED, µL 20 10% APS.</li>
	<li>להוסיף µL 16.6 מאגר x Laemmli 6 (למשל, 14 מ"ל של טריס/HCl/מרחביות pH 6.8 (מאגר טריס העליון), דור 2 למען חברה דמוקרטית, 1.86 גר' DTT, 6 מ של גליצרול, 0.012% bromophenol כחולות; מאוחסן ב-20 ° C) לתוך הדגימה מטרים, µL 6.6 6 מאגר x Laemmli לתוך מדגם E. דגירה הדוגמאות עבור 5 דקות ב 95 ° C.</li>
	<li>לטעון את הדגימות (µL 20 מטרים ואת כל Elute µL ~ 40) ולהפעיל אותם למשך 30 דקות 60 V, ממשיכים עם 20 וי לילה.</li>
	<li>באמצעות מערכת electroblotting חצי יבש, העברת החלבונים לתוך קרום PVDF במשך 80 דקות בגיל 15 V. הערה: קרום PVDF עליהן להיות מופעלות לפני ביצוע העברה חלבון. דגירה הקרום ב- 100% מתנול עבור 1 דקות, ואחריו דגירה 2 דקות במים הנדסה גנטית.</li>
	<li>לאחר המעבר חלבון, דגירה הג'ל מרחביות-דף עם פתרון Coomassie h 3, ואחריו שלושה שלבים של שטיפה עם מים הנדסה גנטית, בכל 30 דקות.</li>
	<li>בסוף חלבון העברה, תן את הקרום PVDF יבש עבור ה 1 להפעיל מחדש את הקרום כפי שמצוין בשלב 4.5. לחסום את הקרום h 1 עם 5% BSA ב 1 x TTBS.</li>
	<li>דגירה הקרום עם הנוגדן הראשון: חור או mesothelin, שניהם מדולל 1:1000 ב 5% BSA ב 1 x TTBS במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף את הקרום שלוש פעמים במשך 7 דקות ב- 1 x TTBS, דגירה עם ארנב עכבר נגד חזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת מדולל 1:10,000 ב 5% BSA, 1 x TTBS.</li>
	<li>הצג באופן חזותי באמצעות chemiluminescence משופר ו- imager דיגיטלי של חלבונים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation.">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress:+a+matter+of+survival.">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li><li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AREsite2:+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU/GU/U-rich+elements.">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li><li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma.">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biotin-(strept)avidin+system:+principles+and+applications+in+biotechnology.">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+Uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>. Magnetic bead technology for better assay development Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013)</li><li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients.">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis/transport+of+nuclear+ferritin+RNAs.">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li><li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+function+in+disease.">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+regulatory+RNA.">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li><li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

3' UTRs שייך הגנום ללא קידוד3, כל אי קידוד RNAs יכול לקיים אינטראקציה עם חלבונים כדי להפעיל את פונקציית7. כאשר הגנום יונקים נמצאה pervasively יש לשעתק והפיק חלק ניכר RNAs זמן noncoding16, המתעוררים עדויות הדגימו כי אלה RNAs לונג-noncoding מתפקד בוויסות ביטוי גנים כפי שהם אינטר...

ביטוי גנים ואת רמת הסופי של המוצר ג'ין יכול להיות צמוד מוסדר על ידי המשפיעים על יציבות mRNA של mRNA תרגום שיעור1. מנגנונים רגולטוריים post-transcriptional אלה הם המופעל באמצעות פעולת הגומלין בין ללא קידוד RNA ו/או RNA מחייב חלבונים (RBPs) עם ה-mRNA יישוב. בדרך כלל זה 3' לא מתורגם האזור של ה-mRNA (3' UTR - השייכים החלק ללא קידוד של הגנום2) המכיל ספציפי cis-אלמנטים רגולטוריות (CRE), אשר מוכרים על ידי טרנס-מתנהג גורמים כגון miRNA או RBPs 3. הטוב ביותר למד cis-רכיב 3' UTR, אינו המוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), אשר הוכר על ידי AU מחייבת ספציפי חלבונים (AUBP), בתורו, גורם גם mRNA השפלה/deadenylation (בתיווך הם ריקבון) או mRNA מייצב4.
הגודל של 3' UTR של calretinin ה-mRNA (CALB2) הוא 573 bp ארוך ומכיל בשם AUUUA pentamer, כפי שחזיתי מאת AREsite2, כלי bioinformatic5. בקנה אחד עם הנוכחות של מוטיב הם בשם, וזמינותו וקטור-כתב pmirGLO הפגינו תפקיד ייצוב של רכיב זה בתוך ה-mRNA CALB26. לבסוף, ה- במבחנה RNA-הנפתח שימש כדי לזהות את AUBP זה מייצב calretinin mRNA דרך מוטיב הם.
מאז כל אי קידוד RNAs אינטראקציה עם חלבונים7, ה במבחנה RNA-הנפתח היא דרך טובה הראשון-של-בחירה וזמינותו לזיהוי RNA-interactors כדי לסייע בפענוח המנגנונים המולקולריים. בשיטה זו RNA-הנפתח ', הגששים RNA מסונתז באופן מסחרי, אשר הודבקו תוויות עם צורה שונה של ביוטין (desthiobiotin) התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, שימשו. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם המאוגד-RNA עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. כזה חלבונים מאוגד-RNA הם eluted של החרוזים מגנטי, לרוץ דרך ג'ל מרחביות-דף 12%, הועבר קרום, שנבדק עם נוגדנים שונים.
במסגרת ההליך טיהור זיקה streptavidin סטנדרטי-ביוטין, דנטורציה קשים תנאים נדרשים כדי לשבש את הקשר חזק בלתי הפיך ביוטין-streptavidin elute חלבונים מאוגד8, אשר יכול להוביל הדיסוציאציה של מתחמי חלבון. בניגוד ביוטין, desthiobiotin הפיכה נקשר streptavidin, שנעקרו מבתיהם תחרותי עם פתרון במאגר של ביוטין, המאפשר • תנאי עדין של חלבונים, והימנעות בידודו של באופן טבעי biotinylated מולקולות9, רומז הטכניקה הוא אידיאלי עבור בידוד חלבון יליד מתחמי בתנאים מקורית.
במבחנה מחייב תנאים, לכתחילה, אשר נקבע על ידי ריכוז המלחים, צמצום סוכנים ואחוז דטרגנט, צריך להיות קרוב הנוכחים בהקשר הסלולר כדי לזהות נכון ויוו אינטראקציות. התנאים המחייבים מיושמת בזאת בעבר הוכחו באופן המתאים הזיהוי חור חלבון מחייב AU10. גישה זו יכולה לחסוך זמן, מאז אופטימיזציה של תנאי מחייב נכונה יכול להיות זמן רב ומאתגר. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש פרוטוקול התחלה לניסוי RNA-הנפתח כלשהו, ניתן למטב בהדרגה על-ידי שינוי ריכוז מלחים, דטרגנטים, שינוי אחוז גליצרול והוספת מלחים אחרים. יתר על כן, אנחנו הראו כי אפילו קצר 25-נוקלאוטיד RNA-בדיקה מחסה pentamer הם מוטיב יכול לשמש כדי להדגים את האינטראקציה עם AUBP ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pierce RNA 3&amp;rsquo; End Desthiobiotinylation Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>The kit is a part of the &quot;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&quot;, and needs to be stored at -20 &amp;deg;C unlike the pull-down kit (4 &amp;deg;C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&amp;nbsp; magnetic stand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&amp;nbsp; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &amp;alpha; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9542</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&amp;nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Secondary goat anti-rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Secondary rabbit anti-mouse antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Filtrated Bovine Serum</td><td>Pan Biotech&amp;nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin - streptomycin (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life technologies&amp;nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean System Glass Plates&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &amp;micro;L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&amp;nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&amp;nbsp; Digital Imager</td><td>Vilber</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>RNA oligo synthesis</td><td>Mycrosynth AG, Switzerland</td><td>-</td><td>the synthesis scale - 0.04 &amp;micro;mol - HPLC purified</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50% sterile aliquots to be stored at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin magnetic beads&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &amp;micro;m (range from 0.5 - 1.5 &amp;micro;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &amp;micro;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>ortho-phosphoric acid&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

ה במבחנה RNA-הנפתח עדיין משמש את הצעדים הראשונים של פרוטוקולים שמטרתם זיהוי חלבונים RNA מחייב לזהות ספציפית RNA מבנים ומוטיבים. ב פרוטוקול זה RNA-הנפתח, הגששים RNA מסחרית מסונתז מסומנות עם צורה שונה של ביוטין, desthiobiotin, התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, אשר נקשר הפיכה streptavidin, ובכך מאפשרת • תנאי של חלבונים תחת יותר פיזיולוגית תנאים. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם הרנ א עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. ניתן להחיל את השיטה המתוארת כאן כדי לזהות את האינטראקציה בין הידועים RNA מחייב חלבונים 25-נוקלאוטיד (nt) ארוך RNA בדיקה המכיל רצף של עניין. פעולה זו שימושית להשלים אפיון פונקציונלי ייצוב או לערער יציבות אלמנטים נוכח מולקולות RNA הושג ע י שימוש assay וקטור של הכתב.

בניסוי זה, קטע ארוך 25-nt של calretinin 3' UTR מחסה הם מוטיב (CALB2 3' UTR (הם) 25-nt) נעשה שימוש כדי לבדוק אם זה באופן ספציפי נקשר חלבון R האדם-אנטיגן (חור), מייצב mRNA ידוע. כדי לבדוק את ייחודה של רכיב הן, RNA 25-nt בדיקה CALB2 3' UTR (mtARE) הכוללת של מוטציה הם מוטיב, אשר הוצג בעבר לבטל את השפעת ייצוב הם מוטיב, ...

Watch this Scientific Journal Video about Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells at JoVE.com

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.0K Views.  University Hospital Zurich. Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.

Video: Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetics

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Biochemistry

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate regulation of these processes. A strategy called CLIP-seq (cross-linking and immunoprecipitation) has been developed to capture endogenous protein-RNA interactions with UV cross-linking followed by immunoprecipitation. Despite the wide use of conventional CLIP-seq method in RBP study, the CLIP method is limited by the availability of high-quality antibodies, potential contaminants from the copurified RBPs, requirement of isotope manipulation, and potential loss of information during a tedious experimental procedure. Here we describe a modified CLIP-seq method called FbioCLIP-seq using the FLAG-biotin tag tandem purification. Through tandem purification and stringent wash conditions, almost all the interacting RNA-binding proteins are removed. Thus, the RNAs interacting indirectly mediated by these copurified RBPs are also reduced. Our FbioCLIP-seq method allows efficient detection of direct protein-bound RNAs without SDS-PAGE and membrane transfer procedures in an isotope-free and protein-specific antibody-free manner.

Here we present a modified CLIP-seq protocol called FbioCLIP-seq with FLAG-biotin tandem purification to determine the RNA targets of RNA-binding proteins (RBPs) in mammalian cells.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis by antibiotics and during nascent polypeptide synthesis. Some of these antibiotics, and regulatory nascent polypeptides mostly in the form of peptidyl-tRNAs, inhibit either peptide bond formation or translation termination1-7. These inhibitory events can stop the movement of the ribosome, a phenomenon termed "translational arrest". Translation arrest induced by either an antibiotic or a nascent polypeptide has been shown to regulate the expression of genes involved in diverse cellular functions such as cell growth, antibiotic resistance, protein translocation and cell metabolism8-13. Knowledge of how antibiotics and regulatory nascent polypeptides alter ribosome function is essential if we are to understand the complete role of the ribosome in translation, in every organism.
Here, we describe a simple methodology that can be used to purify, exclusively, for analysis, those ribosomes translating a specific mRNA and containing a specific peptidyl-tRNA14. This procedure is based on selective isolation of translating ribosomes bound to a biotin-labeled mRNA. These translational complexes are separated from other ribosomes in the same mixture, using streptavidin paramagnetic beads (SMB) and a magnetic field (MF). Biotin-labeled mRNAs are synthesized by run-off transcription assays using as templates PCR-generated DNA fragments that contain T7 transcriptional promoters. T7 RNA polymerase incorporates biotin-16-UMP from biotin-UTP; under our conditions approximately ten biotin-16-UMP molecules are incorporated in a 600 nt mRNA with a 25% UMP content. These biotin-labeled mRNAs are then isolated, and used in in vitro translation assays performed with release factor 2 (RF2)-depleted cell-free extracts obtained from Escherichia coli strains containing wild type or mutant ribosomes. Ribosomes translating the biotin-labeled mRNA sequences are stalled at the stop codon region, due to the absence of the RF2 protein, which normally accomplishes translation termination. Stalled ribosomes containing the newly synthesized peptidyl-tRNA are isolated and removed from the translation reactions using SMB and an MF. These beads only bind biotin-containing messages.
The isolated, translational complexes, can be used to analyze the structural and functional features of wild type or mutant ribosomal components, or peptidyl-tRNA sequences, as well as determining ribosome interaction with antibiotics or other molecular factors 1,14-16. To examine the function of these isolated ribosome complexes, peptidyl-transferase assays can be performed in the presence of the antibiotic puromycin1. To study structural changes in translational complexes, well established procedures can be used, such as i) crosslinking to specific amino acids14 and/or ii) alkylation protection assays1,14,17.

A major impediment to biochemical analyses of ribosomes containing nascent peptidyl-tRNAs has been the presence of other ribosomes in the same samples, ribosomes not involved in the translation of the specific mRNA sequence being analyzed. We developed a simple methodology to purify, exclusively, the ribosomes containing the nascent peptidyl-tRNA of interest.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

זיהוי של חלבונים קושרי RNA על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; RNA הנפתח ב adipocyte תרבות

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...