Bu eser İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung ve Zürih Krebsliga tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması sitozolik ve nükleer Protein fraksiyonu
<ol><li>Plaka 4 x 106 ACC-MESO-4 hücreleri RPMI - 1640 orta yetiştirilen bir T150 hücre kültür şişeye %10 FBS, 1 x penisilin/streptomisin (100 x) ve 2 mM L-glutamin (200 mM) ile desteklenmiştir. Hücrelerin % 80-90 (~5-5.5 x 106 hücreler) bir izdiham ulaştığınızda, nükleer ve sitozolik kesir protein çıkarılması ile devam edin. Not: ACC-MESO-4 hücre kültürünü RIKEN BioResource Merkezi11' den elde edildi.</li>
	<li>Orta Aspire edin, hücreleri 15 mL 1 x PBS ekleyerek yıkama, plaka birkaç kez hafifçe eğimli ve 1 x PBS Aspire edin. 3 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA ve kültür şişesi 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Not: dekolmanı için mikroskop altında hücreleri bakın; Eğer hala dokunun bağlı 3 avucunun karşı şişeye kez.</li>
	<li>%10 FBS, 1 x penisilin/streptomisin (100 x) ve 2 mM L-glutamin (200 mM) ile RPMI-1640 Orta 7 mL ekleyin, bir 15 mL tüp hücrelerde toplamak ve spin aşağı 200 x g 5 min için de.</li>
	<li>Orta Aspire edin ve hücre Pelet 1,5 mL 1 x PBS ile resuspend sonra hücreleri 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Spin aşağı vasıl 500 x g ve 4 ° C 5 dk. atma süpernatant. Not: Bu adım ileriye doğru 4 ° C'de tüm Santrifüjü adımlarını gerçekleştirin ve buz üzerinde tüm reaktifler tutmak.</li>
	<li>Hücre Pelet buz gibi 1.5 mL 1 x PBS ile resuspend ve 500 x g ve 4 ° C'de 3 dakika süreyle hücreleri aşağı spin süpernatant atın. Not: Ben, CER II ve NER Kimyasalları 10, 0,55 ve 5 cilt cilt, sırasıyla Paketli tahmini hücre Pelet CER gerekli miktarda vardır; Aşağıdaki protokol 20 µL hacmi varsayar. Biz sadece reaktif CER gerekli miktarda hazırlanması tavsiye ben.</li>
	<li>Buz gibi sitoplazmik ayıklama reaktif 200 µL ekleyin (CER ben) 1 x İndinavir inhibitörü, örneğin, 2 µL ile takıma proteaz inhibitörü (EDTA içermeyen) 1 tablet 500 µL 100 x hisse senedi almak için su içinde seyreltik. Bu miktar reaktif CER ben da birim Paketli bir hücre Pelet 20 µL koşullar için yeterlidir.<ol>
<li>Hücre Paketli Pelet birim tahmin etmek için 1 x PBS 10, 20, 50 veya 100 µL ile dolu 1.5 mL tüp ile hücre Pelet içeren tüp karşılaştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre pelet tarafından şiddetle vortexing 15 için tüp resuspend s ve buz için 10 dk. 11 eklemek µL buz gibi sitoplazmik ayıklama reaktif II (CER II) tüp, 5 için şiddetle girdap tüp kuluçkaya s ve 1dk buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Şiddetle için 5 s ve santrifüj tüpü 16.000 g x, girdap ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle Transfer süpernatant temiz önceden soğutulmuş tüp buz üzerinde. Daha fazla sitoplazmik kesir süpernatant olduğunu RNA-açılan deneyde kullanılan.</li>
	<li>1 µL İndinavir inhibitörü (100 x) ve şiddetle 15 için girdap ile takıma kalan Pelet 100 µL buz gibi nükleer ayıklama reaktif (NER) içinde resuspend s. Proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş NER reaktif yalnızca gerekli miktarda hazırlanması tavsiye ediyoruz.</li>
	<li>Örnek zaman zaman vortexing 15 ile 40 dakika buz üzerinde kuluçkaya s (her 10 min).</li>
	<li>Tüp 16. 000 x g 10 dk. Transfer için de (bu nükleer protein fraksiyonu) süpernatant temiz bir önceden soğutulmuş tüp santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hemen bicinchoninic (BCA) yöntemini kullanarak protein konsantrasyonu ölçerek devam ( Tablo malzemelerigörmek). Her kesir protein saflık için denetlemek için α-tübülin (sitozolik kesir pozitif algılamasını sadece) ve poli ADP-riboz polimeraz - PARP (nükleer kesir pozitif algılamasını sadece) karşı immunoblotting (şekil 1) gerçekleştirin. Protein görselleştirme için 4 bölümüne bakın.</li>
	<li>Protein etkinlik ve yerel durumlarına tutmak için aliquots sitozolik ve nükleer özler 25 µL hazırlayın. Ek-bu aliquots donma 5 s ve-80 ° C'de doğrudan mağaza için sıvı azot yerleştirerek</li>
</ol>2. RNA Desthiobiotin ile etiketleme
<ol><li>Ticari olarak sentezlenmiş RNA probları ve saf HPLC hakkına sahiptir. Nükleaz ücretsiz su 10 µM ile resuspend. Not: Sonda dizileri Tablo 1' de listelenmiştir.</li>
	<li>RNA, RNA-açılan tepki başına 50 pmol kullanın. Çözülme ve tüm reaktifler için % 30, etiket 3' terminus için RNA oligo, kullanılan PEG dışında buz üzerinde tutun.</li>
	<li>CALB2 3' UTR (vardır) etiketli 10 µM RNA probları 5 µL transfer, CALB2 3' UTR (mtARE) ve ilgisiz-RNA (IRE), 0,5 mL ince duvar microcentrifuge içine borular ve PCR makinesi 85 ° C'de 5 dk. yerleştirmek için tüpler hemen buz üzerinde kuluçkaya. Not: gevşeme ve etiketleme için RNA sonda erişilebilirliğini teşvik gibi bu adım önemlidir.</li>
	<li>Bir tek 30 µL tepki için aşağıdaki 10 µL karıştırmak için RNA içeren tüp ekleyin: nükleaz boş su 3 µL, 10 RNA ligaz tepki arabellek, RNase inhibitörü 1 µL x 3 µL (40 U/µL), Desthiobiotinylated sitidin Bisphosphate (1 mM) 1 µL ve T4 RNA ligaz (20 U/µL) 2 µL. Not: Ana mix A aşırı (3.2) 3 örnekleri hazırlamak için 9.6 µL nükleaz, ücretsiz su, 10 RNA ligaz tepki arabellek, RNase inhibitörü 3.2 µL x 9,6 µL mix (40 U/µL), 3.2 µL Desthiobiotinylated sitidin Bisphosphate (1 mM) ve T4 RNA ligaz (20 U/µL) 6.4 µL.</li>
	<li>Dikkatle 15 µL PEG tepki için % 30 ekleyin. Başka bir ipucu tepki karıştırmak için kullanın. Gecede 16 ° C'de tepki kuluçkaya</li>
	<li>Ertesi gün, aşağıdaki hazırlamak: 5 M NaCl (taze/nükleaz-free), kloroform: 24:1 oranında (örneğin, tepki - 96 µL kloroform ve izoamil alkol 4 µL başına), izoamil alkol buz gibi % 100 etanol ve buz gibi % 70 etanol.</li>
	<li>Nükleaz ücretsiz su 70 µL RNA etiketleme tepki tüpler için ekleyin. Kloroform 100 µL ekleyin: izoamil alkol ve girdap kısaca. Spin aşağı de 13.000 x g 3 dk. dikkatli bir şekilde çıkarın için yalnızca üst aşaması ve aktarımı için yeni bir 1,5 mL nükleaz ücretsiz tüp; daha düşük faz dokunmaktan kaçının.</li>
	<li>5 M NaCl, glikojen 1 µL ve buz gibi % 100 etanol 300 µL 10 µL ekleyin. -20 ° c 2 h için tüpü yerleştirin. Not: Bu adımda, ertesi gün deneme devam edilebilir.</li>
	<li>13.000 g x ve 4 ° C de 15 dakika süreyle santrifüj dikkatli atmak süpernatant Pelet bozmadan. Buz gibi % 70 etanol ve santrifüj 13.000 x g ve 4 ° C tekrar 5 min için 300 µL ekleyin.</li>
	<li>Tamamen süpernatant atın ve Pelet (15 dk) kuruması. Pelet nükleaz ücretsiz su 20 µL içinde resuspend. Not: Aynı gün RNA-açılan ile devam edin.</li>
	<li>2 dk 90 ° C'de RNA kuluçkaya ve Buza koyun. Etiketli RNA streptavidin manyetik boncuklar ön yıkama aşağıdaki adımı sırasında Buza koyun. Not: Daha uzun bir kuluçka süresi RNA sonda zarar verebilir.</li>
</ol>3. RNA-Protein açılan
<ol><li>
Streptavidin manyetik boncuklar ve kuluçka desthiobiotin-RNA ile ön yıkama
	<ol>
<li>Streptavidin manyetik boncuklar 50 pmol RNA başına 50 µL kullanın. Ancak, bu deney bağlı olarak optimize edilmelidir.</li>
		<li>Girdap 15 s ve hızlı bir şekilde temiz 1.5 mL kullanarak güvenli kilit tüp içine Kaldır 200 µL (ana mix; 3 + 1 reaksiyonlar için yeterli) için streptavidin manyetik boncuklar ile tüp pipet ipuçları kesmek. Tüp manyetik bir stand üzerine boncuk tüp tarafında toplamak ve 1 dk. Kaldır resuspension sıvı bekleyin yerleştirin.</li>
		<li>Boncuk yıkamak için manyetik standından tüpü çıkarması, 0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl çözüm ve hafifçe yukarı ve aşağı birkaç kez damlalıklı 400 µL ekleyin. Tüp manyetik sandalyesine koyun. 1 dk bekleyin ve süpernatant toplamak. Yine bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Boncuk 200 µL 100 mm NaCl ile yıkayın. Süpernatant kaldırın.</li>
		<li>200 µL 20 mm Tris (pH 7.5), boncuk pipetting tarafından resuspend, tüp manyetik kürsüye getirin, için 1 dakika bekleyin ve süpernatant kaldırmak ekleyin. Adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Manyetik standından tüpü çıkarması, RNA yakalama arabelleğinin x 1 200 µL eklemek ve streptavidin manyetik boncuklar kısaca vortexing tarafından resuspend. Streptavidin manyetik boncuklar 50 µL kaldırın ve her etiketli-RNA tüp kesme pipet ucu kullanarak ekleyin. Tüpler, oda sıcaklığında bir rulo üzerinde 30 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bağlayıcı protein RNA
	<ol>
<li>Tüpler manyetik bir stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant kaldırın.</li>
		<li>20 mm Tris (pH 7.5) 50 µL için boncuk ekleyin ve pipetting tarafından resuspend. Tüpler manyetik bir stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant kaldırın. Bu adımı yineleyin.</li>
		<li>1 Protein-RNA bağlama arabellek x 100 µL için boncuk ekleyin ve pipetting tarafından resuspend.</li>
		<li>Bu arada, aşağıdaki karışımı hazırlayın: 10 x Protein-RNA bağlama arabellek, % 50 gliserol 30 µL, 50 µg sitoplazmik proteinlerin ve nükleaz ücretsiz 10 µL su 100 µL. Not: Ana mix B aşırı (3,3) 3 örnekleri aşağıdaki gibi hazırlamak: 10 Protein-RNA bağlama arabellek x 33 µL, 99 µL % 50 gliserol, sitoplazmik protein ve nükleaz ücretsiz su kadar 330 µL. 165 µg tutmak ana mix B buz üzerinde tüp.</li>
		<li>Tüpler manyetik stand içine koyun, 1 dk bekleyin ve süpernatant toplamak. Ana Mix B 100 µL eklemek, yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Reaksiyon tüpler bir rulo üzerinde 4 ° C'de 60 dk için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Çamaşır ve elüsyon
	<ol>
<li>Tüpler manyetik bir stand içine yerleştirin, (bu akışı - FT) süpernatant toplamak ve yeni bir tüp içine aktarın. Not: Bu FT daha sonraki analizler için buz üzerinde tutun.</li>
		<li>1 yıkama arabellek boncukları üzerinde x 100 µL pipet, hafifçe resuspend, manyetik stand içine koy, 1 dk bekleyin ve süpernatant atmak. Bu 2 kez tekrarlayın.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix ve 30 dk bir tüp shaker (950 devir/dakika) olarak 37 ° C'de kuluçkaya elüsyon arabelleği 40 µL manyetik boncuklar ekleyin.</li>
		<li>Tüpler manyetik bir stand içine yerleştirin, 1 dk bekleyin ve (Bu eluate - E) eluted örnek toplamak. Buz üzerinde ve aşağı akım analizi için kullanın. Not: Bu adımda, her test RNA sonda bir akışı aracılığıyla (FT) ve eluate (E) örnek oluşur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. polyacrylamide Elektroforez ve Western Blot analizi
Not: Bu bölümde kullanılan arabellekleri için yemek tarifleri için Tablo 2 bakın. Gerçekleştirmek bir Western blot Laemmli yöntemi12göre.
<ol><li>Handcast % 12 SDS-sayfa jelleri (10-wells, 1.5 mm rondela, 66 µL). Çalışan bir jel karışım hazırlamak: 4 mL % 30 Akrilamid-bisacrylamide stok çözeltisi, alt Tris 2.4 mL tampon, dH2O, TEMED, 96 µL % 10 amonyum persülfat çözüm (APS) 9.6 µL 3.2 mL. Yığın jel karışımı hazırlayın: 3.25 mL dH2O, % 30 Akrilamid - bisacrylamide hisse senedi çözüm, üst Tris arabelleği 1.3 mL 0.5 mL, TEMED, 20 µL % 10 10 µL APS.</li>
	<li>6 x Laemmli arabelleği 16.6 µL ekleyin (örneğin, 14 mL (üst Tris arabellek) Tris/HCl/SDS pH 6.8, SDS, DTT, 6 mL gliserol ve %0.012 bromophenol mavi; 1.86 g, 2 g-20 ° C'de depolanan) FT örnek ve 6 x Laemmli arabellek içine E örnek 6.6 µL içine. Örnekleri 95 ° C'de 5 min için kuluçkaya</li>
	<li>(20 µL FT ve bütün Elute ~ 40 µL) örnekleri yüklemek ve 30 dk 60 V, gecede 20 V ile devam için çalıştırabilirsiniz.</li>
	<li>Yarı kuru electroblotting sistemiyle, proteinler için 80 dk 15 V PVDF membran üzerine aktarın. Not: PVDF membran protein transferi yapmadan önce etkinleştirilmesi gerekir. % 100 metanol için 1 dakika, 2 dk kuluçka ultrasaf su ardından membran kuluçkaya.</li>
	<li>Protein transferden sonra SDS-sayfa jel ile Coomassie çözüm, her 30 dk ultrasaf su ile yıkama üç numaralı adımları takip 3 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Protein aktarımı sonunda 4.5 adımda gösterildiği gibi membran 1 h. yeniden etkinleştirmek için Kuru PVDF membran izin. Membran 1 x TTBS %5 BSA ile 1 h blok.</li>
	<li>Membran ile ilk antikor kuluçkaya: HuR veya mesothelin, her ikisi de seyreltilmiş 1: 1000 1 x TTBS 4 h oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de % 5 BSA içinde</li>
	<li>7 dk. için üç kez membran 1 x TTBS yıkama ve tavşan Anti-fare horseradish peroksidaz (HRP) kuluçkaya-konjüge ikincil antikor seyreltilmiş %5 BSA, 1 x TTBS 1:10,000.</li>
	<li>Proteinler gelişmiş Kemiluminesan ve dijital görüntüleyici kullanarak görselleştirmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation.">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress:+a+matter+of+survival.">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li><li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AREsite2:+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU/GU/U-rich+elements.">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li><li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma.">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biotin-(strept)avidin+system:+principles+and+applications+in+biotechnology.">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+Uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>. Magnetic bead technology for better assay development Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013)</li><li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients.">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis/transport+of+nuclear+ferritin+RNAs.">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li><li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+function+in+disease.">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+regulatory+RNA.">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li><li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Kodlamayan genom3' e 3' UTRs ait ve onların işlev7uygulamak için tüm kodlamayan RNA'ların proteinler ile etkileşim kurabilir. Ne zaman memeli genom pervasively transkripsiyonu için kurmak ve uzun kodlamayan RNA'ların16önemli bir kısmını üretilen, delillerin ortaya çıkan bu uzun kodlamayan RNA'ların ile etkileşimde bulunan gen ifadesinin düzenlenmesine çalışması gösterdi kompleksleri17Kromatin remodeling....

Gen ekspresyonu ve gen ürünü son seviyesi sıkıca mRNA kararlılığı ve mRNA çeviri hızı1etkileyen tarafından düzenlenmiş. Çoğu yasal mekanizmaların kodlamayan RNA ve/veya RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) etkileşimleri ile hedeflenen mRNA aracılığıyla sarf. Bu genellikle 3' Çevrilmeyen mRNA (3' UTR - genom2kodlamayan bölümüne ait) belirli CISiçeren bölgedir- transtarafından tanınan düzenleyici elemanlarının (CRE),-miRNA ya da RBPs gibi faktörler rol 3. en çok çalışılmış CIS-içinde 3' UTR, öğedir belirli AU bağlanıcı proteinler (AUBP) tarafından ve sırayla tanınır, adenin-zengini eleman (vardır) motifi neden olmaktadır ya mRNA bozulması/deadenylation (ARE-aracılı decay) veya mRNA sabitleme4.
Boyutu olduğunu 3' UTR'nin calretinin, mRNA (CALB2) 573 bp uzun ve AREsite2, bir bioinformatic araç5tarafından tahmin ettiği gibi sözde AUUUA pentamer içerir. Bir sözde olan motif varlığı ile tutarlı, pmirGLO vektör-muhabir tahlil bir istikrar rol CALB2 mRNA6içinde bu öğesinin gösterdi. Son olarak, vitro RNA-açılan calretinin stabilize AUBP tanımlamak için kullanılan olan motif aracılığıyla mRNA.
Tüm kodlamayan RNA'ların proteinler7ile etkileşim, vitro RNA-açılan bir iyi yolu ve RNA-interactors tanımlamak için seçim ilk tahlil moleküler mekanizmaları çözmekte yardımcı olmak için çünkü. Bu RNA-açılan yönteminde biotin (desthiobiotin) 3' terminus RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formla etiketli, ticari olarak sentezlenmiş RNA probları kullanılmıştır. RNA-desthiobiotin ile özellikle ilgi bağlı-RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Böyle RNA bağlı proteinler manyetik boncuklar, % 12'si SDS-sayfa jel çalıştırmak, bir membran transfer ve farklı antikorlar ile probed üzerinden eluted.
Standart streptavidin-biotin benzeşme arıtma yordam, sert denatürasyon koşulları ilişkili proteinler8, elute için güçlü geri dönüşü olmayan biotin streptavidin bağ bozmak için gerekli olan ayrılma neden olabilir protein kompleksleri. Biotin, aksine desthiobiotin ters streptavidin için bağlar ve rekabetçi biotin için protein elüsyon nazik bırakılınca koşar ve doğal olarak biotinylated molekülleri9yalıtım kaçınarak, tamponlu bir çözüm ile yerlerinden olduğunu, Teknik yerli protein kompleksleri yerel koşullar altında yalıtmak için ideal olduğunu düşündüren.
Tuz konsantrasyonu, azalan bakiyeli ajanlar ve deterjan yüzde tarafından belirlenir, vitro bağlayıcı koşulları ve sıkılık, yakın bu hücresel bağlamda mevcut gerçek vivo içinde etkileşimleri tanımlamak için olması gerekir. Burada uygulanan bağlama koşulları daha önce bir AU-bağlayıcı protein10Hur kimliği için uygun olarak gösterilmiştir. Uygun ciltleme koşullardan en iyi duruma getirme zaman alıcı ve zor olabilir bu yana bu yaklaşım zaman kazanmak. Buna ek olarak, bu yöntem bir başlangıç iletişim kuralı olarak herhangi bir RNA-açılan deneme için kullanılan ve yavaş yavaş tuzları ve deterjanlar konsantrasyon değiştirme gliserol yüzdesini değiştirerek ve diğer tuzları ekleyerek optimize edilebilir. Ayrıca, biz bile bir kısa 25-nükleotit RNA-bir pentamer yataklık sonda vardır-motif belirli bir AUBP ile etkileşim göstermek için kullanılabileceğini gösterdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:124px;">78833</td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20164</td>
			<td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pierce RNA 3&#8217; End Desthiobiotinylation Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20163</td>
			<td style="width:468px;">The kit is a part of the &#34;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#34;, and needs to be stored at -20 &#176;C unlike the pull-down kit (4 &#176;C).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2,&#160; magnetic stand</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:453px;">Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td style="width:468px;">The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - &#945; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td style="width:124px;">8035</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&#160;</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>200-301-A87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:295px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:124px;">7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary rabbit anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A-9044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RPMI - 1640 medium</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FBS - Filtrated Bovine Serum</td>
			<td style="width:295px;">Pan Biotech&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin - streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">L-Glutamine solution (200 mM)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:295px;">Gibco by Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:124px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN 3 Cell</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini Protean System Glass Plates&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &#181;L</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1658050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:453px;">Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td>
			<td style="width:295px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">3029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">20% SDS&#160;</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td>A3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:124px;">NEF1002</td>
			<td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FusionFX&#160; Digital Imager</td>
			<td style="width:295px;">Vilber</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNA oligo synthesis</td>
			<td style="width:295px;">Mycrosynth AG, Switzerland</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td>the synthesis scale - 0.04 &#181;mol - HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">182883.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Glycerol&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td>50% sterile aliquots to be stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:453px;">Pierce Streptavidin magnetic beads&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">88817</td>
			<td style="width:468px;">Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &#181;m (range from 0.5 - 1.5 &#181;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &#181;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">TEMED</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ammonium persulfate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coomassie G-250</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A3480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">368458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ortho-phosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A0637</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

Vitro RNA-açılan özel RNA yapıları ve motifleri tanımak RNA bağlanıcı proteinler belirlenmesi amaçlı iletişim kurallarının ilk adımda hala büyük ölçüde kullanılır. Bu RNA-açılan iletişim kuralında, biotin, desthiobiotin, 3' terminus streptavidin için geri döndürülebilir olarak bağlar ve böylece daha fazla altında proteinlerin elüsyon sağlayan RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formu ile ticari olarak sentezlenmiş RNA probları etiketlenir fizyolojik koşullar. RNA-desthiobiotin ile özellikle faiz RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Burada anlatılan yöntem bilinen RNA proteinler ve bir faiz dizisini içeren 25-nükleotit (nt) uzun RNA prob arasındaki etkileşimi algılamaya uygulanır. Bu sabitleme veya öğeleri RNA molekülleri bir muhabir vektör tahlil kullanılarak elde mevcut istikrarsızlaştırıcı fonksiyonel karakterizasyonu tamamlamak yararlıdır.

Bu deneyde, calretinin 3' UTR barındıran ARE motifi (CALB2 3' UTR (vardır) 25-nt) 25-nt uzun parçası özellikle insan-antijen R (HuR) protein için bilinen bir mRNA sabitleyici bağlar olup olmadığını test etmek için kullanılmıştır. ARE öğesi, bir 25-nt RNA özgüllük test etmek için daha önce olan motif sabitleme etkisini ortadan kaldırmak için gösterildi, ARE-motif mutasyon içeren CALB2 3' UTR (mtARE) kullanılan6yoklamaydı. Üçüncü RNA...

Watch this Scientific Journal Video about Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells at JoVE.com

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı

Desthiobiotin bir adenin-zengini eleman (vardır) motifi içeren bir sentetik 25-nükleotit RNA oligo, etiketleme sitozolik vardır-bağlayıcı proteinin belirli bağlantı verir.

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.9K Görüntüleme.  University Hospital Zurich. Desthiobiotin bir adenin-zengini eleman (vardır) motifi içeren bir sentetik 25-nükleotit RNA oligo, etiketleme sitozolik vardır-bağlayıcı proteinin belirli bağlantı verir.

Video: Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential anti-cancer drugs. Multicellular tumor spheroids (MCTSes) effectively mimic the physiological conditions of solid tumors, making them excellent in vitro models for lead optimization and target validation. Out of the various techniques available for MCTS culture, the liquid-overlay method on agarose is one of the most inexpensive methods for MCTS generation. However, the reliable transfer of MCTS cultures using liquid-overlay for high-throughput screening may be compromised by a number of limitations, including the coating of microtiter plates (MPs) with agarose and the irreproducibility of uniform MCTS formation across wells. MPs are significantly prone to edge effects that result from excessive evaporation of medium from the exterior of the plate, preventing the use of the entire plate for drug tests. This manuscript provides detailed technical improvements to the liquid-overlay technique to increase the scalability and reproducibility of uniform MCTS formation. Additionally, details on a simple, semi-automatic, and universally applicable software tool for the evaluation of MCTS features after drug treatment is presented.

The uneven loss of medium from microtiter plates affects the reproducibility of uniform multicellular tumor spheroid formation. Improving culture conditions to reduce significant medium loss will improve the reproducibility of spheroid formation and the results of spheroid-based assays using the liquid-overlay technique.

Buharlaşma azaltıcı Kültür Durumu Mikrotiter Tabaklar Multisellüler Sfero Oluşumunun Tekrarlanabilirlik artırır

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Kanser Araştırmaları

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

CRISPR Aracılı Temel Editörler kullanılarak BRCA1 varyantlarının fonksiyonel değerlendirmesi

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as drug resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and metastasis. Intratumoral eATP is 103 to 104 times higher in concentration than in normal tissues. While eATP functions as a messenger to activate purinergic signaling for EMT induction, it is also internalized by cancer cells through upregulated macropinocytosis, a specific type of endocytosis, to perform a wide variety of biological functions. These functions include providing energy to ATP-requiring biochemical reactions, donating phosphate groups during signal transduction, and facilitating or accelerating gene expression as a transcriptional cofactor. ATP is readily available, and its study in cancer and other fields will undoubtedly increase. However, eATP study remains at an early stage, and unresolved questions remain unanswered before the important and versatile activities played by eATP and internalized intracellular ATP can be fully unraveled.
These authors&#39; laboratories&#39; contributions to these early eATP studies include microscopic imaging of non-hydrolysable fluorescent ATP, coupled with high- and low-molecular weight fluorescent dextrans, which serve as macropinocytosis and endocytosis tracers, as well as various endocytosis inhibitors, to monitor and characterize the eATP internalization process. This imaging modality was applied to tumor cell lines and to immunodeficient mice, xenografted with human cancer tumors, to study eATP internalization in vitro and in vivo. This paper describes these in vitro and in vivo protocols, with an emphasis on modifying and finetuning assay conditions so that the macropinocytosis-/endocytosis-mediated eATP internalization assays can be successfully performed in different systems.

We developed a reproducible method to visualize the internalization of nonhydrolyzable fluorescent adenosine triphosphate (ATP), an ATP surrogate, with high cellular resolution. We validated our method using independent in vitro and in vivo assays-human tumor cell lines and immunodeficient mice xenografted with human tumor tissue.

İnsan Tümör Hücrelerinde ve Tümör-ksinografted Farelerde Makropinositoz Aracılı ATP İçselleştirme için Floresan Mikroskopi

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary tumor cells from surgically resected, malignant pleural mesothelioma (MPM) by providing a complete overview of the process from digestion to enrichment, expansion, cryopreservation, and phenotypic characterization. In addition, this protocol introduces concepts for tumor generation that may be useful for multiple tumor types such as differential trypsinization and the impact of dissociation methods on the detection of cell surface markers for phenotypic characterization. The major limitation of this study is the selection of tumor cells that will expand in a two-dimensional (2D) culture system. Variations to this protocol, including three-dimensional (3D) culture systems, media supplements, plate coating to improve adhesion, and alternate disaggregation methods, could improve this technique and the overall success rate of establishing a tumor line. Overall, this protocol provides a base method for establishing and characterizing tumor cells from this rare tumor.

The goal of this method paper is to demonstrate a robust and reproducible methodology for the enrichment, generation, and expansion of primary tumor cell lines from surgically resected pleural mesothelioma.

Primer, Malign Plevral Mezotelyoma Tümör Hatlarının Oluşumu ve Genleşmesi

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...