독립적인 연구, 기술 및 생산, 덴마크어 위원회 #4005-00029 부여

실험적인 체제 윤리적 및 법적 제한이 있으며 로스킬레 대학 계약 실시 했다. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1 과 그림 2에 광학 카메라의 메커니즘에서 볼 수 있습니다.
1입니다. 준비
<ol><li>벤치 및 실험의 시작 이전에 70% 에탄올과 모든 장비를 청소 하 여 살 균 층 류 벤치에서 모든 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>셀에 대 한 최적의 조건을 보장 하기 위해 5% CO2 와 37 ° C에서 기존의 인큐베이터에 광학 카메라를 배치 합니다.</li>
	<li>10 %FBS T75 플라스 크에서 1 x 항생제 (페니실린과 스) DMEM 미디어에서 HaCaT 세포 성장.</li>
	<li>1 mL 1 x 트립 신을 사용 하 여 셀을 분리 하 고 하위 그들 매 3-4 일 함으로써 배양 세포 층에 분산. 사용 하기 전에 실내 온도에 열 중.</li>
</ol>2. 48-웰 스 결정 플레이트에 셀 생성 HaCaT의 단층
<ol><li>파스퇴르 피 펫과 T75 플라스 크에서 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>T75 플라스 크에 5 mL 1 x 살 균 PBS를 추가 하 여 플라스 크에 부착 세포를 씻어. 참고: PBS 칼슘과 마그네슘의 무료 인지 확인 합니다.</li>
	<li>PBS를 순환 하 고 파스퇴르 피 펫과 그것을 제거 합니다.</li>
	<li>2.2-2.3 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>플라스 크를 1 mL 1 x 트립 신을 추가 하 고 셀 계층에 걸쳐 분산.</li>
	<li>세포 분리 될 때까지 기존의 인큐베이터에서 37 ° C에서 플라스 크를 품 어 (5-8 분은 대부분 셀 라인에 대 한 충분 한).</li>
	<li>보기는 현미경에서 세포를 분리 하는 경우 일단 셀을 분리 하는 추가 10% 일반 문화 미디어의 9 mL 1 x 트립 신을 비활성화 하는 FBS.</li>
	<li>어느 hemocytometer와 셀 계산 coulter 카운터 또는 유사한. 참고: Trypan 블루 볼 죽은 세포를 사용할 수 있습니다. 그러나,에서 1 x trypsin HaCaT 세포는 완벽 하 게 라운드 때 살아.</li>
	<li>48-잘 조직 문화 라운드 바닥 플레이트 (표준 접시)에 250 µ L 10 %FBS 미디어에서 104 셀/잘 x 7.5를 전송 합니다. 참고: 분석 결과 또한 설정할 수 있습니다 6, 12, 24, 나는 모든 광학 현미경 분석 수 96 잘 접시에.</li>
	<li>부드럽게 접시 측면에서 세포는 동등 하 게 우물, 확산 되도록 좌우로 움직이거나 셀 우물의 센터에 모여 것입니다. 셀은 균등 하 게 언론에 확산 되도록 가벼운 현미경 검사</li>
	<li>하룻밤 또는 우물의 바닥에 셀은 준수 때까지 37 ° C에서 기존의 CO2 인큐베이터에 접시를 넣어.</li>
</ol>3입니다. 마이그레이션 효과 대 한 자극의 추가
<ol><li>우물은 90-95%는 가벼운 현미경 합칠 경우 확인 하십시오.</li>
	<li>미토마이신 C는 매체의 적절 한 금액에서의 10 µ g/mL를 준비 합니다. 참고: 이 연구에서는 미토마이신 C는 1 mg/mL에서 재고 솔루션에 4 ° C에서 유지 됩니다. 미토마이신 C 솔루션에서 2-8 ° c.에 어둠 속에서 1 주일에 저장 될 수 있다</li>
	<li>각 우물에서 파스퇴르 피 펫을 보낸된 미디어를 제거 합니다.</li>
	<li>각 우물에 미토마이신 C의 5 µ g/mL의 250 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>2 h 37 ° C, 5% CO2접시를 품 어.</li>
	<li>그들은 매체의 적절 한 금액에서을 diluting 하 여 펩 티 드의 자극을 준비 합니다. 참고: 이 연구에서는 인간과 소 Lactoferrin와 Lactoferricin 250 µ L의 볼륨에서 25 µ g/mL에서 테스트 되었습니다.</li>
	<li>미토마이신 C 파스퇴르 피 펫과 함께 매체를 제거 합니다.</li>
	<li>1 x 1 x PBS (실내 온도) 및 제거는 파스퇴르와 세척의 250 µ L 플라스틱 웰 스 워시.</li>
	<li>1 x PBS의 250 µ L을 추가 하 고 수동으로 200 µ L 피 펫 팁과 수직 우물 스크래치. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 합니다.</li>
	<li>PBS를 제거 하 고 250 µ L 펩 티 드 자극을 추가.</li>
	<li>접시의 양쪽에 나사를 조정 하 여 광학 카메라 시스템에 접시를 탑재 합니다. 결정에 뚜껑을 두고. 참고: 카메라 뚜껑을 열고 필요한 경우 작동할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 프로그램을 컴퓨터에 광학 카메라에 대 한 설정
<ol><li>왼쪽에 작업 표시줄에서 취득 을 클릭 합니다.</li>
	<li>왼쪽에 작업 표시줄에서 상처 치유 기능을 선택 합니다.</li>
	<li>플레이트 타입 플레이트 그림아래를 클릭 하 여 선택 합니다.</li>
	<li>그들을 표시 하 여 웰 스, 사용, 선택을 취소 하 고 화면에 왼쪽 상단에 사용 을 클릭 합니다. 참고: 모든 우물은 기본적으로 선택 됩니다.</li>
	<li>우물 우물 중 하나에 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 셀의 위치에 맞게에 렌즈의 초점을 조정 합니다. 참고: 자동 초점 또한 접시 그림의 오른쪽에 막대를 이동 하 여 수동으로 조정할 수 있습니다.</li>
	<li>사진 간격 에서 이미지에 대 한 기간을 설정 (예: (00: 30:00)).</li>
	<li>원하는 기간 (예: 97 반복)에 맞게 반복의 수를 설정 합니다.</li>
	<li>오른쪽 아래 모서리에 있는 시작 버튼을 클릭 하 여 실행을 시작 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

개발, 상처 치유, 면역학, 및 암 연구에 이동의 중요성 여러 다른 방법 마이그레이션 연구를 주도하 고 있다. 마이그레이션 확장의 표현 또는 셀에 의해 간격의 폐쇄 수 있습니다. 그것은 쉽게 하는 단층 세포 성장 이며 성장 하는 특정 폼8셀 보다 스크래치 스크래치의 가장 자주 폐쇄 테스트 됩니다. 우리의 연구는 기술 마스터 하기 쉽고 저렴 한 비용으로 수동 긁힘에 대 한 최적화 된 메서드를 보여 줍니다. 우리는 DNA 합성 억제제 미토마이신 C, 최적화 게시 방법18, 그리고 높은 처리량 연구를 허용 하는 광학 카메라의 사용에 비해 스크래치에 여분의 워시 도입.
생체 외에서 스크래치 시험 요구 우물의 바닥에 제대로 바인딩 부착 셀 라인 하 고 마이그레이션 스크래치, 감지 하 확산 저해 될 필요가. 이 두 기능은 분석 결과 대 한 필수적입니다. 진정한 마이그레이션, 검출 하기 위하여 몇 가지 방법은14, DMSO, 또는 다양 한 억제제 13,27긁 적 전에 셀을 배 혈 청 농도 낮추는와 설명 있다. 그러나 일반적으로 혈 청 자유로운 미디어를 사용할 수 있습니다, 그리고, 일부 셀 라인, 1 차 셀 라인, 이동 및 전반적인 생존을 위한 필요 혈 청 등. 따라서, 셀 라인에 따라 선택 하셔야 합니다. 수동 스크래치 코팅을 방해 것으로 셀 라인 코팅을 필요로 하는이 분석 결과에 문제가 될 수 있습니다 또한.
다른 세포 유형 그들의 크기와 성장 속도 따라 confluent 단층을 형성 하는 세포의 다른 번호를 필요 합니다. HaCaT 세포 후 약 4-6 h 준수 하지만 안정적인 단층을 하룻밤 정착 남아 있습니다. 스크래치 분석 결과의 주요 단점 중 하나는 불규칙 한 흠집8입니다. 이 연구에서 우리는 미리 PBS로 세척 하 고 새로운 PBS에 스크래치를 만드는 스크래치의 가장자리를 따라 부상 하 고 손상 된 세포의 축적을 감소를 보여줍니다. 이 듯 피부에 셀 연결 desmosomes 접속점에 의해 설명할 수 있었다. 접합은 캘리포니아2 +-종속24 PBS를 사용 하 여 양이온 제거 되는 강한 세포-세포 접착을 약하게 수 있습니다. 따라서, PBS 사용 하 여 수 세포의 더 나은 제거 개별적으로, 상처 가장자리 따라 셀의 덜 축적으로 이어지는 있습니다. 또한, 광학 카메라 모든 접시 크기에 우물의 넓은 부분을 측정 하 고 그것의 세 단계 알고리즘을 통해 처음에 bents에 적응. 따라서, PBS와 사전 세척 하 여, 광학 카메라를 사용 하 여 수동 흠집의 단점 제거 됩니다. 더 정확 하 게, 세포에 집중 하 게 이미지의 z 스태킹 하지만 셀 종류에 따라 성장, 초점 문제가 될 수 있습니다. 셀 너무 많은 성장, 카메라의 초점 밖의 초점에 포커스를 이동 합니다. 따라서, 미토마이신 C 사용 하지 않으면, 그것은 실험적인 체제 이상 24 시간 동안 실행 됩니다 경우 조금 더 포커스를 설정 하 수 있습니다. 광학 카메라는 결정 접시 접시에서 6에 96-잘 측정할 수 있는 직관적인 소프트웨어와 표준 컴퓨터를 통해 운영 되는 손쉬운 설치 하 고 따라서 다양 한 테스트 설정을 수 있습니다. 촬영 이미지의 수를 선택할 때 몇 가지 제한이 존재 한다. 96 잘 접시를 사용 하는 경우 하나를 얻을 수 있는 사진 수는 컴퓨터, 데이터 집합에는 공간을 제한 커질 수 있습니다, 그리고 카메라의 속도 의해입니다. 많은 사진을 필요한 경우 빠른 승계에, 카메라의 움직임 수 제한 요소 각각을 검사 하는 시간이 필요 잘.
광학 시스템은 간단 하지만 강력한 모니터링 수 있습니다. 스크래치의 사진 간격의 폐쇄 과정에 관한 분석 하지만 세포의 형태학 적 특성에도 사용할 수 있습니다. 소프트웨어는 노란색 셀을 표시 하 고 raw 이미지 명백 하 게를 사용할 수 있지만 그 예를 들어 게시에 필요 합니다 더 나은 상처 가장자리를 시각화 하기 위해 표준 기능으로 회색 배경 색상을 나뭇잎. HaCaT 세포 동적 시트28마이그레이션 발생 시키는 강한 세포 세포 상호 작용에 있다. 이 기능은 쉽게 (그림 4) 시간이 지남에 따라 마이그레이션 셀의 lamellipodia를 볼 수 있습니다.
이 연구는 Lactoferrin 단백질의 효과 및 그들의 파생된 N 맨끝 펩 티 드 Lactoferricin, 및 긍정적인 컨트롤로 EGF 하지만 억제제 또는 자극 다른 약물, 펩 티 드/단백질, 그리고 조합, 테스트를 수정할 수 있습니다. 상처 치유. 스크래치 분석 결과 변경 하 고 다양 한 셀 라인 및 마이그레이션에 영향을 미칠 수 있는 화합물에 맞게 최적화 될 수 있습니다. 함께, 그것의 저가 및 쉬운 관리와 함께이 분석 결과 대부분 실험실에 대 한 매우 액세스할 수 있습니다. 광학 카메라 다른 약물, 억제제 또는 마이그레이션, 뿐만 아니라 확산에 대 한 자극 테스트 사용 될 수 있습니다.

마이그레이션 여러 생리 적 측면을 영향을 미치는 중요 한 과정 이다. 상처 치유, 마이그레이션 용이 피부 다시 epithelization. 치유 되지 않은 상처, 만성 상처 등에서 기회 주의 박테리아 상처의 감염 원인과 오픈 상처 박테리아 성장과 biofilm1,2의 형성에 이상적입니다. Biofilm 내성 박테리아의 개발의 원인 중 하나는 우리의 현대 사회3에 가장 큰 위협 중 하나입니다. 상처 치유, 면역 세포는 biofilm을 침투 수 없습니다. 암, 암 세포의 전이의 중추적인 단계는 단단한 종양4,5환자에 대 한 죽음의 주요 원인입니다. 따라서, 그것은 마이그레이션 공부 수 중요 합니다.
스크래치 분석 결과 종종 저렴 하 고 쉽게 부착 셀 라인, 섬유 아 세포, 내 피, 상피 세포 라인6,7등에서 수행 하는 때문에 셀 마이그레이션 테스트 하는 데 사용 됩니다. 오늘, 흠집8, 수행 하기 위한 여러 가지 방법이 존재 하 고 다른 물자 보고 되었습니다 사용 되, 이쑤시개9, 셀 기구10, 레이저11및 전기 전류12를 포함 하 여. 모든 방법은 장단점이 서로 다른, 그리고 방법을 따라 셀 유형, 예산 및 분석 도구에 따라 결정 되어야 한다. 예를 들어, 사용한 셀 유형 코팅, 수동 압력 제거 해야 하는 경우 예: 이 쑤 시 게 또는 피 펫 팁, 영역 내에서 마이그레이션 영향, 다른 메서드를 사용 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 수동 근 근이 살아가고에 집중할 것 이다.
수동 스크에 대 한 단점은 크기의 변형, 긁힘, 모양 및 스크래치의 가장자리에서 셀의 축적. 많은 프로토콜 존재 하는, 그리고 높게 인용 된 종이 조언 증가 속도 및/또는 긁 적13후 철저 한 세척. 또한, 여러 가지 방법은 세포의 확산 마이그레이션 구별 수 없습니다 있기 때문에 따라서 이동의 허위-긍정적인 결과 줄 수 있습니다 확산을 최소화 하기 위해 사용 되었습니다. 일부 메서드는 혈 청 기아 스크래치14 이전 및 감소 하는 혈 청15의 양을 보고. 그러나,이 방법의 어느 쪽도 아니 확산은 보장할 수 있습니다. 따라서, 우리는 마이그레이션의 진정한 결과 미토마이신 C와 셀의 전처리를 보고 합니다. 미토마이신 C16분리에서 DNA를 방지 DNA와 공유 결합을 형성 하 여 DNA 합성을 억제 하는 항생제 이다. 미토마이신 C와 미리 치료 하 여 긁 기 전에 PBS로 세척 간격의 감지 된 폐쇄 세포 (그림 1)의 진정한 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.
모든 방법의 특성은 마이그레이션17의 프로세스를 분석 하는 시스템에 대 한 필요 이다. 일반적인 진행 상황을 분석 하는 싼 방법 빛 필드 현미경 이미지 소프트웨어18,19에 간격의 폐쇄의 분석 이어서 미리 정해진된 시간 지점에서 스크래치의 이미지를 사용 하 여 것입니다. 이 방법은 시간이 많이 걸리는, 같은 자리에서 초점, 사진 촬영에 관해서 신뢰할 수 없는 고 사진을 촬영 하는 동안 카메라를 인큐베이터에서 운동 사이클의 온도 변화를 강제로 합니다. 다른 방법은 마이그레이션 전류 흐름을 측정 하 여 검출 하기 위하여 개발 되었습니다. 현재 변경 셀 임피던스20증가 읽기는 접시에 더 많은 공간을 커버. 임피던스를 측정 하 여 세포의 환경 영향을 받지 않습니다, 그리고 방법을 따라서 비-침략 적으로 간주 됩니다. 이 방법은 비싸다, 골드 전극 전문된 접시에 의존 하지만 그들은 세포 부착, 확산, 마이그레이션, 세포 죽음 등 많은 프로세스 검색 사용. 이 방법의 큰 단점은 임피던스에 큰 영향을 미칠 온도 등의 요인으로 임피던스 측정 직접 마이그레이션, 표시 하지 않습니다 것입니다. 임피던스의 변화는 데이터의 분석을 더 어렵게 만드는 소프트웨어에 의해 검토 되지 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 따라서, 시각화의 마이그레이션을 확인 하려면 기존의 가벼운 현미경이 필요 합니다.
많은 사용 가능한 기술의 단점을 극복 하기 위해 우리는 실시간 자동된 광학 카메라를 사용 합니다. 광학 카메라는 렌즈, 조명 장치, 그리고 디지털 카메라와 함께 작은 플랫폼에서 높은 처리량 현미경 탐지 시스템입니다. 그것은 내장 소프트웨어를 마이그레이션 및 다른 것 들 사이에서 확산을 테스트할 수 있습니다. 마이그레이션 감지, 두 알고리즘은 성장과 확산 및 각각 분석, 치유 하는 상처 라고 하는 셀의 마이그레이션 활동을 분석 하는 데 사용 됩니다. 확산 분석은 적용 되는 텍스처 분석 셀 적용 영역 (노란색에서 표시) 간의 차이 감지 하는 2 단계 이미지 세분화 알고리즘에 따라 및 빈 고급 히스토그램 분석 영역 배경. 상처 치유 분석 셀 단층을 감지 하 고, 상처 간격을 찾습니다 하 고 간격 너비를 결정 하는 3 단계 알고리즘을 기반으로 합니다. 다음이 단계는 사용자가 지정한 시간-점에서 실시 하 고 데이터 적용된 지역, 간격 폭 및 간격 영역으로 제공 됩니다. 이 컴퓨터의 큰 장점 중 하나 이다 그 액체를 통해 부착 세포 이미징 카메라21의 각도 때문에. 하나의 z-비행기의 z 스택 예상 카메라 lenstakes 기울이면 이미지 사진 초점 (그림 2)을 생성 합니다. z-스택 상처 가장자리에 그리고 전체 상처에 걸쳐 수직 촬영 사진 (예: 40)의 시리즈를 병합 하 여 생성 됩니다. Z-스택 셀 계층에 초점 비행기의 깊이의 상처에서 캡처 수 있습니다. 또한, 이미지의 시리즈는 버튼의 클릭으로 이미지의 비디오 컬렉션을 함께 넣어 수 있습니다.
마이그레이션 keratinocyte 셀 라인 HaCaT에서의 검색을 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 우리 테스트 Lactoferrin 및 그것의 N 맨끝 펩 티 드, Lactoferricin, 인간과 소,이 분자 항균 및 면역 조절 분자22 수많은 응용 프로그램을가지고 입증 되었습니다 마이그레이션에 미치는 영향 분석에서 , 23. 4 개의 화합물 치료 HaCaT 세포에 비교 했다와 표 피 성장 인자 (EGF) 긍정적인 제어로 사용 되었다.

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>Optical camera</td></tr><tr><td>UniExplorer software&amp;nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr><td>HaCaT cell</td><td></td><td></td><td>Donated from Bispebjerg Hospital</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>Medium for HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Without Mg+ and Ca2+</td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Trypsin (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Inhibits proliferation</td></tr><tr><td>Microtiter plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37&amp;deg;C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Assistent</td><td></td><td>T&amp;uuml;rk (0.1 mm)</td></tr><tr><td>Pipet boy</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

셀 이동 건강, 암, 상처 치유 등의 여러 측면에 영향을 미치는 중요 한 프로세스 이며 그것은, 따라서, 마이그레이션 공부 방법 개발을 위한 중요 한. 스크래치 분석 결과 가장 일반적인 생체 외에서 방법 그것의 저가 및 간단한 절차 때문에 안티 프로 migration 속성으로 화합물을 테스트 하. 그러나, 분석 결과의 자주 보고 하는 문제는 처음의 가장자리에 걸쳐 세포의 축적을 이다. 또한, 분석 결과에서 데이터를 얻기 위해 다른 노출의 이미지 이동 해야 시간의 기간 동안 정확한 같은 자리에는 이동의 움직임을 비교 하. 다른 분석 프로그램 스크래치 폐쇄를 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만 그들은 노동 집약, 부정확 한, 및 온도 변화에의 힘 주기. 이 연구에서는 마이그레이션 효과, 예를 들면 자연스럽 게 발생 단백질 인간 및 소 Lactoferrin 및 그들의 N 맨끝 펩 티 드 Lactoferricin HaCaT 상피 세포 선에 대 한 최적화 된 방법을 설명 합니다. 중요 한 최적화는 세척 하 고 가장자리를 따라 셀의 상기 축적을 제거 하는 PBS에 스크래치 이다. 이 keratinocyte-셀 연결에 영향을 보여왔다 양이온의 제거에 의해 설명 될 수 있습니다. 이동의 진정한 검출을 보장 하기 위해, 미리 미토마이신 C, DNA 합성 억제제로 치료 프로토콜에 추가 되었습니다. 마지막으로, 우리는 재현성에 개선 하 고 시간이 지남에 스크래치의 동일한 섹션의 분석을 보장 하면서 자동된 광학 카메라, 과도 한 온도 사이클 제거 스크래치 폐쇄 분석, 육체 노동 방법을 보여 줍니다.

HaCaT은 keratinocyte 셀 라인, 피부에서 가장 풍부한 셀 형식 중 하나입니다. 상처 발생, 피부 세포 증식 및 상처 침대를 닫습니다 (그림 3) 상처를 통해 마이그레이션 시작 합니다. 두 프로세스는, 그러므로, 적절 한 치료에 매우 중요.
광학 카메라는 실시간으로 두 프로세스를 따를 수 있습니다. 마이그레이션, 시스템 제공 3 데이터 세트: 셀 적용 지역, 간격 폭 및 간격 지역. Lactoferrin, Lactoferricin 또는 EGF 치료 모니터링 흠집, 광학 현미경 수 있습니다 시간이 지남에 따라 이러한 세 가지 매개 변수를 모니터링. 48 h 부 화 후 우리는 EGF의 상처, 치료 컨트롤 (그림 3A)의 38% 폐쇄에 비해 95% 폐쇄 귀착되는 관찰 합니다. Lactoferrin 및 Lactoferricin의 다른 버전은 33%와 62% 상처 폐쇄 사이 부모 단백질 보다 더 강력한 되 고 펩 티 드와 함께 배치 됩니다. 상처 폐쇄, 초기 처음부터 간격 폭에 따른 결정의 비율 수 있습니다 (그림 3B)를 꾸몄다.
HaCaT 세포는 강한 세포 세포 상호 작용 있고 셀 마이그레이션할 때 일련의 단계는 필요한24. 곧, 최고의 세포 접착의 그들의 사이트, 내 다, 하 고 이동25골격 계약 됩니다. 최고의 셀의 돌출은 광학 카메라 (그림 4)와 함께 쉽게 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig1.jpg"> 그림 1 : 테스트는 광학 카메라에 마이그레이션 스크래치 분석 결과의 개요 순서도. HaCaT 세포는 48-잘 접시에 도금 고 24 h에 대 한 준수 허용. 셀은 미리 미토마이신 C 2 h 확산 억제를 위한 치료 그리고 처음 수행 및 펩 티 드 자극의 추가 의해 따라. 접시는 광학 카메라의 장치에 삽입 되 고 마이그레이션 48 h에 대 한 다음.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig2.jpg"> 그림 2 : 광학 카메라의 스캐닝 기술. 자동된 광학 카메라 광학 렌즈 단위 6.25 ° 세균과 세포 솔루션 등 다양 한 솔루션을 통해 스캔 수 있도록 수평 평면에 직각 이다. 이미지의 획득된 일련의 모든 초점을 맞추고, 밖으로의 초점, 포커스, 포커스 셀 이미지를 보장 하기 위해 이미지 스택을 포함. 26에서 수정.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig3.jpg"> 그림 3 : 마이그레이션 사전 처리 미토마이신 C HaCaT 세포의 48 시간 이상. (A) 마이그레이션 48 h에 대 일 분 간격 자동된 광학 카메라에 감지. 세포 확산을 억제 하기 위해 미토마이신 C 사전 처리 됩니다. 셀 인간적-또는 소-Lactoferrin (H-LF 또는 LF B) 또는 (H-LFcin, B LFcin)-Lactoferricin의 25 µ g/mL로 처리 됩니다. 상피 성장 인자 (EGF) 500 ng/mL에서 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 치료 HaCaT 세포는 컨트롤로 사용 됩니다. (B)는 치료의 이동의 그래픽 그림. 결과 3 개의 독립적인 실행의 대표 그리고 결과 초기 스크래치의 백분율 폐쇄로 받는다 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57691/57691fig4.jpg"> 그림 4 : HaCaT 세포 치료의 lamellipodia 튀어나와. Lamellipodia HaCaT 세포의 검은 화살표에 의해 표시 된다. 그들은 이동 하 고 시간이 지남에 쉽게 관찰 될 수 있다는 HaCaT의 강한 세포 세포 상호 작용은 세포의 동적 움직임에 결과.

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.9K 조회수.  Roskilde University. 여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

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Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

연구

암 연구학

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

발생학

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

환경과학

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

의학

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

생물학

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

T-Cell Kinetics의 해명: 실시간 이동 분석 방법

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

저자 스포트라이트: T 세포 이동의 실시간 분석을 통한 질병 메커니즘 이해

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

요약

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셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay