이 작품은 스위스 국립 과학 재단 Sinergia 그랜트 CRSII3 147697, 재단에 Angewandte Krebsforschung와 취리히 Krebsliga에 의해 지원 되었다.

1. Cytosolic 핵 단백질 분수의 준비
<ol><li>플레이트 4 x 106 ACC-MESO-4 셀 RPMI-1640 매체에에서 성장 T150 셀 문화 술병에 보충 10 %FBS, 1 x 페니실린/스 (100 x), 그리고 2 m L-글루타민 (200 m m) m. 셀 80-90% (6 셀 ~5-5.5 x 10)의 합류에 도달, 핵 및 cytosolic 분수의 단백질 추출 진행. 참고: ACC-MESO-4 셀 라인 RIKEN 유관 센터11에서 얻은 했다.</li>
	<li>중간 발음, 1 x PBS의 15 mL을 추가 하 여 셀을 세척, 기울기 접시 부드럽게 몇 번와 1 x PBS 발음. 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 문화 플라스 크 3 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 분리;에 대 한 현미경 셀 보고 아직도 수돗물을 연결 하는 경우는 3의 손바닥에 대 한 플라스 크 시간.</li>
	<li>7 mL RPMI 1640 매체와 10 %FBS, 1 x 페니실린/스 (100 배), 2 mM L-글루타민 (200mm) 보충의 추가, 15 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 5 분 동안 200 x g에 아래로 회전.</li>
	<li>중간 발음 그리고 1.5 mL 1 x PBS 가진 펠 릿 셀 resuspend microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 전송. 500 x g와 4 ° C 5 분 삭제는 상쾌한 아래로 회전 합니다. 참고:이 단계 이후,에서 4 ° C에서 원심 분리 단계를 모두 수행 하 고 얼음에 모든 시 약을 계속.</li>
	<li>1 x PBS의 얼음 처럼 차가운 1.5 mL와 셀 펠 릿 resuspend 및 회전 500 x g에서 셀 3 분에 4 ° C 감소 삭제는 상쾌한. 참고: CER의 필요한 금액 나, CER II 및 NER 시 약은 10, 0.55, 및 5 양의 예상된 셀 펠 릿 포장 볼륨, 각각; 다음 프로토콜 20 µ L의 볼륨을 가정합니다. 시 CER의 필요한 만큼만 준비 하는 것이 좋습니다 난.</li>
	<li>200 µ L 얼음 세포질 추출 시 약의 추가 (CER 나) 100 x 재고를 물 500 µ L에서의 프로 테아 제 억제제 (EDTA 무료) 1 태블릿을 희석 2 µ L 성분 억제 물, 예를 들어, x 1의 보완. 이 정도의 시 CER 내가 lyse 세포 펠 릿 포장 볼륨의 20 µ L에 충분 하다.<ol>
<li>셀 펠 릿 포장 볼륨을 추정, 1.5 mL 튜브 셀 펠 릿을 포함 하는 튜브를 비교 하 여 10, 20, 50 또는 100 µ L 1 x PBS의 가득 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적극적으로 vortexing 15 튜브에 의해 셀 펠 릿 resuspend s 10 분 추가 11 µ L의 튜브, 5에 대 한 적극적으로 소용돌이를 얼음 처럼 차가운 세포질 추출 시 약 II (CER II)에 대 한 얼음에 튜브를 품 어와 s, 그리고 얼음에 1 분을 품 어.</li>
	<li>5 s와 분리기 g x 16, 000에서 튜브에 대 한 적극적으로 소용돌이 4 ° C 5 분에 대 한 얼음에 깨끗 한 미리 냉장된 튜브에는 상쾌한을 전송. 상쾌한 더 세포질 분수는 RNA-풀 다운 실험에 사용.</li>
	<li>1 µ L 성분 억제 물 (100 x)와 적극적으로 15 소용돌이의 보충의 얼음 핵 추출 시 약 (NER) 100 µ L에서 나머지 펠 릿 resuspend s. NER 시 약 protease 억제제와 보충의 필요한 만큼만 준비 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>가끔 vortexing 15와 40 분 동안 얼음에 샘플을 품 어 s (매 10 분).</li>
	<li>깨끗 한 미리 냉장된 튜브를 튜브에서 16000 x g 10 분 전송에 대 한 (이것은 핵 단백질 분수) 상쾌한 원심.</li>
	<li>Bicinchoninic (BCA) 메서드를 사용 하 여 단백질 농도 측정 하 여 즉시 진행 ( 재료의 표참조). 각 분수의 단백질 순수성에 대 한 제어, α-tubulin (긍정적인 탐지 cytosolic 분수에만) 및 폴 리 ADP ribose 중 합 효소-PARP (긍정적인 탐지 핵 분수에만)에 대 한 immunoblotting (그림 1)을 수행 합니다. 단백질 시각화, 섹션 4 참조.</li>
	<li>단백질 활동 및 그들의 원시 상태를 유지 하기 위하여 cytosolic 핵 추출 물의 aliquots의 25 µ L를 준비 합니다. 5 s를-80 ° c.에 직접 저장소 액체 질소에 그들을 배치 하 여 스냅-동결이이 aliquots</li>
</ol>2. Desthiobiotin와 RNA의 라벨
<ol><li>상업적으로 합성 하는 RNA 프로브 및 HPLC 정화 있다. 10 µ M에서 nuclease 무료 물으로 resuspend. 참고: 프로브 시퀀스는 표 1에 나열 됩니다.</li>
	<li>RNA의 RNA-풀 다운 반응 당 50 pmol을 사용 합니다. 해 동 하 고 얼음에 목이 30%, RNA oligo의 라벨 3' 말단에 사용 제외 하 고 모든 시 약을 계속.</li>
	<li>5 µ L 10 µ M RNA 프로브, CALB2로 분류 3' UTR (있다)의 전송, CALB2 3' UTR (mtARE), 및 관련 RNA (분노), 0.5 mL 얇은 microcentrifuge로 튜브 5 분 위 튜브 즉시 얼음에 85 ° C에서 PCR 기계에 품 어. 참고:이 단계는 중요 하다, 그것은 휴식 및 라벨에 대 한 RNA 조사의 접근성을 촉진.</li>
	<li>단 하나 30 µ L 반응에 대 한 다음 10 µ L 믹스 RNA 포함 된 튜브에 추가: nuclease 무료 물 3 µ L, RNA 리가 반응 버퍼, RNase 억제제의 1 µ L x 10의 3 µ L (40 U / µ L), Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1mm)의 1 µ L 그리고 T4 RNA 리가 (20 U / µ L)의 2 µ L. 참고: 마스터 믹스 A 초과 (3.2)에서 3 샘플, 혼합 준비 nuclease의 9.6 µ L 무료 물, RNA 리가 반응 버퍼, RNase 억제제의 3.2 µ L x 10의 9.6 µ L (40 U / µ L), Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1mm)의 3.2 µ L 및 T4 RNA 리가 (20 U / µ L)의 6.4 µ L.</li>
	<li>신중 하 게 15 µ L의 말뚝 반응에 30% 추가. 또 다른 팁을 사용 하 여 혼합 반응. 품 어 하룻밤 16 ° c.에 반응</li>
	<li>다음 날, 다음 준비: 5 M NaCl (신선/nuclease-무료), 클로 프롬: isoamyl 알콜 24:1 비율 (예를 들어, 반응-96 µ L 클로 프롬 및 isoamyl 알콜의 4 µ L 당), 얼음 100% 에탄올, 그리고 차가운 70% 에탄올.</li>
	<li>RNA 라벨 반응 관에 nuclease 무료 물 70 µ L를 추가 합니다. 클로 프롬의 100 µ L를 추가: isoamyl 알콜과 소용돌이 짧게. 스핀-다운 13000 x g에서 3 분 신중 하 게 제거만 위 단계와 새로운 nuclease 무료 1.5 mL 튜브;에 대 한 낮은 단계를 만지지 마십시오.</li>
	<li>5 M NaCl, 글 리 코겐의 1 µ L 및 얼음 100% 에탄올의 300 µ L 10 µ L를 추가 합니다. 2 시간 동안-20 ° C에 튜브를 놓습니다. 참고:이 단계에서 실험 다음 날에 계속 될 수 있다.</li>
	<li>15 분을 위한 13000 g x 및 4 ° C에서 원심 분리기는 펠 렛을 방해 하지 않고 신중 하 게는 상쾌한을 버리십시오. 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올과 원심 분리기 13000 x g에서 다시 및 4 ° C 5 분의 300 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한을 완전히 무시 하 고 펠 릿 (15 분)를 건조. 20 µ L nuclease 무료 물에 펠 릿을 resuspend. 참고: 같은 날에 RNA-풀 다운으로 진행.</li>
	<li>2 분 동안 90 ° C에서 RNA를 품 어 고 얼음에 놓습니다. Streptavidin 자석 구슬의 사전 세척의 다음 단계 동안 얼음에 셔 서 RNA를 놓습니다. 참고: 장시간 보육 RNA 조사를 손상 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. RNA-단백질 풀 다운
<ol><li>
미리 세척 streptavidin 자석 구슬 및 desthiobiotin RNA를 가진 외피
	<ol>
<li>50 pmol RNA 당 streptavidin 자석 구슬의 50 µ L을 사용 합니다. 그러나,이 실험에 따라 최적화 되어야 합니다.</li>
		<li>소용돌이와 streptavidin 자석 구슬 15 s, 그리고 신속 하 게 제거 200 µ L (마스터 믹스, 3 + 1 반응에 대 한 충분 한) 사용 하 여 깨끗 한 1.5 mL 튜브 안전 잠금에 대 한 튜브 컷 피 펫 팁. 구슬 튜브의 측면에서 수집 하 고 기다리는 1 분 제거 물의 resuspension 액체 튜브 마그네틱 스탠드에 놓습니다.</li>
		<li>구슬 세척, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거, 0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl 솔루션, 그리고 부드럽게 몇 번 위아래로 피펫으로의 400 µ L를 추가 합니다. 마그네틱 스탠드에 다시 튜브를 놓습니다. 1 분 대기 고는 상쾌한을 수집 합니다. 이 단계를 다시 반복 합니다.</li>
		<li>워시 100 m NaCl m의 200 µ L와 구슬. 제거는 상쾌한.</li>
		<li>트리 스 (pH 7.5), pipetting으로 구슬 resuspend, 튜브 자석 스탠드에, 1 분 동안 대기 놓고 제거는 상쾌한 20 m m의 200 µ L를 추가 합니다. 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거, RNA 캡처 버퍼, x 1의 200 µ L을 추가 하 고 간단히 vortexing에 의해 streptavidin 자석 구슬 resuspend. Streptavidin 자석 구슬의 50 µ L을 제거 하 고 잘라 피 펫 팁을 사용 하 여 각 레이블이 RNA 튜브에 추가. 롤러에 실 온에서 30 분 동안 튜브를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA 단백질의 바인딩
	<ol>
<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 배치 하 고 1 분 대기는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>구슬에 20 mM Tris (pH 7.5)의 50 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 resuspend. 마그네틱 스탠드에 튜브를 배치, 1 분을 기다려 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>구슬에 단백질-RNA 바인딩 버퍼 x 1의 100 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 resuspend.</li>
		<li>한편, 다음 믹스를 준비: 10 µ L 단백질-RNA 바인딩 버퍼, 50% 글리세롤의 30 µ L, 세포질 단백질의과 nuclease 무료 50 µ g x 10의 최대 100 µ L를 물. 참고: 다음과 같이 초과 (3.3)에서 3 샘플에 대 한 마스터 혼합 B를 준비: 단백질-RNA 바인딩 버퍼 x 10의 33 µ L, 50% 글리세롤의 99 µ L, 세포질 단백질과 nuclease 무료 물까지 330 µ L.의 165 µ g 유지의 마스터 B 얼음에 튜브.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 배치 하 고 1 분 대기는 상쾌한을 수집 합니다. 마스터 혼합 B 100 µ L을 추가 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 resuspend 거품을 만들지 마십시오. 롤러에 4 ° C에서 60 분에 대 한 반응 튜브를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세척 및 차입
	<ol>
<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 배치, (즉, 통해-FT) 상쾌한, 수집 하 고 새 튜브로 전송. 참고: 나중에 분석을 위한 얼음에이 피트 유지.</li>
		<li>플라스틱 구슬에 워시 버퍼 x 1의 100 µ L, 부드럽게 resuspend, 마그네틱 스탠드에 다시 넣어, 1 분, 대기 고는 상쾌한 삭제. 2 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>자성 구슬에 차입 버퍼의 40 µ L를 추가 하 고 아래로, pipetting으로 섞어 30 분 동안 튜브 셰이 커 (950 rpm)에 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>튜브 마그네틱 스탠드에, 1 분을 기다려 놓고 (eluate-E는) eluted 샘플을 수집 합니다. 얼음에 놓고 다운스트림 분석을 위해 사용 합니다. 참고:이 단계에서 각 시험된 RNA 프로브 자형 (FT) 및 eluate (E) 샘플을 구성 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. polyacrylamide 전기 및 서양 오 점 분석
주:이 섹션에서 사용 되는 버퍼에 대 한 조리법에 대 한 표 2를 참조 하십시오. 서 부 수행 Laemmli 방법을12에 따르면 오.
<ol><li>Handcast 12 %SDS 페이지 젤 (10-우물, 1.5 m m 간격, 66 µ L). 실행 중인 젤 믹스 준비: 30% 아크릴-bisacrylamide 재고 솔루션, 낮은 트리 스의 2.4 mL의 4 mL, dH2O, TEMED, 10% 염화 persulfate 솔루션 (APS)의 96 µ L의 9.6 µ L의 3.2 mL 버퍼. 겹쳐 쌓이는 젤 믹스 준비: dH2O, 30% 아크릴-bisacrylamide 재고 솔루션, 위 Tris 버퍼의 1.3 mL의 0.5 mL, TEMED, 10%의 20 µ L의 10 µ L의 3.25 mL AP.</li>
	<li>6 x Laemmli 버퍼의 16.6 µ L을 추가 (예, 트리 스/HCl/SDS pH 6.8의 14 mL (위 Tris 버퍼), sds, DTT, 글리세롤, 및 0.012 %bromophenol 블루; 6 mL의 1.86 g 2 g-20 ° C에 저장) 피트 샘플 및 샘플 전자로 6 x Laemmli 버퍼의 6.6 µ L로. 95 ° c.에 5 분에 대 한 샘플을 품 어</li>
	<li>(피트 및 전체 20 µ L Elute ~ 40 µ L) 샘플 로드 60 V, 20 V 밤새 계속 30 분 동안 그들을 실행 하 고.</li>
	<li>세미 드라이 electroblotting 시스템을 사용 하 여, 단백질 15 V 80 분에 대 한 PVDF 막에 전송 합니다. 참고: PVDF 막 단백질 전송 수행 하기 전에 활성화 해야 합니다. 초순에 2 분 부 화 뒤 1 분에 100% 메탄올에서 막 품 어.</li>
	<li>단백질 전송 후 Coomassie 솔루션 3 h, 초순, 각 30 분 세척의 3 단계 다음에 대 한 SDS 페이지 젤을 품 어.</li>
	<li>단백질의 끝에, 건조 단계 4.5에서 1 헤 막 활성화 위해 PVDF 막 하자. 차단 막 1 x TTBS에 5 %BSA 1 시간.</li>
	<li>첫번째 항 체로 막 품 어: 허 또는 mesothelin, 모두 희석 4 h 실내 온도에 또는 하룻밤 4 ° c.에 대 한 1 x TTBS에 5 %BSA 1:1000</li>
	<li>1 x TTBS에 7 분에 대 한 세 번 막 세척 하 고 토끼 반대로 마우스 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 품 어-활용 된 이차 항 체 희석 5 %BSA, 1 x TTBS에에서 1:10,000.</li>
	<li>향상 된 화학 및 디지털 영상 장치를 사용 하 여 단백질을 시각화.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation.">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress:+a+matter+of+survival.">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li><li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AREsite2:+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU/GU/U-rich+elements.">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li><li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma.">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biotin-(strept)avidin+system:+principles+and+applications+in+biotechnology.">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+Uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>. Magnetic bead technology for better assay development Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013)</li><li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients.">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis/transport+of+nuclear+ferritin+RNAs.">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li><li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+function+in+disease.">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+regulatory+RNA.">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li><li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

3' Utr는 비 코딩 게놈3에 속하고 모든 비 코딩 RNAs 단백질7그들의 기능 발휘 하기 위하여 작용할 수 있습니다. 포유류 게놈 복사할 퍼지 수를 발견 하 고 긴 noncoding RNAs16의 상당 부분을 생산,이 긴 noncoding RNAs로 상호 작용 하는 유전자 발현 조절에 작동 입증 증거를 신흥 개장 하는 chromatin 단지17. 이 정보는 RNA-풀 다운 분석 결과 ...

유전자 발현과 유전자 제품의 최종 수준 mRNA 안정성과 mRNA 번역 속도1에 영향을 미치는 하 여 단단히 통제 수 있다. 이러한 post-transcriptional 규제 메커니즘은 타겟된 mRNA와 비 코딩 RNA 또는 RNA 바인딩 단백질 (RBPs)의 상호 작용을 통해 발휘 됩니다. 그것은 일반적으로 특정 cis을 포함 하는 (3' UTR-게놈2의 비 코딩 부분에 속하는) mRNA의 3' 번역된 영역- 트랜스에 의해 인정 되는 규제 요소 (CRE)-미르 등 RBPs 요인 행동 3. 최고의 공부 cis-3' UTR, 내의 요소는 차례에, 그리고 특정 AU-바인딩 단백질 (AUBP)에 의해 인식 되는 아데닌 부자 요소 (는) 모티브 유도 하거나 mRNA 저하/deadenylation (감퇴는 중재) 또는 mRNA의 안정화4.
크기는 3' UTR calretinin의 mRNA (CALB2)은 573 bp 긴 AREsite2, bioinformatic 도구5에의해 예측 상 상속 AUUUA pentamer 포함. Putative는 모티프의 존재와 일치, pmirGLO 벡터 기자 분석 결과 CALB2 mRNA6내에서이 요소의 안정화 역할을 설명 했다. 마지막으로,는 생체 외에서 RNA-풀 다운 사용 되었다 calretinin 안정화 AUBP를 식별 하는 모티브를 통해 mRNA.
모든 비 코딩 RNAs는 단백질7상호 작용에서 생체 외에서 RNA-풀 다운 이므로 좋은 방법과 선택의 첫 번째 분석 결과 RNA-인터 식별 분자 메커니즘을 해독에 도움. 이 RNA-풀 다운 방법에서는 상업적으로 합성된 RNA 프로브, RNA 가닥의 3' 말단에 biotin (desthiobiotin)의 수정 양식을 표시 했다 사용 되었다. RNA-desthiobiotin는 streptavidin 자석 구슬, 풀 다운 단백질 특히 관심의 바운드 RNA 상호 작용 하는 데 사용 되는에의 상호 작용을 통해 움직일 수 있습니다. Mesothelioma 셀의 cytosolic 분수에서 비 변성 및 활성 단백질은 단백질의 원본으로 사용 됩니다. 이러한 RNA 바인딩 단백질은 eluted 자석 구슬, 12 %SDS 페이지 젤 통해 실행 하 고, 막, 전송 하 고 다른 항 체와 조사에서.
표준 streptavidin biotin 선호도 정화 절차, 가혹한 변성 조건8바운드 단백질 elute 강한 돌이킬 수 없는 biotin streptavidin 본드를 방해 하는 데 필요한 어떤의 분리 발생할 수 있습니다. 단백질 복합물입니다. Biotin, 달리 desthiobiotin 역에 streptavidin 바인딩하고 biotin, 단백질의 부드러운 차입에 대 한 허용 하 고 피하는 자연스럽 게 biotinylated 분자9, 격리의 버퍼 솔루션 경쟁력 있 제안 기법 기본 조건에서 네이티브 단백질 복합물을 분리 하는 데 이상적입니다.
생체 외에서 바인딩 조건과 엄중, 소금 농도, 감소 시키는 대리인 및 세제 비율에 의해 결정 됩니다,이 진정한 vivo에서 상호 작용을 식별 하기 위해 그 세포질 문맥에 가까이 있어야 한다. 여기에 구현 된 바인딩 조건 있다 이전 증명 AU-바인딩 단백질10으로 허의 식별을 위해 적절 한. 이 이렇게 어렵고 도전적인 적절 한 바인딩 조건의 최적화 될 수 있으므로 시간을 절약할 수 있다. 또한,이 방법은 어떤 RNA-풀 다운 실험 시작 프로토콜로 사용 될 수 고 소금 및 세제의 농도 변경 하 고, 글리세롤 백분율을 변경 하 고 다른 소금 추가 여 점차적으로 최적화할 수 있습니다. 또한, 우리는 심지어 짧은 25-뉴클레오티드 RNA-조사는 pentamer 은닉는 모티브 사용할 수 특정 AUBP와의 상호 작용을 보여 시연.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:124px;">78833</td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20164</td>
			<td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pierce RNA 3&#8217; End Desthiobiotinylation Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20163</td>
			<td style="width:468px;">The kit is a part of the &#34;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#34;, and needs to be stored at -20 &#176;C unlike the pull-down kit (4 &#176;C).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2,&#160; magnetic stand</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:453px;">Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td style="width:468px;">The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - &#945; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td style="width:124px;">8035</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&#160;</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>200-301-A87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:295px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:124px;">7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary rabbit anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A-9044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RPMI - 1640 medium</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FBS - Filtrated Bovine Serum</td>
			<td style="width:295px;">Pan Biotech&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin - streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">L-Glutamine solution (200 mM)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:295px;">Gibco by Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:124px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN 3 Cell</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini Protean System Glass Plates&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &#181;L</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1658050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:453px;">Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td>
			<td style="width:295px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">3029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">20% SDS&#160;</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td>A3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:124px;">NEF1002</td>
			<td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FusionFX&#160; Digital Imager</td>
			<td style="width:295px;">Vilber</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNA oligo synthesis</td>
			<td style="width:295px;">Mycrosynth AG, Switzerland</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td>the synthesis scale - 0.04 &#181;mol - HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">182883.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Glycerol&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td>50% sterile aliquots to be stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:453px;">Pierce Streptavidin magnetic beads&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">88817</td>
			<td style="width:468px;">Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &#181;m (range from 0.5 - 1.5 &#181;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &#181;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">TEMED</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ammonium persulfate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coomassie G-250</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A3480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">368458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ortho-phosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A0637</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

생체 외에서 RNA-풀 다운 특정 RNA 구조와 주제를 인식 하는 RNA 의무적인 단백질을 식별 하기 위한 프로토콜의 첫 번째 단계에서 아직도 크게 사용 된다. 이 RNA-풀 다운 프로토콜에서 상업적으로 합성된 RNA 프로브 biotin, desthiobiotin는 역에 streptavidin 바인딩하고 따라서 더에서 단백질의 차입을 허용 한다 RNA 가닥의 3' 말단에서의 수정 된 형태로 표시 됩니다 생리 조건입니다. RNA-desthiobiotin는 streptavidin 자석 구슬, 풀 다운 단백질 특히 관심의 RNA와 상호 작용 하는 데 사용 되는에의 상호 작용을 통해 움직일 수 있습니다. Mesothelioma 셀의 cytosolic 분수에서 비 변성 및 활성 단백질은 단백질의 원본으로 사용 됩니다. 여기 설명 하는 방법은 알려진된 RNA 의무적인 단백질 25-뉴클레오티드 (nt) 긴 RNA 프로브를 포함 하는 관심사의 순서 사이 상호 작용을 검출 하기 위하여 적용할 수 있습니다. 안정 또는 불안정 기자 벡터 분석 결과 사용 하 여 달성 하는 RNA 분자에 존재 하는 성분의 기능 특성을 완료 하는 데 유용 합니다.

이 실험에서 calretinin 3' UTR 은닉은 모티브의 (CALB2 3' UTR (은) 25-nt) 25-nt 긴 조각 인간 항 R (허) 단백질, 알려진된 mRNA 안정제에 특히 바인딩 되었는지 테스트 하려면 사용 되었습니다. 테스트는 요소, 25 nt RNA의 특이성 조사 CALB2 3' UTR (mtARE)는 모티브의 안정화 효과 폐지 이전 보였다는 모티브는 돌연변이 포함 하 이었다 사용된6. 3 RNA 프로브 28 nt 부정적인 제어...

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Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin Streptavidin 선호도 중재 Mesothelioma 세포에서 RNA 상호 작용 단백질의 정화

Desthiobiotin 라벨 아데닌 부자 요소 (는) 주제를 포함 하는 합성 25-뉴클레오티드 RNA oligo의 cytosolic는 바인딩 단백질의 특정 바인딩 수 있습니다.

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.9K 조회수.  University Hospital Zurich. Desthiobiotin 라벨 아데닌 부자 요소 (는) 주제를 포함 하는 합성 25-뉴클레오티드 RNA oligo의 cytosolic는 바인딩 단백질의 특정 바인딩 수 있습니다.

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Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential anti-cancer drugs. Multicellular tumor spheroids (MCTSes) effectively mimic the physiological conditions of solid tumors, making them excellent in vitro models for lead optimization and target validation. Out of the various techniques available for MCTS culture, the liquid-overlay method on agarose is one of the most inexpensive methods for MCTS generation. However, the reliable transfer of MCTS cultures using liquid-overlay for high-throughput screening may be compromised by a number of limitations, including the coating of microtiter plates (MPs) with agarose and the irreproducibility of uniform MCTS formation across wells. MPs are significantly prone to edge effects that result from excessive evaporation of medium from the exterior of the plate, preventing the use of the entire plate for drug tests. This manuscript provides detailed technical improvements to the liquid-overlay technique to increase the scalability and reproducibility of uniform MCTS formation. Additionally, details on a simple, semi-automatic, and universally applicable software tool for the evaluation of MCTS features after drug treatment is presented.

The uneven loss of medium from microtiter plates affects the reproducibility of uniform multicellular tumor spheroid formation. Improving culture conditions to reduce significant medium loss will improve the reproducibility of spheroid formation and the results of spheroid-based assays using the liquid-overlay technique.

증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

연구

암 연구학

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter assays, embryonic stem cell viability assays, and therapeutic drug-based sensitivity assays. Although they have clarified a lot of BRCA1 variants, these assays involving the use of exogenously expressed BRCA1 variants are associated with overexpression issues and cannot be applied to post-transcriptional regulation. To resolve these limitations, we previously reported a method for functional analysis of BRCA1 variants via CRISPR-mediated cytosine base editor that induce targeted nucleotide substitution in living cells. Using this method, we identified variants whose functions remain ambiguous, including c.-97C&#62;T, c.154C&#62;T, c.3847C&#62;T, c.5056C&#62;T, and c.4986+5G&#62;A, and confirmed that CRISPR-mediated base editors are useful tools for reclassifying the variants of uncertain significance in BRCA1. Here, we describe a protocol for functional analysis of BRCA1 variants using CRISPR-based cytosine base editor. This protocol provides guidelines for the selection of target sites, functional analysis and evaluation of BRCA1 variants.

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

People with BRCA1 mutations have a higher risk of developing cancer, which warrants accurate evaluation of the function of BRCA1 variants. Herein, we described a protocol for functional assessment of BRCA1 variants using CRISPR-mediated cytosine base editors that enable targeted C:G to T:A conversion in living cells.

CRISPR 중재 베이스 편집기사용 BRCA1 변종 기능 평가

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as drug resistance, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and metastasis. Intratumoral eATP is 103 to 104 times higher in concentration than in normal tissues. While eATP functions as a messenger to activate purinergic signaling for EMT induction, it is also internalized by cancer cells through upregulated macropinocytosis, a specific type of endocytosis, to perform a wide variety of biological functions. These functions include providing energy to ATP-requiring biochemical reactions, donating phosphate groups during signal transduction, and facilitating or accelerating gene expression as a transcriptional cofactor. ATP is readily available, and its study in cancer and other fields will undoubtedly increase. However, eATP study remains at an early stage, and unresolved questions remain unanswered before the important and versatile activities played by eATP and internalized intracellular ATP can be fully unraveled.
These authors&#39; laboratories&#39; contributions to these early eATP studies include microscopic imaging of non-hydrolysable fluorescent ATP, coupled with high- and low-molecular weight fluorescent dextrans, which serve as macropinocytosis and endocytosis tracers, as well as various endocytosis inhibitors, to monitor and characterize the eATP internalization process. This imaging modality was applied to tumor cell lines and to immunodeficient mice, xenografted with human cancer tumors, to study eATP internalization in vitro and in vivo. This paper describes these in vitro and in vivo protocols, with an emphasis on modifying and finetuning assay conditions so that the macropinocytosis-/endocytosis-mediated eATP internalization assays can be successfully performed in different systems.

We developed a reproducible method to visualize the internalization of nonhydrolyzable fluorescent adenosine triphosphate (ATP), an ATP surrogate, with high cellular resolution. We validated our method using independent in vitro and in vivo assays-human tumor cell lines and immunodeficient mice xenografted with human tumor tissue.

인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary tumor cells from surgically resected, malignant pleural mesothelioma (MPM) by providing a complete overview of the process from digestion to enrichment, expansion, cryopreservation, and phenotypic characterization. In addition, this protocol introduces concepts for tumor generation that may be useful for multiple tumor types such as differential trypsinization and the impact of dissociation methods on the detection of cell surface markers for phenotypic characterization. The major limitation of this study is the selection of tumor cells that will expand in a two-dimensional (2D) culture system. Variations to this protocol, including three-dimensional (3D) culture systems, media supplements, plate coating to improve adhesion, and alternate disaggregation methods, could improve this technique and the overall success rate of establishing a tumor line. Overall, this protocol provides a base method for establishing and characterizing tumor cells from this rare tumor.

The goal of this method paper is to demonstrate a robust and reproducible methodology for the enrichment, generation, and expansion of primary tumor cell lines from surgically resected pleural mesothelioma.

원발성, 악성 흉막 중피종 종양 라인의 생성 및 확장

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites have been the gold standards for conditional or inducible gene targeting. To provide faster and more efficient experimental models, an ex vivo organoid culture system is developed using adenovirus Cre and normal urothelial cells carrying multiple loxP alleles of the tumor suppressors Trp53, Pten, and Rb1. Normal urothelial cells are enzymatically disassociated from four bladders of triple floxed mice (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). The urothelial cells are transduced ex vivo with adenovirus-Cre driven by a CMV promoter (Ad5CMVCre). The transduced bladder organoids are cultured, propagated, and characterized in vitro and in vivo. PCR is used to confirm gene deletions in Trp53, Pten, and Rb1. Immunofluorescence (IF) staining of organoids demonstrates positive expression of urothelial lineage markers (CK5 and p63). The organoids are injected subcutaneously into host mice for tumor expansion and serial passages. The immunohistochemistry (IHC) of xenografts exhibits positive expression of CK7, CK5, and p63 and negative expression of CK8 and Uroplakin 3. In summary, adenovirus-mediated gene deletion from mouse urothelial cells engineered with loxP sites is an efficient method to rapidly test the tumorigenic potential of defined genetic alterations.

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

This protocol describes the process of the generation and characterization of mouse urothelial organoids harboring deletions in genes of interest. The methods include harvesting mouse urothelial cells, ex vivo transduction with adenovirus driving Cre expression with a CMV promoter, and in vitro as well as in vivo characterization.

Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...