Conselho dinamarquês de pesquisa independente, tecnologia e produção, conceder #4005-00029

A instalação experimental não tem nenhuma restrição ética e legal e foi conduzida de acordo com a Universidade de Roskilde. Uma visão geral sobre a montagem experimental pode ser vista na Figura 1 e os mecanismos da câmara óptica na Figura 2.
1. preparação
<ol><li>Execute todas as etapas em um banco do fluxo laminar esterilizado por limpar a bancada e todos os equipamentos com etanol a 70% antes do início do experimento.</li>
	<li>Coloque a câmara óptica numa incubadora convencional a 37 ° C com 5% de CO2 para garantir condições ideais para as células.</li>
	<li>Desenvolvem-se células HaCaT na mídia DMEM com 10% FBS e 1 x antibióticos (penicilina e estreptomicina) num balão T75.</li>
	<li>Use tripsina de 1 x 1 mL para separar as células e sub, cultivá-las a cada 3-4 dias, por isso dispersar sobre a camada celular. Pré-aqueça a temperatura ambiente antes do uso.</li>
</ol>2. gerar uma monocamada de HaCaT células em uma placa de microtitulação de 48-poços
<ol><li>Remova o meio do balão T75 com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Lave as células aderentes no frasco, adicionando 5 mL 1X PBS estéril para o balão de T75. Nota: Certifique-se de que o PBS é livre de cálcio e magnésio.</li>
	<li>Circule a PBS e removê-lo com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Repita a etapa 2.2-2.3.</li>
	<li>Adicionar tripsina de 1 x 1 mL no balão e dispersá-la em toda a camada de células.</li>
	<li>Incubar o frasco a 37 ° C numa incubadora convencional até que as células são desanexadas (5-8 min é suficiente para a maioria das linhas de células).</li>
	<li>Ver no microscópio se as células são desanexadas. Uma vez que as células são desanexadas, adicionar 9 mL dos meios de cultura regular com 10% FBS para inactivar a tripsina 1 x.</li>
	<li>Contar a célula com qualquer um hemocytometer, um contador de coulter ou similar. Nota: Trypan azul pode ser usado para exibir as células mortas. No entanto, em tripsina 1 x HaCaT células são perfeitamente redonda quando vivo.</li>
	<li>Transferi 7,5 x 104 células/poço em 250 µ l 10% FBS meios de comunicação social para uma cultura de tecidos de 48-poço redondo placa (padrão). Nota: ensaio também pode ser configurado em 6, 12, 24-ou placas de 96 poços, que tudo podem ser analisadas ao microscópio óptico.</li>
	<li>Mover suavemente a placa de lado para lado para garantir que as células estão igualmente distribuídas em poços, ou as células irão se reunir no centro de poços. Inspecionar sob um microscópio de luz para certificar-se de que a célula é espalhada uniformemente na mídia</li>
	<li>Colocar a placa numa incubadora convencional CO2 a 37 ° C durante a noite ou até que as células tenham aderido ao fundo dos poços.</li>
</ol>3. adição de estímulos para efeitos de migração
<ol><li>Verifique se os poços estão confluente de 90-95% sob um microscópio de luz.</li>
	<li>Prepare-se 10 µ g/mL de mitomicina C em uma quantidade apropriada de médio porte. Nota: Neste estudo, mitomicina C é mantido a 4 ° C em uma solução de 1 mg/ml. Mitomicina C em solução pode ser armazenada até uma semana no escuro a 2-8 ° C.</li>
	<li>Remova a mídia passou com uma pipeta Pasteur de cada poço.</li>
	<li>Adicione 250 µ l de 5 µ g/mL de mitomicina C para cada poço.</li>
	<li>Incube a placa por 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Prepare-se estímulos de peptídeos diluindo-os em uma quantidade apropriada de médio porte. Nota: Neste estudo, tanto a humana e bovina lactoferrina e Lactoferricin foram testados em 25 µ g/mL em um volume de 250 µ l</li>
	<li>Remova o meio com mitomicina C com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Lave os poços 1x com 250 ml de 1X PBS (temperatura ambiente) e remover a lavagem com uma Pasteur pipeta.</li>
	<li>Adicionar 250 µ l de 1X PBS e riscar manualmente os poços verticalmente com a ponta da pipeta 200 µ l. Use uma ponta de pipeta nova para cada poço.</li>
	<li>Remova a PBS e adicione 250 estímulos de peptídeo µ l.</li>
	<li>Monte a placa no sistema óptico da câmera, ajustando os parafusos em ambos os lados da placa. Deixe a tampa da placa de microtitulação. Nota: A câmera pode operar com a tampa aberta, se necessário.</li>
</ol>4. configurar o programa para a câmara óptica no computador
<ol><li>Clique em Acquire na barra de tarefas à esquerda.</li>
	<li>Escolha a função de cicatrização de feridas na barra de tarefas à esquerda.</li>
	<li>Escolha o tipo de placa clicando abaixo a ilustração da placa.</li>
	<li>Cancelar a seleção de poços, não estiver em uso, marcando-os e clique em habilitar no lado superior esquerdo na tela. Nota: Todos os poços são selecionados por padrão.</li>
	<li>Ajuste o foco da lente em poços para ajustar a posição das células clicando em um dos poços. Nota: Autofocus também pode ser ajustado manualmente, movendo a barra à direita da ilustração a placa.</li>
	<li>Definir o período de tempo para imagens em Intervalo de imagens (por exemplo, (00:30:00)).</li>
	<li>Defina o número de repetições para caber o período desejado (por exemplo, 97 repetições).</li>
	<li>Começa a correr, clicando no botão Iniciar no canto inferior direito.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. 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R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A importância da migração em estudos de desenvolvimento, cicatrização de feridas, imunologia e câncer levou a diversos métodos para estudar a migração. Migração pode ser uma expressão da expansão ou o fechamento da lacuna pelas células. Mais frequentemente o encerramento da Risque é testado, como é mais fácil cultivar células em um monolayer e então fazer um arranhão do que o crescimento das células em uma forma específica de8. Nosso estudo demonstra um método otimizado para...

A migração é um processo importante que influencia diversos aspectos fisiológicos. Na cicatrização de feridas, migração facilita a fase de re-epitelização da pele. Em feridas não-cura, tais como feridas crônicas, bactérias oportunistas causar infecção da ferida, e feridas abertas são ideais para o crescimento de bactérias e formação de biofilme1,2. Biofilme é uma das causas do desenvolvimento de bactérias resistentes, que é uma das maiores ameaças à nossa sociedade moderna3. Na cicatrização de feridas, as células do sistema imunológico não consegue penetrar o biofilme. Em câncer, migração de células cancerosas é um passo crucial de metástase, que é a principal causa de morte para pacientes com tumores sólidos4,5. Portanto, é crucial poder estudar a migração.
O ensaio de zero é frequentemente usado para testar a migração celular, porque é barato e fácil de realizar em linhas de células aderentes, tais como fibroblasto, endotelial e a célula epitelial linhas6,7. Hoje, existem vários métodos para executar arranhões8, e materiais diferentes foram relatados para ser usado, incluindo célula raspadores10palitos9, lasers11e correntes elétricas12. Todos os métodos têm diferentes prós e contras, e o método deve ser decidido de acordo com a ferramenta de tipo, orçamento e análise de célula. Por exemplo, se o tipo de célula usada necessita de revestimento, remoção de pressão manual, por exemplo, com uma ponta de palito de dente ou pipeta, influenciará a migração dentro da área, deve ser usado um método diferente. Neste estudo, focaremos na raspagem manual.
Uma desvantagem para raspagem manual é a variação do tamanho, as formas dos arranhões e acúmulo de células nas bordas da risque. Existem muitos protocolos, e um papel altamente citados aconselha aumentou a velocidade e/ou lavagem completa após coçar13. Além disso, vários métodos têm sido utilizados para minimizar a proliferação, uma vez que a proliferação das células não pode ser distinguida da migração e, portanto, pode dar resultados falso-positivos da migração. Alguns relataram métodos são fome soro precede o zero14 e diminuindo a quantidade de soro15. No entanto, nenhum desses métodos pode garantir que não há nenhuma proliferação. Portanto, nós relatamos um pré-tratamento das células com mitomicina C para garantir resultados verdadeiros da migração. Mitomicina C é um antibiótico que inibe a síntese de DNA, formando uma ligação covalente com o DNA, o que impede o DNA de separar16. Pré-tratamento com mitomicina C e lavagem com PBS antes de coçar, detectado encerramento do gap demonstra a verdadeira migração das células (Figura 1).
Uma característica de todos os métodos é a necessidade de um sistema analisar o processo de migração17. Um método de baixo custo para analisar o progresso e um comum é usar um microscópio de luz-campo para tirar fotos da risque em pontos de tempo pré-determinado, seguidos por uma análise do fechamento de gap em um software de imagem18,19. Este método é demorado, não confiável com relação ao tirar fotos no mesmo lugar e foco, e o movimento da incubadora para câmera forças ciclos de mudanças de temperatura enquanto fotos são tiradas. Outros métodos têm sido desenvolvidos para detectar a migração medindo o fluxo de corrente. As alterações atuais, como células cobrem mais espaço na placa, que é lido como um aumento da impedância de20. Medindo a impedância, o ambiente das células não é afectado, e o método, portanto, é considerado não-invasiva. Este método baseia-se em placas especializadas com eletrodos de ouro, que são caros, mas eles permitem a detecção de muitos processos, tais como adesão celular, proliferação, migração e morte celular. Uma grande desvantagem deste método é que a medição de impedância não indica diretamente a migração, como fatores tais como temperatura têm um grande impacto sobre a impedância. Alterações na impedância podem ser causadas por vários fatores que não são revisados pelo software, dificultando a análise dos dados. Portanto, a falta de visualização exige um microscópio de luz convencional para verificar a migração.
Para superar muitas das desvantagens das técnicas disponíveis, nós usamos uma câmera óptica automatizada em tempo real. A câmara óptica é um sistema de detecção com um microscópio de alta produtividade em uma pequena plataforma com uma lente, unidade de iluminação e uma câmera digital. Tem um built-in software, que pode testar a migração e proliferação entre outras coisas. Para detectar a migração, dois algoritmos são usados para analisar o crescimento e a cinética de migração das células, que são chamados a proliferação e a ferida que cura a análise, respectivamente. A análise de proliferação é baseado em um algoritmo de segmentação de imagens de duas etapas que se aplica a análise de textura para detectar a diferença entre as áreas cobertas de célula (mostrado em amarelo) e vazio fundo áreas por análise de histograma avançado. A análise de cicatrização de feridas é baseada em um algoritmo de três etapas que detecta a monocamada de células, localiza a abertura da ferida e determina a largura do fosso. Estas etapas são realizadas nos pontos de tempo determinados pelo usuário, e os dados são apresentados como coberta, largura do fosso e área de abertura. Uma das grandes vantagens desta máquina é que ele permite que imagens de células aderentes através de líquido por causa do ângulo da câmera21. As lenstakes inclinado que imagens são projetadas para uma pilha de um único plano z z geram para garantir que as fotos estão em foco (Figura 2). z-pilhas são geradas pela fusão da série de fotos (por exemplo, 40) perpendiculares à borda da ferida e através da ferida toda. Os z-pilhas permite capturar da profundidade da camada de células, bem como de um avião em foco através da ferida. Além disso, a série de imagens pode ser colocada juntos para uma coleção de vídeo das imagens, com o clique de um botão.
Vamos demonstrar um protocolo otimizado para a deteção de migração em linhagem celular de queratinócitos HaCaT. Nós testamos a lactoferrina e seu peptídeo N-terminal, Lactoferricin, com os humanos e as vacas, para analisar o seu efeito sobre a migração como estas moléculas têm demonstradas ter numerosas aplicações como antimicrobiano e imunológico, modulando as moléculas22 , 23. os quatro compostos foram comparados às células não tratadas de HaCaT e fator de crescimento epidérmico (EGF) foi usado como controle positivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Migração celular é um processo importante que influencia muitos aspectos da saúde, tais como a cicatrização de feridas e câncer, e é, portanto, crucial para o desenvolvimento de métodos para estudar a migração. O ensaio de risco tem sido o método mais comum em vitro testar compostos com propriedades anti e pro migration por causa de seu baixo custo e simples procedimento. No entanto, um problema frequentemente relatados do ensaio é o acúmulo de células através da borda da risque. Além disso, para obter dados de ensaio, imagens de diferentes exposições devem ser tomadas durante um período de tempo no mesmo lugar para comparar os movimentos de migração. Análise de diferentes programas pode ser usado para descrever o fechamento zero, mas eles são mão de obra intensiva, impreciso e forças ciclos de mudanças de temperatura. Neste estudo, vamos demonstrar um método otimizado para testar o efeito de migração, por exemplo, com as proteínas naturais, humanos e bovinos-lactoferrina e seu peptídeo N-terminal Lactoferricin na linha de células epiteliais HaCaT. Uma otimização de crucial é lavar e arranhar em PBS, que elimina o referido acúmulo de células ao longo da borda. Isso pode ser explicado pela remoção de cátions, que foram mostrados para ter um efeito sobre a conexão do celular de queratinócitos. Para garantir a verdadeira detecção de migração, pré-tratamento com mitomicina C, um inibidor da síntese de DNA, foi adicionada ao protocolo. Finalmente, vamos demonstrar a automatizado óptica câmera, que elimina os ciclos de temperatura excessiva, trabalho manual com análise de risco de encerramento, enquanto melhora na reprodutibilidade e garantir a análise de seções idênticas da risque ao longo do tempo.

HaCaT é uma linha de celular de queratinócitos, um dos tipos de célula mais abundantes na pele. Quando um ferimento ocorre, as células de pele começam a proliferar e migrar para o leito da ferida para fechar a ferida (Figura 3). Ambos os processos são, portanto, de extrema importância para a cura adequada.
A câmara óptica pode acompanhar os dois processos em tempo real. Para a migração, o...

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Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.

Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.8K visualizações.  Roskilde University. Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.

Vídeo: Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automático de análise de pulsação óptica de pequenos corações

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Biologia

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

Um In vitro FluoroBlok Assay invasão tumoral

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Indução de hipóxia e Testes em Cultura de Células

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudo da angiogênese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

Filamentos intermediários e microtúbulos com microscopia 2-dimensional direta estocástico reconstrução óptico de imagem

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae has made it a pre-eminent genetic model organism. However, since efficient protein isolation depends upon optimal disruption of cells, the use of yeast for biochemical analysis of cellular proteins is hampered by its cell wall which is expensive to digest enzymatically (using lyticase or zymolyase), and difficult to disrupt mechanically (using a traditional bead beater, a French press or a coffee grinder) without causing heating of samples, which in turn causes protein denaturation and degradation. Although manual grinding of yeast cells under liquid nitrogen (LN2) using a mortar and pestle avoids overheating of samples, it is labor intensive and subject to variability in cell lysis between operators. For many years, we have been successfully preparing high quality yeast extracts using cryogrinding of cells in an automated freezer mill. The temperature of -196 &#176;C achieved with the use of LN2 protects the biological material from degradation by proteases and nucleases, allowing the retrieval of intact proteins, nucleic acids and other macromolecules. Here we describe this technique in detail for budding yeast cells which involves first freezing a suspension of cells in a lysis buffer through its dropwise addition into LN2 to generate frozen droplets of cells known as "popcorn". This popcorn is then pulverized under LN2 in a freezer mill to generate a frozen "powdered" extract which is thawed slowly and clarified by centrifugation to remove insoluble debris. The resulting extracts are ready for downstream applications, such as protein or nucleic acid purification, proteomic analyses, or co-immunoprecipitation studies. This technique is widely applicable for cell extract preparation from a variety of microorganisms, plant and animal tissues, marine specimens including corals, as well as isolating DNA/RNA from forensic and permafrost fossil specimens.

We describe a reliable method for the preparation of whole cell extracts from yeast or other cells using a cryogenic freezer mill that minimizes degradation and denaturation of proteins. The cell extracts are suitable for purification of functional protein complexes, proteomic analyses, co-immunoprecipitation studies and detection of labile protein modifications.

Preparação de extratos celulares por criogrinding em um moinho de congelador automatizado

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

Um ensaio de migração de arranhões econômico e adaptável

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.