המועצה הדנית למען מחקר עצמאי, טכנולוגיה, ייצור, להעניק #4005-00029

הגדרת הניסוי נערך מסכים עם אוניברסיטת רוסקילדה, ויש אין מגבלה אתית ומשפטית. סקירה כללית של הסידור ניסיוני ניתן לראות באיור 1 ואת המנגנונים של המצלמה אופטי באיור2.
1. הכנה
<ol><li>לבצע את כל הצעדים זרימה שכבתית-ספסל סטרילי על-ידי ניקוי הספסל, חסכון כל עם 70% אתנול לפני התחלת הניסוי.</li>
	<li>מקם את המצלמה אופטי חממה קונבנציונאלי ב 37 ° C עם 5% CO2 ליצירת תנאים אופטימליים עבור התאים.</li>
	<li>לגדל תאים HaCaT בתקשורת DMEM עם 10% FBS ואנטיביוטיקה 1 x (פניצילין, סטרפטומיצין) בבקבוקון T75.</li>
	<li>השתמש טריפסין 1 x 1 מ"ל כדי לנתק את התאים ואת תת מטפח אותן כל 3-4 ימים, על ידי פיזור זה מעל השכבה הסלולר. מחממים מראש לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
</ol>2. יצירת של טפט של HaCaT תאים בצלחת Microtiter 48-ולס
<ol><li>הסר את המדיום של הבקבוק T75 עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>רחץ התאים חסיד הבקבוק על-ידי הוספת מ ל 1 x PBS עקר הבקבוקון T75. הערה: ודא PBS חינם של סידן ומגנזיום.</li>
	<li>הפיצו את PBS ולהסיר אותו עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>חזור על שלב 2.2-2.3.</li>
	<li>להוסיף הבקבוקון טריפסין 1 x 1 מ"ל ומעוררים אותה לאורך השכבה התא.</li>
	<li>דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס חממה קונבנציונאלי עד התאים הם צמודי קרקע (5-8 דקות מספיקה עבור מרבית שורות תאים).</li>
	<li>להציג במיקרוסקופ אם התאים הם צמודי קרקע. ברגע התאים מנותקים, להוסיף 9 מ של התקשורת תרבות קבוע עם 10% FBS כדי להשבית את טריפסין 1 x.</li>
	<li>לספור את התא עם, או hemocytometer קולטר-מונה או דומה. הערה: Trypan blue יכול לשמש כדי להציג תאים מתים. עם זאת, טריפסין 1 x HaCaT תאים הם לגמרי בסיבוב כאשר בחיים.</li>
	<li>העברה 7.5 x 104 תאים/טוב בתקשורת FBS 10% µL 250 צלחת תרביות רקמה של 48-ובכן להטלטל עגול (צלחת רגילה). הערה: Assay גם ניתן להגדיר ב- 6-, 12-, 24- או צלחות 96-ובכן, אשר כולם יכולים להיות לבדיקה במיקרוסקופ אופטי.</li>
	<li>להניע בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להבטיח שהתאים מתפשטים באופן שווה בתוך הבארות, או התאים אנקה במרכז הבארות. לבדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהתא מופצת באופן שווה בתקשורת</li>
	<li>לשים את הצלחת חממה2 CO קונבנציונאלי ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד התאים יש דבקה בתחתית הבארות.</li>
</ol>3. תוספת של גירויים לאפקטים ההעברה
<ol><li>בדוק אם הבארות הן 90-95% confluent תחת מיקרוסקופ אור.</li>
	<li>הכינו 10 µg/mL של מיטומיצין C בהכמות המתאימה של המדיום. הערה: במחקר זה, מיטומיצין C נשמרת ב 4 ° C בפתרון מניות ב 1 מ"ג/מ"ל. מיטומיצין C בתמיסה ניתן לאחסן שבוע בחושך ב 2-8 ° c</li>
	<li>הסר את המדיה בילה עם פיפטה פסטר מכל קידוח.</li>
	<li>להוסיף 250 µL של µg/mL 5 של מיטומיצין C בכל טוב.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל 2 h-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>הכן גירויים של פפטידים על ידי דילול אותם בסכום המתאים של המדיום. הערה: במחקר זה, נבדקו שור ואנושי לקטופרין והן Lactoferricin-µg/mL 25 בנפח של 250 µL</li>
	<li>הסר את המדיום עם מיטומיצין C עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>לשטוף את הבארות x 1 עם µL 250 1 x PBS (טמפרטורת החדר) ולהסיר לשטוף עם פסטר פיפטה.</li>
	<li>להוסיף µL 250 ל- 1 x PBS ותגרד באופן ידני את הבארות אנכית עם טיפ פיפטה µL 200. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב.</li>
	<li>להסיר את PBS ולהוסיף 250 µL פפטיד גירויים.</li>
	<li>לטעון את הצלחת במערכת אופטי מצלמה על-ידי התאמת את הברגים משני צידי הלוח. להשאיר את המכסה הצלחת microtiter. הערה: המצלמה יכולה לפעול עם מכסה פתוח במידת הצורך.</li>
</ol>4. להגדיר את התוכנית עבור המצלמה אופטי במחשב
<ol><li>לחץ על לחצן ייבוא בשורת המשימות בצד השמאל.</li>
	<li>בחר בפונקציה ריפוי פצעים בשורת המשימות בצד השמאל.</li>
	<li>בחר את סוג הלוח על ידי לחיצה מתחת לצלחת איור.</li>
	<li>ביטול בחירה של וולס, לא נעשה בו שימוש, על-ידי סימונן ולחץ לאפשר בצד השמאלי העליון על המסך. הערה: וולס כל נבחרות כברירת מחדל.</li>
	<li>התאם את המוקד של העדשה על הבארות כדי להתאים את המיקום של התאים על-ידי לחיצה ימנית על אחת הבארות. הערה: פוקוס אוטומטי יכול גם להיות מותאם באופן ידני על-ידי הזזת הסרגל בצד ימין של האיור צלחת.</li>
	<li>הגדר את תקופת הזמן לתמונות תחת התמונות מרווח (למשל (00: 30:00)).</li>
	<li>להגדיר את מספר החזרות שיתאימו תקופת הרצוי (למשל 97 חזרות).</li>
	<li>התחל ההפעלה על ידי לחיצה על לחצן ' התחל ' בפינה הימנית התחתונה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

החשיבות של ההגירה במחקרים של פיתוח, ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וסרטן הוביל מספר שיטות שונות ללמוד ההעברה. ההעברה יכול להיות ביטוי של ההתרחבות או סגירת הפער על ידי התאים. לרוב הסגר על השריטה נבדק, כפי שהוא קל יותר לגדל תאים חד שכבתי ולאחר מכן לבצע שריטה יותר גוברת התאים לטופס מסוים8</...

ההעברה היא תהליך חשוב המשפיע מספר היבטים פיזיולוגיים. בריפוי הפצע, העברת מקל epithelization מחדש של העור. הפצעים ללא ריפוי, כגון לפצעים כרוניים, חיידקים הזדמנותית לגרום לזיהום הפצע, פצעים פתוחים הם אידיאליים עבור גידול חיידקים ועל היווצרות biofilm1,2. Biofilm הוא אחד הגורמים להתפתחות חיידקים עמידים, אשר הוא אחד האיומים הגדולים ביותר שלנו בחברה המודרנית3. בריפוי הפצע, תאים חיסוניים לא יכול לחדור את biofilm. ב סרטן, העברה של תאים סרטניים הוא צעד מכריע של גרורות, שהוא הגורם העיקרי למוות אצל חולים עם גידולים מוצקים4,5. לכן, זה הכרחי להיות מסוגל ללמוד ההעברה.
גירוד וזמינותו משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את נדידת תאים כי זה זול וקל לביצוע על שורות תאים חסיד, כגון פיברובלסט, אנדותל, ותא אפיתל קווים6,7. כיום, קיימות מספר שיטות לביצוע שריטות8, חומרים שונים דווח לשמש, לרבות קיסמים9, מגרדים תא10, לייזרים11זרמים חשמליים12. כל אחת מהשיטות יש והחסרונות השונים, השיטה צריכה להיות החליט על פי הכלי סוג תקציב, ניתוח התא. לדוגמה, אם סוג התא בשימוש דורש ציפוי, הסרת לחץ ידני, למשל עם טיפ קיסם או פיפטה, ישפיע הדבר על הגירה בתוך האזור, יש להשתמש בשיטה שונה. במחקר זה, אנו נתמקד גירוד ידנית.
חסרון עבור גירוד ידני הוא וריאציה של גודל, צורות של השריטות, הצטברות של תאים בקצוות של השריטה. קיימים פרוטוקולים רבים, ומייעץ מאמר מצוטט מאוד מהירות מוגברת ו/או שטיפה לאחר גירוד13. בנוסף, מספר שיטות השתמשו כדי לצמצם את התפשטות, כיוון התפשטות התאים ניתן להבחין בין הגירה ולכן עלולה להחזיר תוצאות חיוביות שגויות של הגירה. כמה דיווח שיטות הרעבה סרום שקדמו מאפס14 ולאחר הפחתת כמות הנסיוב15. עם זאת, אף אחת מהשיטות האלה תוכל להבטיח שיש אין התפשטות. לכן, אנחנו מדווחים על טיפול טרום התאים עם מיטומיצין C כדי להבטיח תוצאות אמת של הגירה. מיטומיצין C הוא אנטיביוטיקה כי מעכב סינתזת ה-DNA על ידי יצירת של קשר קוולנטי עם ה-DNA, ומונע את הדנ א של הפרדת16. על ידי טיפול מראש עם מיטומיצין C ושטיפת תסיים לפני גירוד, הסגר שזוהו על הפער מדגים את ההעברה נכון של התאים (איור 1).
מאפיין של כל השיטות הוא הצורך עבור מערכת לנתח את תהליך ההעברה17. נפוצה שיטה זולה כדי לנתח את ההתקדמות הוא להשתמש במיקרוסקופ אור-השדה לקחת תמונות של השריטה בנקודות זמן שנקבע מראש, ואחריו ניתוח של סגירת הפער התמונה תוכנה18,19. שיטה זו גוזלת זמן, אמין לגבי לצלם באותו מקום, מיקוד, התנועה מן החממה המצלמה כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה בזמן מצולמות התמונות. פותחו שיטות אחרות כדי לזהות ההעברה על ידי מדידת הזרם הנוכחי. השינויים הנוכחיים, כתאי לכסות יותר שטח על הצלחת, אשר קרא כמו עלייה עכבה20. על ידי מדידת התנגדות, הסביבה של התאים אינו מושפע, השיטה ולכן היא נחשבת לא פולשנית. שיטה זו מסתמכת על צלחות מיוחדות עם אלקטרודות זהב, אשר יקר, אבל הם מאפשרים זיהוי של תהליכים רבים, כגון הדבקות הסלולר, הפצה, העברה מוות של תאים. חיסרון גדול של שיטה זו הוא כי המדידה עכבה לא ישירות מצביעות על ההעברה, כמו גורמים כמו טמפרטורה יש השפעה רבה על עכבה. שינויים עכבה יכולה להיגרם על ידי מספר גורמים אשר לא נבדקות על ידי התוכנה, יותר מקשה על הניתוח של הנתונים. לפיכך, היעדר ויזואליזציה דורש מיקרוסקופ אור קונבנציונלי כדי לוודא העברה.
כדי להתגבר על רוב המגרעות של טכניקות זמינים, אנו משתמשים במצלמה אופטית אוטומטית בזמן אמת. המצלמה אופטי היא מערכת זיהוי עם מיקרוסקופ תפוקה גבוהה ב פלטפורמה קטן עם עדשה, יחידת תאורה של מצלמה דיגיטלית. יש תוכנה מובנית, אשר ניתן לבחון ההגירה והתפשטות בין היתר. כדי לזהות את ההעברה, שני אלגוריתמים משמשים כדי לנתח את הצמיחה וקינטיקה ההעברה של תאים, אשר נקראים ההתפשטות ו הפצע ריפוי ניתוח, בהתאמה. ניתוח התפשטות הוא מבוסס על אלגוריתם פילוח תמונה בשני שלבים שחל במרקם ניתוח כדי לזהות את ההבדל בין שטחים מכוסי תא (מוצג בצהוב) וריק רקע אזורים על-ידי ניתוח ההיסטוגרמה מתקדם. הפצע ריפוי ניתוח מבוססת על אלגוריתם שלושה שלבים מזהה את טפט תא, מאתרת את הפער הפצע, והוא קובע את רוחב המרווח. השלבים נערכים אצל המוגדרות על-ידי המשתמש בזמן נקודות, הנתונים מוצג באזור מקורה, רוחב המרווח ואזור הפער. אחד היתרונות הגדולים של מחשב זה הוא כי הוא מאפשר הדמיה של תאים חסיד דרך נוזלי בגלל זווית המצלמה21. תמונות lenstakes בעת הטיית המצלמה מוקרנים אל ערימה-z של z-מטוס בודד ליצור כדי להבטיח כי התמונות בפוקוס (איור 2). z-במחסן נוצרות על-ידי מיזוג הסדרה של תמונות (למשל 40) שצולמו בניצב לקצה הפצע, ועל -פני כל הפצע. Z-הערימות מאפשר לכידה של העומק של השכבה תא, כמו גם מטוס בפוקוס על פני הפצע. יתר על כן, הסדרה של תמונות שאפשר להרכיב על אוסף וידאו של התמונות, בלחיצה על כפתור.
נדגים פרוטוקול ממוטבת גילוי של ההעברה בקו תא תקין HaCaT. בדקנו לקטופרין, שלה N-מסוף פפטיד, Lactoferricin, בני האדם, פרות, כדי לנתח את השפעתם על הגירה כמו מולקולות אלה הוכחו יש יישומים רבים מיקרוביאלית ו החיסונית להתכוונן מולקולות22 , 23. תרכובות ארבע, לעומת תאים HaCaT אינו מטופל, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) שימש פקד חיובי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

נדידת תאים הוא תהליך חשוב זה משפיע על היבטים רבים של בריאות, כגון ריפוי הפצע סרטן, וזה, לפיכך, חיוני לפיתוח שיטות ללמוד את ההעברה. וזמינותו מאפס כבר זמן רב השיטה הנפוצה ביותר במבחנה לבדיקת תרכובות בעלות מאפיינים migration נגד פרו בגלל הליך שלו זולה ופשוטה. אולם, לבעיית וזמינותו מדווחים לעתים קרובות היא ההצטברות של תאי מעבר לקצה של השריטה. יתר על כן, כדי להשיג מידע וזמינותו, תמונות של חשיפות שונות חייב להילקח על פני תקופה של זמן, באותו מקום בדיוק כדי להשוות את התנועות של ההעברה. ניתן להשתמש בתוכניות ניתוח שונים כדי לתאר את הסגר מאפס, אך הם עבודה אינטנסיבית, אינו מדויק, ואת כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה. במחקר זה, נדגים שיטה ממוטב עבור בדיקת ההשפעה ההעברה, למשל עם החלבונים המתרחשים באופן טבעי האדם - ו שור-לקטופרין, שלהם פפטיד N-מסוף Lactoferricin על הקו תאים אפיתל HaCaT. אופטימיזציה מכריע היא לשטוף את לגרד ב- PBS, מה שמבטל את הצטברות תאים לאורך הקצה הנ. זו יכולה להיות מוסברת על ידי ההסרה של קטיונים, אשר הוכחו יש השפעה על חיבור תאים תאים תקין. כדי להבטיח זיהוי נכון של הגירה, בטיפול מראש עם מיטומיצין C, מעכב סינתזת ה-DNA, נוספה לפרוטוקול. לבסוף, נדגים אוטומטיות אופטי למצלמה, מה שמבטל מחזורי בטמפרטורה הקיצונית, כפיים עם ניתוח סגירת מאפס, תוך שהיא משפרת על הפארמצבטית להבטיח ניתוח קטעים זהים של השריטה לאורך זמן.

HaCaT הוא קו תא תקין, אחד הסוגים התא הנפוץ ביותר של העור. כאשר פצע, תאי העור מתחיל להתרבות ולהעביר מעל למיטה הפצע כדי לסגור את הפצע (איור 3). שני התהליכים הם, לכן, חשיבות עליונה עבור ריפוי תקין.
המצלמה אופטי יכול לעקוב אחר שני תהל...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.8K Views.  Roskilde University. כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

Video: Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

במבחנה Invasion FluoroBlok גידול Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae has made it a pre-eminent genetic model organism. However, since efficient protein isolation depends upon optimal disruption of cells, the use of yeast for biochemical analysis of cellular proteins is hampered by its cell wall which is expensive to digest enzymatically (using lyticase or zymolyase), and difficult to disrupt mechanically (using a traditional bead beater, a French press or a coffee grinder) without causing heating of samples, which in turn causes protein denaturation and degradation. Although manual grinding of yeast cells under liquid nitrogen (LN2) using a mortar and pestle avoids overheating of samples, it is labor intensive and subject to variability in cell lysis between operators. For many years, we have been successfully preparing high quality yeast extracts using cryogrinding of cells in an automated freezer mill. The temperature of -196 &#176;C achieved with the use of LN2 protects the biological material from degradation by proteases and nucleases, allowing the retrieval of intact proteins, nucleic acids and other macromolecules. Here we describe this technique in detail for budding yeast cells which involves first freezing a suspension of cells in a lysis buffer through its dropwise addition into LN2 to generate frozen droplets of cells known as "popcorn". This popcorn is then pulverized under LN2 in a freezer mill to generate a frozen "powdered" extract which is thawed slowly and clarified by centrifugation to remove insoluble debris. The resulting extracts are ready for downstream applications, such as protein or nucleic acid purification, proteomic analyses, or co-immunoprecipitation studies. This technique is widely applicable for cell extract preparation from a variety of microorganisms, plant and animal tissues, marine specimens including corals, as well as isolating DNA/RNA from forensic and permafrost fossil specimens.

We describe a reliable method for the preparation of whole cell extracts from yeast or other cells using a cryogenic freezer mill that minimizes degradation and denaturation of proteins. The cell extracts are suitable for purification of functional protein complexes, proteomic analyses, co-immunoprecipitation studies and detection of labile protein modifications.

הכנת תמציות תאים על ידי Cryogrinding במיל מקפיא אוטומטי

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

תס"א של העברת שריטות חסכונית ותואמה

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.