Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione Swiss National Science Foundation Sinergia CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung e Zürich Krebsliga.

1. preparazione di frazione delle proteine citosoliche e nucleari
<ol><li>Piatto 4 x 106 ACC-MESO-4 cellule in un matraccio di cultura cellulare T150 coltivate in RPMI - 1640 medio completati con 10% FBS, 1 x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM L-Glutammina (200 mM). Quando le cellule raggiungono una confluenza di 80-90% (~5-5.5 x 106 cellule), procedere con estrazione della proteina della frazione citosolica e nucleare. Nota: ACC-MESO-4 linea cellulare è stata ottenuta dal RIKEN BioResource centro11.</li>
	<li>Medio di aspirare, lavare le cellule con l'aggiunta di 15 mL di PBS 1X, inclinare il piatto delicatamente un paio di volte e aspirare il PBS 1X. Aggiungere 3 mL di 0,25% tripsina-EDTA e incubare la beuta di coltura a 37 ° C per 3 min. Nota: Esaminare le cellule sotto il microscopio per distacco; Se ancora attaccato tocca il pallone contro il palmo di una mano 3 volte.</li>
	<li>Aggiungere 7 mL di RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 1x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM L-Glutammina (200 mM), raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e spin giù a 200 x g per 5 min.</li>
	<li>Aspirare il medio e risospendere il pellet cellulare con 1,5 mL di 1X PBS, quindi trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Rotazione verso il basso a 500 x g e a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante. Nota: Da questo punto in poi, eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 4 ° C e mantenere tutti i reagenti sul ghiaccio.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare con gelida 1,5 mL di 1X PBS e spin-down le cellule a 500 x g e a 4 ° C per 3 min. scartare il surnatante. Nota: Le quantità necessarie di CER I, CER II e reagenti NER sono 10, 0.55 e 5 volumi di pellet cellulare stimato pranzo volume, rispettivamente; il seguente protocollo presuppone un volume di 20 µ l. Si consiglia di preparare solo la quantità necessaria di reagente CER io.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di reagente di estrazione citoplasmico ghiacciata (CER mi) completati con 2 µ l di 1x inibitore della proteinasi, ad es., diluire 1 compressa dell'inibitore di proteasi (privo di EDTA) in 500 µ l di acqua per ottenere stock x 100. Questa quantità di reagente CER basterà lisare 20 µ l di un pellet cellulare imballato volume.<ol>
<li>Per stimare il volume di pellet imballato delle cellule, confrontare la provetta contenente il pellet cellulare con un tubo di 1,5 mL riempito con 10, 20, 50 o 100 µ l di PBS 1X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare vigorosamente nel Vortex il tubo per 15 s e incubare la provetta in ghiaccio per 10 min aggiungere 11 µ l di reagente di estrazione citoplasmico ghiacciata II (CER II) al tubo, vigorosamente vortex per 5 s e incubare 1 min sul ghiaccio.</li>
	<li>Agitare vigorosamente per 5 s e centrifugare la provetta a 16.000 x g e 4 ° C per 5 min. trasferire il surnatante nella provetta pre-refrigerata pulita sul ghiaccio. Il supernatante è la frazione citoplasmatica che è ulteriormente utilizzato nell'esperimento RNA-pulldown.</li>
	<li>Risospendere in 100 µ l di reagente di estrazione nucleare ghiacciata (NER) completati con 1 µ l di inibitore della proteinasi (100x) e vigorosamente vortex per 15 s. Si consiglia di preparare solo la quantità necessaria di reagente NER completati con inibitori della proteasi.</li>
	<li>Incubare il campione in ghiaccio per 40 min con occasionali su vortex per 15 s (ogni 10 min).</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 16.000 x g per 10 min trasferimento il surnatante (questa è la frazione di proteina nucleare) in una provetta pulita pre-refrigerata.</li>
	<li>Procedere immediatamente misurando la concentrazione di proteine mediante il metodo bicinconinico (BCA) (Vedi Tabella materiali). Per controllare per la purezza della proteina di ogni frazione, eseguire immunoblotting (Figura 1) contro Poli ADP-ribosio polimerasi - PARP (rilevamento positivo solo nella frazione nucleare) e α-tubulina (rilevamento positivo solo nella frazione citosolica). Per la visualizzazione di proteine, fare riferimento alla sezione 4.</li>
	<li>Al fine di mantenere l'attività della proteina e loro stato nativo, preparare 25 µ l di aliquote di estratti citosolici e nucleari. Snap-congelare queste aliquote ponendoli in azoto liquido per 5 s e direttamente a-80 ° C.</li>
</ol>2. etichettatura di RNA con Desthiobiotin
<ol><li>Le sonde del RNA sintetizzato commercialmente e HPLC purificato. Risospendere con acqua priva di nucleasi a 10 µM. Nota: La sonda sequenze sono elencati nella tabella 1.</li>
	<li>Utilizzare 50 pmoli di RNA per reazione di RNA-pulldown. Scongelare e conservare tutti i reagenti su ghiaccio tranne per PEG 30%, utilizzato con etichetta 3' capolinea del RNA oligo.</li>
	<li>Trasferire 5 µ l di 10 µM le sonde del RNA, etichettato come CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) e nessuna relazione-RNA (IRE), in 0,5 mL a parete sottile microcentrifuga tubi e procedere all'incubazione in una macchina PCR a 85 ° C per 5 min. Posizionare i tubi immediatamente sul ghiaccio. Nota: Questo passaggio è importante, in quanto favorisce il rilassamento e l'accessibilità della sonda RNA per l'etichettatura.</li>
	<li>Per una singola reazione di 30 µ l, aggiungere alla provetta contenente RNA la seguente miscela di 10 µ l: 3 µ l di acqua libera nucleasi, 3 µ l di tampone di reazione ligasi di RNA, 1 µ l di RNAsi inibitore 10x (40 U / µ l), 1 µ l di Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 2 µ l di ligasi T4 RNA (20 U / µ l). Nota: Per preparare mix master A 3 campioni in eccesso (3.2), mescolare acqua gratuita, 9,6 µ l di tampone di reazione ligasi di RNA, 3,2 µ l di RNAsi inibitore 10x 9.6 µ l di nucleasi (40 U / µ l), 3,2 µ l di Desthiobiotinylated citidina bisfosfato (1 mM) e 6,4 µ l della ligasi T4 RNA (20 U / µ l).</li>
	<li>Aggiungere attentamente 15 µ l di PEG 30% alla reazione. Utilizzare un altro suggerimento per mescolare la reazione. Incubare la reazione durante la notte a 16 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo, preparare quanto segue: 5 M di NaCl (fresco/nucleasi-free), cloroformio: alcool isoamilico in rapporto 24:1 (ad esempio, per reazione - 96 µ l cloroformio e 4 µ l di alcool isoamilico), ghiacciata 100% etanolo e ghiacciata etanolo al 70%.</li>
	<li>Aggiungere 70 µ l di acqua priva di nucleasi per le provette di reazione RNA-etichettatura. Aggiungere 100 µ l di cloroformio: isoamil alcool e agitare brevemente. Rallentamento a 13.000 x g per 3 minuti, rimuovere con attenzione solo la fase superiore e il trasferimento ad un nuovo tubo privo di nucleasi 1,5 mL; evitare di toccare la fase inferiore.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di 5m NaCl, 1 µ l di glicogeno e 300 µ l di etanolo al 100% ghiacciata. Posizionare il tubo a-20 ° C per 2 h. Nota: In questa fase, l'esperimento può essere continuato il giorno seguente.</li>
	<li>Centrifugare a 13.000 x g e a 4 ° C per 15 min., attentamente, scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 300 µ l di etanolo al 70% ghiacciata e centrifugare nuovamente a 13.000 x g e a 4 ° C per 5 min.</li>
	<li>Scartare il surnatante completamente e asciugare il pellet (15 min). Risospendere il pellet in 20 µ l di acqua priva di nucleasi. Nota: Procedere con RNA-pulldown nello stesso giorno.</li>
	<li>Incubare il RNA a 90 ° C per 2 min e metterli su ghiaccio. Mettere il RNA etichettati sul ghiaccio durante il passaggio seguente di prelavaggio dei branelli magnetici streptavidina. Nota: Un tempo di incubazione più lungo potrebbe danneggiare la sonda RNA.</li>
</ol>3. RNA-proteina Pulldown
<ol><li>
Prelavaggio biglie streptavidin-magnetiche e incubazione con desthiobiotin-RNA
	<ol>
<li>Utilizzare 50 µ l di streptavidina perline magnetico per 50 pmol RNA. Tuttavia, questo dovrebbe essere ottimizzato a seconda dell'esperimento.</li>
		<li>Vortice il tubo con perline streptavidina-magnetiche per 15 s e rapidamente rimuovere 200 µ l (mix master; abbastanza per reazioni di 3 + 1) in un tubo di sicurezza bloccaggio pulito 1,5 mL utilizzando taglia punte di pipetta. Posizionare il tubo su un supporto magnetico in modo che le perline raccolgono sul lato del tubo e attendere 1 minuto Rimuovi il liquido di risospensione.</li>
		<li>Lavare le perle, togliere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 400 µ l di 0.1 M NaOH 0,05 M NaCl soluzione e delicatamente dispensare su e giù più volte. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico. Attendere 1 minuto e raccogliere il surnatante. Ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Lavare le perle con 200 µ l di NaCl 100 mM. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di 20 mM Tris (pH 7.5), risospendere perline pipettando, posizionare il tubo sul supporto magnetico, attendere per 1 min e rimuovere il surnatante. Ripetere il passaggio.</li>
		<li>Togliere il tubo dal supporto magnetico, aggiungere 200 µ l di buffer di acquisizione di RNA: 1x e risospendere le microsfere magnetiche streptavidina brevemente nel Vortex. Rimuovere 50 µ l di biglie magnetiche streptavidina e aggiungere ad ogni provetta etichettata-RNA utilizzando un puntale di taglio. Incubare le provette per 30 min a temperatura ambiente su un rullo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Grippaggio della proteina al RNA
	<ol>
<li>Disporre le provette in un supporto magnetico, attendere 1 min e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di 20 mM Tris (pH 7,5) ai talloni e risospendere pipettando. Disporre le provette in un supporto magnetico, attendere 1 min e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di legame proteina-RNA 1x ai talloni e risospendere pipettando.</li>
		<li>Nel frattempo, preparare la seguente miscela: 10 µ l di 10x buffer obbligatorio della proteina-RNA, 30 µ l di glicerolo al 50%, 50 µ g di proteine citoplasmatiche e nucleasi-free fino a 100 µ l di acqua. Nota: Preparare mix master B per 3 campioni in eccesso (3.3) come segue: 33 µ l di tampone di legame proteina-RNA 10x, 99 µ l di glicerolo al 50%, 165 µ g di proteine citoplasmatiche e acqua priva di nucleasi fino a 330 µ l. tenere il tubo di mix master B sul ghiaccio.</li>
		<li>Inserire i tubi di supporto magnetico, attendere 1 minuto e raccogliere il surnatante. Aggiungere 100 µ l di master mix B, risospendere pipettando delicatamente su e giù ed evitare di creare bolle. Incubare le provette di reazione per 60 min a 4 ° C su un rullo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavaggio ed eluizione
	<ol>
<li>Disporre le provette in un supporto magnetico, raccogliere il surnatante (che è il flusso attraverso - FT) e trasferire in una nuova provetta. Nota: Mantenere questa FT sul ghiaccio per un'analisi successiva.</li>
		<li>Pipettare 100 µ l di tampone di lavaggio sui branelli: 1x, Risospendere delicatamente, rimettere il supporto magnetico, attendere 1 minuto e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio 2 volte.</li>
		<li>Aggiungere 40 µ l di tampone di eluizione ai branelli magnetici, Miscelare pipettando su e giù e incubare a 37 ° C in un agitatore di tubo (950 giri/min) per 30 min.</li>
		<li>Posizionare i tubi in un supporto magnetico, attendere 1 minuto e raccogliere eluito campione (che è eluito - E). Posizionare sul ghiaccio e utilizzare per analisi a valle. Nota: In questa fase, ogni testata sonda RNA consiste di un flusso continuo (FT) e campione eluito (E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analisi della macchia occidentale e poliacrilammide elettroforesi
Nota: Vedere la tabella 2 per le ricette per i buffer utilizzati in questa sezione. Eseguire un Western blot secondo il metodo di Laemmli12.
<ol><li>Handcast 12% gel di SDS-PAGE (10-pozzi, spessore 1,5 mm., 66 µ l). Preparare una miscela di gel in esecuzione: 4 mL di soluzione madre di 30% acrilammide-bisacrylamide, 2,4 mL di Tris più basso del buffer, 3,2 mL di dH2O, 9,6 µ l di TEMED, 96 µ l di soluzione di 10% ammonio persolfato (APS). Preparare la miscela di gel di impilamento: 3,25 mL di dH2O, 0,5 mL di 30% acrilammide - soluzione bisacrylamide, 1,3 mL di tampone Tris superiore, 10 µ l di TEMED, 20 µ l di 10% di APS.</li>
	<li>Aggiungere 16,6 µ l di tampone x Laemmli 6 (ad esempio, 14 mL a pH 6.8 Tris/HCl/SDS (tampone Tris superiore), 2 g di SDS, 1,86 g di DTT, 6 mL di glicerolo e 0.012% bromofenolo; conservati a-20 ° C) nel campione FT e 6,6 µ l del 6 x Laemmli buffer nel campione E. Incubare i campioni per 5 min a 95 ° C.</li>
	<li>Caricare i campioni (20 µ l di FT e intera eluire ~ 40 µ l) ed eseguirli per 30 min a 60 V, continuando con 20 V durante la notte.</li>
	<li>Utilizzando un sistema semi-secco electroblotting, trasferire proteine su una membrana PVDF per 80 minuti a 15 V. Nota: La membrana PVDF deve essere attivata prima di eseguire il trasferimento di proteine. Incubare la membrana in metanolo al 100% per 1 min, seguita da un'incubazione di 2 min in acqua ultrapura.</li>
	<li>Dopo il trasferimento di proteine, incubare il gel di SDS-PAGE con Coomassie soluzione per 3 h, seguito da tre fasi di lavaggio con acqua ultrapura, ogni 30 min.</li>
	<li>Alla fine del trasferimento di proteina, lasciate la membrana PVDF asciugare per 1 h. riattivare la membrana come indicato al punto 4.5. Bloccare la membrana 1 h con 5% BSA in 1 x TTBS.</li>
	<li>Incubare la membrana con il primo anticorpo: HuR o mesotelina, entrambi diluiti 1: 1000 in 5% BSA in 1 x TTBS per 4 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare la membrana tre volte per 7 min in 1 x TTBS e incubare coniglio anti-topo alla perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo secondario coniugato diluito 1: 10.000 in 5% BSA, 1 x TTBS.</li>
	<li>Visualizzare le proteine usando chemiluminescenza e un dispositivo di imaging digitale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation.">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress:+a+matter+of+survival.">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li><li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AREsite2:+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU/GU/U-rich+elements.">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li><li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma.">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biotin-(strept)avidin+system:+principles+and+applications+in+biotechnology.">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+Uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>. Magnetic bead technology for better assay development Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013)</li><li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients.">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis/transport+of+nuclear+ferritin+RNAs.">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li><li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+function+in+disease.">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+regulatory+RNA.">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li><li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

3' UTR appartengono al genoma non codificante3e tutti gli RNA non codificanti possa interagire con proteine al fine di esercitare la loro funzione7. Quando il genoma dei mammiferi è stato trovato per essere trascritto pervasively e prodotto una porzione significativa di lunghi non codificanti RNA16, emergenti evidenze hanno dimostrato che questi RNA non codificante lungo funzionano nella regolazione dell'espressione genica come essi interagiscono co...

Espressione genica e il livello finale del prodotto del gene può essere strettamente regolate che interessano la stabilità del mRNA e mRNA traduzione tasso1. Questi meccanismi di regolazione post-trascrizionali sono esercitati attraverso le interazioni di non codificanti proteine RNA e/o RNA-binding (RBPs) con mRNA mirati. È solitamente la regione non tradotta 3' del mRNA (3' UTR - appartenendo alla parte non codificante del genoma2) che contiene specifiche cis-elementi regolatori (CRE), che sono riconosciuti da trans-in qualità di fattori quali miRNA o RBPs 3. la migliore studiati cis-elemento all'interno di 3' UTR, è il motivo di elemento ricco di adenina (ARE), che è riconosciuto da specifiche proteine che legano il AU (AUBP) e, a sua volta, induce la degradazione sia mRNA/deadenylation (decadimento sono-mediata) o mRNA stabilizzazione4.
La dimensione del 3' UTR di calretinina mRNA (CALB2) è 573 bp lungo e contiene un pentamero AUUUA putativo, come predetto da AREsite2, un tool di bioinformatic5. Coerente con la presenza di un motivo sono presunto, l'analisi di vettore-reporter di pmirGLO ha dimostrato un ruolo di stabilizzazione di questo elemento all'interno di mRNA di CALB26. Infine, l' in vitro RNA-pulldown è stato utilizzato per identificare il AUBP che stabilizza calretinina mRNA attraverso il motivo sono.
Poiché tutti gli RNA non codificanti interagisce con proteine7, lo in vitro RNA-pulldown è un buon modo e analisi prima della scelta per l'identificazione di interattori di RNA per aiutare a decifrare i meccanismi molecolari. In questo metodo di RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA, che sono state etichettate con una forma modificata di biotina (desthiobiotin) all'estremità 3' del filamento di RNA, sono state utilizzate. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con l'associazione-RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Tali RNA-proteine vengono eluite dai branelli magnetici, eseguire attraverso un gel di SDS-PAGE 12%, trasferito ad una membrana e sondato con anticorpi differenti.
Nella procedura di purificazione di affinità standard streptavidina-biotina, denaturazione dura condizioni sono necessarie per interrompere il legame biotina-streptavidina irreversibile forte per eluire le proteine rilegate8, che potrebbe portare alla dissociazione di complessi proteici. A differenza di biotina, desthiobiotin reversibilmente si lega alla streptavidina e competitivo è spostata con una soluzione tamponata di biotina, consentendo per la delicata eluizione delle proteine ed evitando l'isolamento di naturalmente biotinilati molecole9, suggerendo che la tecnica è ideale per isolare i complessi della proteina nativa in condizioni native.
In vitro condizioni vincolanti e rigore, che sono determinate dalla concentrazione salina, agenti riducenti e percentuale di detergente, dovrebbe essere vicine a quelle presenti nel contesto del cellulare al fine di identificare le interazioni vere in vivo . Le condizioni di associazione implementate nel presente documento sono state dimostrate in precedenza come appropriato per l'identificazione del HuR come un AU-binding protein10. Questo approccio potrebbe risparmiare tempo, poiché l'ottimizzazione delle condizioni di associazione corretto può essere lungo e impegnativo. Inoltre, questo metodo potrebbe essere usato come un protocollo di partenza per qualsiasi esperimento di RNA-pulldown e può essere ottimizzato gradualmente cambiando la concentrazione di sali e detergenti, modificando la percentuale di glicerolo, e aggiungendo altri sali. Inoltre, abbiamo dimostrato che anche una breve 25 nucleotidi RNA-sonda che harboring un pentamero sono-motivo poteva essere utilizzato per dimostrare l'interazione con un AUBP specifico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:124px;">78833</td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20164</td>
			<td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pierce RNA 3&#8217; End Desthiobiotinylation Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20163</td>
			<td style="width:468px;">The kit is a part of the &#34;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#34;, and needs to be stored at -20 &#176;C unlike the pull-down kit (4 &#176;C).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2,&#160; magnetic stand</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:453px;">Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td style="width:468px;">The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - &#945; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td style="width:124px;">8035</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&#160;</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>200-301-A87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:295px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:124px;">7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary rabbit anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A-9044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RPMI - 1640 medium</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FBS - Filtrated Bovine Serum</td>
			<td style="width:295px;">Pan Biotech&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin - streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">L-Glutamine solution (200 mM)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:295px;">Gibco by Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:124px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN 3 Cell</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini Protean System Glass Plates&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &#181;L</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1658050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:453px;">Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td>
			<td style="width:295px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">3029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">20% SDS&#160;</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td>A3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:124px;">NEF1002</td>
			<td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FusionFX&#160; Digital Imager</td>
			<td style="width:295px;">Vilber</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNA oligo synthesis</td>
			<td style="width:295px;">Mycrosynth AG, Switzerland</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td>the synthesis scale - 0.04 &#181;mol - HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">182883.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Glycerol&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td>50% sterile aliquots to be stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:453px;">Pierce Streptavidin magnetic beads&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">88817</td>
			<td style="width:468px;">Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &#181;m (range from 0.5 - 1.5 &#181;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &#181;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">TEMED</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ammonium persulfate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coomassie G-250</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A3480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">368458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ortho-phosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A0637</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

Lo in vitro RNA-pulldown è ancora largamente utilizzato nei primi passi di protocolli volti ad identificare RNA-binding proteins che riconoscere specifici RNA strutture e motivi. In questo protocollo RNA-pulldown, commercialmente sintetizzato le sonde del RNA sono etichettate con una forma modificata di biotina, desthiobiotin, all'estremità 3' del filamento di RNA, che si lega reversibilmente al streptavidina e permette così di eluizione delle proteine sotto più fisiologico condizioni. il RNA-desthiobiotin è immobilizzato tramite interazione con streptavidina su biglie magnetiche, che vengono utilizzati per abbattere le proteine che interagiscono specificamente con il RNA di interesse. Proteine non denaturate e attive da frazione citosolica delle cellule di mesotelioma sono utilizzate come fonte di proteine. Il metodo qui descritto può essere applicato per rilevare l'interazione tra proteine RNA associazione di note e una sonda 25 nucleotidi (nt) lunga RNA contenente una sequenza di interesse. Questo è utile per completare la caratterizzazione funzionale di stabilizzare o destabilizzare gli elementi presenti nelle molecole di RNA ottenute utilizzando un'analisi di vettore reporter.

In questo esperimento, un frammento lungo 25-nt di calretinin 3' UTR harboring sono motivo (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt) è stato utilizzato per verificare se si lega specificamente alla proteina umana-antigene R (HuR), un noto stabilizzatore di mRNA. Per verificare la specificità dell'elemento sono, un RNA 25-nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) contenente una mutazione sono-motivo, che precedentemente è stata indicata ad abolire l'effetto di stabilizzazione del motivo sono, era usato<sup class=...

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Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma

Desthiobiotin etichettatura di un sintetico oligo RNA 25 nucleotidi, che contiene un motivo di elemento ricco di adenina (ARE), permette di grippaggio specifico di proteina citosolica sono vincolanti.

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.9K Views.  University Hospital Zurich. Desthiobiotin etichettatura di un sintetico oligo RNA 25 nucleotidi, che contiene un motivo di elemento ricco di adenina (ARE), permette di grippaggio specifico di proteina citosolica sono vincolanti.

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Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential anti-cancer drugs. Multicellular tumor spheroids (MCTSes) effectively mimic the physiological conditions of solid tumors, making them excellent in vitro models for lead optimization and target validation. Out of the various techniques available for MCTS culture, the liquid-overlay method on agarose is one of the most inexpensive methods for MCTS generation. However, the reliable transfer of MCTS cultures using liquid-overlay for high-throughput screening may be compromised by a number of limitations, including the coating of microtiter plates (MPs) with agarose and the irreproducibility of uniform MCTS formation across wells. MPs are significantly prone to edge effects that result from excessive evaporation of medium from the exterior of the plate, preventing the use of the entire plate for drug tests. This manuscript provides detailed technical improvements to the liquid-overlay technique to increase the scalability and reproducibility of uniform MCTS formation. Additionally, details on a simple, semi-automatic, and universally applicable software tool for the evaluation of MCTS features after drug treatment is presented.

The uneven loss of medium from microtiter plates affects the reproducibility of uniform multicellular tumor spheroid formation. Improving culture conditions to reduce significant medium loss will improve the reproducibility of spheroid formation and the results of spheroid-based assays using the liquid-overlay technique.

Evaporazione di riduzione Cultura Condizione Aumenta la riproducibilità dei multicellulare Spheroid Formazione in micropiastre

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

Un modello murino preclinico di Osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

Valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base mediati da CRISPR

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as drug resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and metastasis. Intratumoral eATP is 103 to 104 times higher in concentration than in normal tissues. While eATP functions as a messenger to activate purinergic signaling for EMT induction, it is also internalized by cancer cells through upregulated macropinocytosis, a specific type of endocytosis, to perform a wide variety of biological functions. These functions include providing energy to ATP-requiring biochemical reactions, donating phosphate groups during signal transduction, and facilitating or accelerating gene expression as a transcriptional cofactor. ATP is readily available, and its study in cancer and other fields will undoubtedly increase. However, eATP study remains at an early stage, and unresolved questions remain unanswered before the important and versatile activities played by eATP and internalized intracellular ATP can be fully unraveled.
These authors&#39; laboratories&#39; contributions to these early eATP studies include microscopic imaging of non-hydrolysable fluorescent ATP, coupled with high- and low-molecular weight fluorescent dextrans, which serve as macropinocytosis and endocytosis tracers, as well as various endocytosis inhibitors, to monitor and characterize the eATP internalization process. This imaging modality was applied to tumor cell lines and to immunodeficient mice, xenografted with human cancer tumors, to study eATP internalization in vitro and in vivo. This paper describes these in vitro and in vivo protocols, with an emphasis on modifying and finetuning assay conditions so that the macropinocytosis-/endocytosis-mediated eATP internalization assays can be successfully performed in different systems.

We developed a reproducible method to visualize the internalization of nonhydrolyzable fluorescent adenosine triphosphate (ATP), an ATP surrogate, with high cellular resolution. We validated our method using independent in vitro and in vivo assays-human tumor cell lines and immunodeficient mice xenografted with human tumor tissue.

Microscopia a fluorescenza per l'internalizzazione dell'ATP mediata dalla macropinocitosi in cellule tumorali umane e topi xenotrapiantati da tumore

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary tumor cells from surgically resected, malignant pleural mesothelioma (MPM) by providing a complete overview of the process from digestion to enrichment, expansion, cryopreservation, and phenotypic characterization. In addition, this protocol introduces concepts for tumor generation that may be useful for multiple tumor types such as differential trypsinization and the impact of dissociation methods on the detection of cell surface markers for phenotypic characterization. The major limitation of this study is the selection of tumor cells that will expand in a two-dimensional (2D) culture system. Variations to this protocol, including three-dimensional (3D) culture systems, media supplements, plate coating to improve adhesion, and alternate disaggregation methods, could improve this technique and the overall success rate of establishing a tumor line. Overall, this protocol provides a base method for establishing and characterizing tumor cells from this rare tumor.

The goal of this method paper is to demonstrate a robust and reproducible methodology for the enrichment, generation, and expansion of primary tumor cell lines from surgically resected pleural mesothelioma.

Generazione ed espansione delle linee tumorali primarie e maligne del mesotelioma pleurico

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Ex Vivo Modello organoide delle delezioni geniche mediate da Adenovirus-Cre in cellule uroteliali di topo

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...