Consiglio danese per la ricerca indipendente, tecnologia e produzione, concedere #4005-00029

La messa a punto sperimentale non ha alcuna restrizione etici e giuridici ed è stata condotta in accordo con l'Università di Roskilde. Una panoramica della disposizione sperimentale può essere visto in Figura 1 e i meccanismi della telecamera ottica nella Figura 2.
1. preparazione
<ol><li>Eseguire tutti i passaggi in un banco di flusso laminare sterile pulendo la panchina e tutte le attrezzature con etanolo al 70% prima dell'inizio dell'esperimento.</li>
	<li>Posizionare la fotocamera ottica in un convenzionale incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per garantire le condizioni ottimali per le cellule.</li>
	<li>Crescere le cellule HaCaT nei media DMEM con 10% FBS e 1x antibiotici (penicillina e streptomicina) in un matraccio da T75.</li>
	<li>Utilizzare tripsina 1 x 1ml per staccare le cellule e sub-coltivare ogni 3-4 giorni, dalla dispersione di esso sopra lo strato cellulare. Pre-riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
</ol>2. generazione di un monostrato di HaCaT cellule in micropiastra 48-pozzi
<ol><li>Rimuovere il supporto dal pallone T75 con una pipetta Pasteur.</li>
	<li>Lavare le cellule aderenti nel matraccio aggiungendo 5 mL 1X PBS sterile al pallone T75. Nota: Assicurarsi che il PBS sia privo di calcio e magnesio.</li>
	<li>Circolare del PBS e rimuoverlo con una pipetta Pasteur.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.2-2.3.</li>
	<li>Aggiungere tripsina 1 x 1 mL al pallone e si sparpagliano per tutto lo strato delle cellule.</li>
	<li>Incubare la beuta a 37 ° C in un incubatore convenzionale fino a quando le cellule sono staccate (5-8 minuti è sufficienti per la maggior parte delle linee cellulari).</li>
	<li>Vista al microscopio se le cellule sono staccate. Una volta che le cellule sono staccate, aggiungere 9 mL di coltura regolare con 10% FBS per inattivare la tripsina 1x.</li>
	<li>Contare la cella con entrambi un emocitometro, un contatore coulter o simili. Nota: Tripan blu può essere utilizzato per visualizzare le cellule morte. Tuttavia, in tripsina 1x HaCaT cellule sono perfettamente rotondi quando vivo.</li>
	<li>Trasferimento 7,5 x 104 cellule/pozzetto nei mezzi di comunicazione di 250 µ l 10% FBS ad una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti a fondo tondo (piastra standard). Nota: l'analisi può essere impostato anche in 6, 12, 24 o piastre a 96 pozzetti, che tutti possono essere analizzate al microscopio ottico.</li>
	<li>Delicatamente spostare la piastra da lato a lato per garantire che le cellule sono equamente ripartite nei pozzetti, o le cellule si riuniranno nel centro dei pozzi. Controllare sotto un microscopio chiaro per assicurarsi che la cella è uniformemente nei media</li>
	<li>Mettere il piatto in un convenzionale CO2 incubatore a 37 ° C durante la notte o fino a quando le cellule hanno aderito al fondo dei pozzetti.</li>
</ol>3. aggiunta di stimoli per gli effetti di migrazione
<ol><li>Verifica se i pozzi sono 90-95% confluenti sotto un microscopio chiaro.</li>
	<li>Preparare 10 µ g/mL di mitomicina C in un importo appropriato del mezzo. Nota: In questo studio, Mitomycin C è conservato a 4 ° C in una soluzione di riserva a 1 mg/mL. Mitomicina C in soluzione possa essere conservato fino a una settimana al buio a 2-8 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supporto speso con una pipetta Pasteur da ciascun pozzetto.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di 5 µ g/mL di mitomycin C in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Incubare la piastra per 2 ore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Preparare gli stimoli dei peptidi diluendo in un importo appropriato del mezzo. Nota: In questo studio, umane e bovine lattoferrina sia il Lactoferricin sono stati testati a 25 µ g/mL in un volume di 250 µ l</li>
	<li>Rimuovere il mezzo con il mitomycin C con una pipetta Pasteur.</li>
	<li>Lavare i pozzetti 1x con 250 µ l di 1X PBS (temperatura ambiente) e Rimuovi il lavaggio con un Pasteur pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di 1X PBS e graffiare manualmente i pozzetti verticalmente con una punta di pipetta 200 µ l. Usare un nuovo puntale per ciascun pozzetto.</li>
	<li>Rimuovere il PBS e aggiungere stimoli di peptide 250 µ l.</li>
	<li>Montare la piastra nel sistema ottico fotocamera regolando le viti su entrambi i lati della piastra. Lasciare il coperchio sulle micropiastre. Nota: La telecamera può funzionare con il coperchio aperto se necessario.</li>
</ol>4. impostare il programma per la telecamera ottica sul Computer
<ol><li>Fare clic su Acquisisci nella barra a sinistra.</li>
	<li>Scegliere la funzione di guarigione delle ferite nella barra a sinistra.</li>
	<li>Scegliere il tipo di piastra cliccando qui sotto l' illustrazione di piastra.</li>
	<li>Deseleziona i pozzi, non è in uso, contrassegnandoli e fare clic su attiva in alto a sinistra sullo schermo. Nota: Per impostazione predefinita vengono selezionati tutti i pozzetti.</li>
	<li>Regolare la messa a fuoco dell'obiettivo su pozzetti per adattarsi alla posizione delle celle facendo clic su uno dei pozzi. Nota: Autofocus può anche essere regolata manualmente spostando la barra a destra dell'illustrazione piatto.</li>
	<li>Impostare il periodo di tempo per le immagini sotto Intervallo di foto (ad es. (00:30:00)).</li>
	<li>Impostare il numero di ripetizione per adattare il periodo desiderato (ad esempio 97 ripetizioni).</li>
	<li>Iniziare la corsa facendo clic sul pulsante Start in basso a destra.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. 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R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'importanza dell'immigrazione negli studi di sviluppo, la guarigione della ferita, immunologia ed il cancro ha portato a diversi metodi per studiare la migrazione. Migrazione può essere un'espressione dell'espansione o la chiusura del divario dalle cellule. Più spesso la chiusura del graffio viene testata, come è più facile crescere le cellule in un monostrato e poi fare un graffio che la coltivazione di cellule in una forma specifica di8. Il nostro studio dimostra un metodo ottimizzato per s...

La migrazione è un processo importante che influenza diversi aspetti fisiologici. Nella guarigione delle ferite, migrazione facilita la riepitelizzazione della pelle. Nelle ferite non guariscono, quali ferite croniche, batteri opportunisti causano infezione della ferita, e ferite aperte sono ideali per la crescita di batteri e la formazione di biofilm1,2. Biofilm è una delle cause dello sviluppo di batteri resistenti, che è una delle maggiori minacce per la nostra società moderna3. Nella guarigione della ferita, le cellule immunitarie non possono penetrare il biofilm. Nel cancro, migrazione delle cellule tumorali è un passo fondamentale della metastasi, che è la causa principale di morte per i pazienti con tumori solidi4,5. Pertanto, è fondamentale essere in grado di studiare la migrazione.
L'analisi di gratta e Vinci è spesso usata per testare la migrazione cellulare perché è economico e facile da eseguire sulle linee cellulari aderenti, ad esempio del fibroblasto, endoteliale e delle cellule epiteliali linee6,7. Oggi, esistono diversi metodi per l'esecuzione di graffi8, e diversi materiali sono stati segnalati per essere utilizzato, compreso stuzzicadenti9, cella raschietti10, laser11e correnti elettriche12. Tutti i metodi sono diversi Pro e contro, e il metodo dovrebbe essere decisi secondo lo strumento di analisi, budget e tipo di cella. Ad esempio, se il tipo di cella utilizzata richiede rivestimento, rimozione manuale della pressione, ad esempio con una punta di uno stuzzicadenti o una pipetta, influenzerà la migrazione all'interno dell'area, deve essere utilizzato un metodo diverso. In questo studio, ci concentreremo sulla raschiatura manuale.
Un aspetto negativo per raschiatura manuale è la variazione delle dimensioni, forme dei graffi e l'accumulazione delle cellule sui bordi del graffio. Esistono molti protocolli, e una carta più citato consigli aumentata velocità e/o lavaggio accurato dopo graffiare13. Inoltre, sono stati utilizzati diversi metodi per ridurre al minimo la proliferazione, poiché la proliferazione delle cellule non si distingue dalla migrazione e pertanto può dare risultati falsi-positivi della migrazione. Alcuni segnalati sono metodi deprivazione di siero precede il gratta e Vinci14 e diminuendo la quantità di siero15. Tuttavia, nessuno di questi metodi possono garantire che non c'è nessuna proliferazione. Quindi, segnaliamo un pre-trattamento delle cellule con mitomicina C per garantire risultati veri della migrazione. Mitomicina C è un antibiotico che inibisce la sintesi del DNA formando un legame covalente con il DNA, che impedisce che il DNA che separa16. Pre-trattamento con mitomicina C e lavaggi con PBS prima di graffiare, la chiusura rilevata del gap dimostra la vera migrazione delle cellule (Figura 1).
Una caratteristica di tutti i metodi è la necessità di un sistema analizzare il processo di migrazione17. Un metodo economico per analizzare lo stato di avanzamento e un comune consiste nell'utilizzare un microscopio a luce-campo per prendere immagini dello scratch in intervalli di tempo predeterminati, seguita da un'analisi della chiusura del divario in un'immagine software18,19. Questo metodo è che richiede tempo, inaffidabili per quanto riguarda scattare foto presso il punto stesso e la messa a fuoco, e il movimento da incubatrice per fotocamera impone cicli delle variazioni di temperatura mentre le immagini sono prese. Altri metodi sono stati sviluppati per rilevare migrazione misurando il flusso di corrente. Le modifiche apportate, come celle di coprono più spazio sul piatto, che viene letto come un aumento nell' impedenza20. Misurando l'impedenza, l'ambiente delle cellule non è interessato, e il metodo è pertanto considerato invasivo. Questo metodo si basa su piatti specializzati con elettrodi d'oro, che sono costosi, ma consentono il rilevamento di molti processi, quali l'adesione cellulare, la proliferazione, migrazione e morte cellulare. Un grande svantaggio di questo metodo è che la misurazione dell'impedenza non direttamente indicare la migrazione, come fattori quali la temperatura hanno un grande impatto sull'impedenza. Modifiche nell'impedenza possono essere causate da diversi fattori che non vengono esaminati dal software, rendendo più difficile l'analisi dei dati. Di conseguenza, la mancanza di visualizzazione richiede un microscopio a luce convenzionale per verificare la migrazione.
Per superare molti degli aspetti negativi delle tecniche disponibili, usiamo una telecamera ottica automatizzata in tempo reale. La camera ottica è un sistema di rilevamento con un microscopio ad alta velocità in una piccola piattaforma con una lente, unità di illuminazione e una fotocamera digitale. Ha un built-in software, che può testare la migrazione e la proliferazione tra le altre cose. Per rilevare la migrazione, due algoritmi vengono utilizzati per analizzare la crescita e la cinetica di migrazione delle cellule, che sono chiamati la proliferazione e la cicatrizzazione analisi, rispettivamente. L'analisi di proliferazione si basa su un algoritmo di segmentazione di un'immagine in due fasi che applica texture analisi per rilevare la differenza tra zone coperte delle cellule (indicato in giallo) e vuoto aree di base di analisi Istogramma avanzato. L'analisi di cicatrizzazione è basato su un algoritmo di tre fasi che rileva il monostrato cellulare, individua il divario di ferita e determina la larghezza del gap. Questi passaggi sono condotti a intervalli di tempo definiti dall'utente, e i dati sono presentati come superficie coperta, larghezza di spacco e zona gap. Uno dei grandi vantaggi di questa macchina è che esso permette l'imaging delle cellule aderenti attraverso liquido a causa dell'angolo della telecamera21. Le immagini di lenstakes inclinato della telecamera che si proiettano a uno z-stack di un singolo z-plane generano per garantire che le foto sono a fuoco (Figura 2). z-stack vengono generati dalla fusione della serie di immagini (ad es. 40) prese perpendicolare al bordo della ferita e attraverso l'intera ferita. Gli z-stack consente l'acquisizione della profondità dello strato delle cellule come pure un piano di messa a fuoco attraverso la ferita. Inoltre, la serie di immagini possono essere messi insieme per una collezione di immagini, video con il clic di un pulsante.
Dimostriamo un protocollo ottimizzato per il rilevamento della migrazione nella linea cellulare dei cheratinociti HaCaT. Abbiamo testato la lattoferrina e suo peptide N-terminale, Lactoferricin, da esseri umani e mucche, per analizzare il loro effetto sulla migrazione come queste molecole hanno dimostrate di avere numerose applicazioni come antimicrobico e immunitario modulando molecole22 , 23. i quattro composti sono stati confrontati con cellule HaCaT non trattate e fattore di crescita epidermico (EGF) è stato usato come controllo positivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Migrazione delle cellule è un processo importante che influenza molti aspetti della salute, come ad esempio la guarigione della ferita e cancro, e, pertanto, è cruciale per lo sviluppo di metodi per lo studio della migrazione. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato a lungo il più comune metodo di in vitro per testare composti con proprietà anti - e pro - emigrazione a causa del sua basso costo e semplice procedura. Tuttavia, un problema spesso segnalati del dosaggio è l'accumulo di cellule attraverso il bordo del graffio. Inoltre, per ottenere dati del dosaggio, immagini di esposizioni diverse devono adottare per un periodo di tempo a nello stesso punto per confrontare i movimenti della migrazione. Analisi di diversi programmi possono essere utilizzati per descrivere la chiusura gratta e Vinci, ma sono ad alta intensità di manodopera, imprecise e cicli di forze delle variazioni di temperatura. In questo studio, dimostriamo un metodo ottimizzato per testare l'effetto di migrazione, ad esempio con le proteine naturale, umani e bovini-lattoferrina e loro peptide N-terminale Lactoferricin sulla linea cellulare epiteliale HaCaT. Un'ottimizzazione cruciale è quello di lavare e gratta e Vinci in PBS, che elimina il suddetto accumulo di cellule lungo il bordo. Questo potrebbe essere spiegato dalla rimozione di cationi, che sono stati indicati per avere un effetto sulla connessione cellulare dei cheratinociti. Per garantire la vera rivelazione della migrazione, pre-trattamento con mitomicina C, un inibitore della sintesi del DNA, è stato aggiunto al protocollo. Infine, dimostriamo l'automatizzato telecamera ottica, che elimina i cicli di temperatura eccessiva, lavoro manuale con analisi di chiusura sul gratta e Vinci, migliorando sulla riproducibilità e garantire un'analisi di sezioni identiche dello scratch nel corso del tempo.

HaCaT è una linea cellulare dei cheratinociti, uno dei tipi più abbondanti delle cellule della pelle. Quando si verifica una ferita, le cellule della pelle iniziano a proliferare e migrare sopra al letto della ferita per chiudere la ferita (Figura 3). Entrambi i processi sono, quindi, della massima importanza per la corretta guarigione.
La camera ottica può seguire entrambi i processi in tempo re...

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Qui descriviamo una procedura per verificare la migrazione cellule in vitro con un microscopio ottico automatizzato fotocamera. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato ampiamente usato dove la chiusura del graffio è seguita per un periodo determinato. Il microscopio ottico consente un rilevamento affidabile e a buon mercato della migrazione cellulare.

Ottimizzato Scratch test per test In Vitro della migrazione cellulare con una fotocamera ottica automatizzata

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.8K Views.  Roskilde University. Qui descriviamo una procedura per verificare la migrazione cellule in vitro con un microscopio ottico automatizzato fotocamera. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato ampiamente usato dove la chiusura del graffio è seguita per un periodo determinato. Il microscopio ottico consente un rilevamento affidabile e a buon mercato della migrazione cellulare.

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Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semiautomatici Analisi Heartbeat ottica di piccoli cuori

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

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Biologia

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

Un In vitro FluoroBlok Tumore Assay Invasion

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induzione e test di ipossia in coltura cellulare

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em&gt; In Vitro</em&gt; Studio di Angiogenesi

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

I filamenti intermedi e microtubuli con microscopia di ricostruzione ottico stocastico diretto 2-dimensionale di imaging

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae has made it a pre-eminent genetic model organism. However, since efficient protein isolation depends upon optimal disruption of cells, the use of yeast for biochemical analysis of cellular proteins is hampered by its cell wall which is expensive to digest enzymatically (using lyticase or zymolyase), and difficult to disrupt mechanically (using a traditional bead beater, a French press or a coffee grinder) without causing heating of samples, which in turn causes protein denaturation and degradation. Although manual grinding of yeast cells under liquid nitrogen (LN2) using a mortar and pestle avoids overheating of samples, it is labor intensive and subject to variability in cell lysis between operators. For many years, we have been successfully preparing high quality yeast extracts using cryogrinding of cells in an automated freezer mill. The temperature of -196 &#176;C achieved with the use of LN2 protects the biological material from degradation by proteases and nucleases, allowing the retrieval of intact proteins, nucleic acids and other macromolecules. Here we describe this technique in detail for budding yeast cells which involves first freezing a suspension of cells in a lysis buffer through its dropwise addition into LN2 to generate frozen droplets of cells known as "popcorn". This popcorn is then pulverized under LN2 in a freezer mill to generate a frozen "powdered" extract which is thawed slowly and clarified by centrifugation to remove insoluble debris. The resulting extracts are ready for downstream applications, such as protein or nucleic acid purification, proteomic analyses, or co-immunoprecipitation studies. This technique is widely applicable for cell extract preparation from a variety of microorganisms, plant and animal tissues, marine specimens including corals, as well as isolating DNA/RNA from forensic and permafrost fossil specimens.

We describe a reliable method for the preparation of whole cell extracts from yeast or other cells using a cryogenic freezer mill that minimizes degradation and denaturation of proteins. The cell extracts are suitable for purification of functional protein complexes, proteomic analyses, co-immunoprecipitation studies and detection of labile protein modifications.

Preparazione di estratti cellulari mediante criogrinding in un congelatore automatizzato

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

Un saggio di migrazione dei graffi economico e adattabile

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.