Bağımsız araştırma, teknoloji ve üretim, Danimarkalı kurulu #4005-00029 vermek

Deneysel Kur etik ve yasal sınırlama yoktur vardır ve Roskilde Üniversitesi ile anlaşma yapılmıştır. Deneysel set-up bir bakış resim 1 ve Şekil 2optik kamera mekanizmaları görülebilir.
1. hazırlık
<ol><li>Tüm adımları bir steril laminar akış-tezgah tezgah ve tüm ekipmanları ile % 70 etanol başından önce deneme temizleyerek gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreler için en uygun koşulları sağlamak için % 5 CO2 37 ° C'de geleneksel bir kuluçka optik kamera yerleştirin.</li>
	<li>%10 FBS ve 1 x antibiyotik (penisilin ve streptomisin) bir T75 şişesi ile DMEM medyada HaCaT hücrelerin büyümesine.</li>
	<li>1 mL 1 x tripsin hücreleri bağlantısını kesin ve onları her 3-4 gün yetiştirmek hücresel katmanı üzerinden Dispergatör tarafından alt için kullanın. Oda sıcaklığına kullanmadan önce ön ısı.</li>
</ol>2. HaCaT Monolayer üreten hücreleri bir 48-kuyu Microtiter plaka
<ol><li>Orta T75 şişeye Pasteur pipet ile kaldırın.</li>
	<li>Şişeye yapışık hücreleri T75 şişesi 5 mL 1 x steril PBS ekleyerek yıkayın. Not: PBS kalsiyum ve magnezyum serbest olduğundan emin olun.</li>
	<li>PBS geçirilip yorumlanması için dolaştırmak ve Pasteur pipet ile çıkarın.</li>
	<li>2.2 2.3 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Şişesi için 1 mL 1 x tripsin ekleyin ve hücre katmanı dağıttı.</li>
	<li>Hücreleri müstakil kadar geleneksel bir kuluçka 37 ° C'de şişeye kuluçkaya (5-8 dk çoğu hücre hatlarında yeterli).</li>
	<li>Hücreleri müstakil ise mikroskop altında görüntüleyin. Hücreleri müstakil kez 9 mL % 10 ile düzenli kültür ortamının eklemek FBS 1 x tripsin devre dışı bırakabilirsiniz.</li>
	<li>Her iki hemasitometre, hücresiyle saymak coulter-sayaç veya benzer bir. Not: Trypan mavi ölü hücreleri görüntülemek için kullanılabilir. Ancak, 1 x tripsin HaCaT hücreleri vardır mükemmel yuvarlak zaman canlı.</li>
	<li>7.5 x 104 hücreleri/iyi 250 µL % 10 FBS medya 48-iyi doku kültürü yuvarlak popolu plaka (Standart plaka) aktarın. Not: tahlil de ayarlanabilir 6-, 12-, 24-veya hangi optik mikroskop altında denetlesinler 96-şey plakaları.</li>
	<li>Yavaşça plaka yan tarafında hücreleri aynı derecede içinde wells yayılır emin olmak için hareket veya hücreleri kuyuları Merkezi'nde bir araya gelecek. Hücre medyada eşit yayılmış emin olmak için hafif bir mikroskop altında incelemek</li>
	<li>Gecede veya hücreleri kuyu dibine yapıştırılır kadar geleneksel bir CO2 kuluçka 37 ° C'de plaka koymak.</li>
</ol>3. geçiş efektleri için bir çekim gücü eklenmesi
<ol><li>Kuyuları % 90-95 birleşmesi hafif bir mikroskop altında olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>10 µg/mL mitomycin C orta uygun bir miktarda hazırlamak. Not: Bu çalışmada, Mitomycin C 1 mg/mL, hisse senedi bir çözümde 4 ° C'de tutulur. 2-8 ° C'de karanlıkta bir hafta için Mitomycin C çözüm içinde depolanması</li>
	<li>Pasteur pipet ile harcanan medya her kuyudan çıkarın.</li>
	<li>5 µg/mL mitomycin C de 250 µL her şey için ekleyin.</li>
	<li>2 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Peptidler uyaranlara onları Orta uygun bir miktarda sulandrarak hazırlayın. Not: Bu çalışmada, insan ve sığır laktoferrin hem Lactoferricin 25 µg/mL 250 µL hacmine, test edildi</li>
	<li>Mitomycin C ile Pasteur pipet ile orta kaldırın.</li>
	<li>1 x 1 x PBS (Oda sıcaklığında) ve Kaldır yıkama bir Pasteur ile 250 µL ile pipet wells yıkayın.</li>
	<li>1 x PBS 250 µL ekleme ve el ile wells 200 µL pipet ucu ile dikey çizik. Yeni bir pipet ucu her şey için kullanın.</li>
	<li>PBS kaldırın ve 250 µL peptid uyaranlara ekleyin.</li>
	<li>Plaka plaka her iki tarafındaki vidaları ayarlayarak optik kamera sistemi monte. Kapak microtiter plaka üzerinde bırakın. Not: Kameranın açık gerekirse kapak ile çalışabilir.</li>
</ol>4. Program bilgisayarın optik kamera için ayarlama
<ol><li>Al soldaki görev çubuğundaki düğmesini tıklatın.</li>
	<li>Görev çubuğundaki soldaki iyileşmesi işlevi seçin.</li>
	<li>Plaka tipi plaka illüstrasyonaşağı tıklatarak seçin.</li>
	<li>Wells, kullanılmadığı, onları işaretleyerek seçimini kaldırın ve ekranın üst sol tarafında, Etkinleştir ' i tıklatın. Not: Bütün wells varsayılan olarak seçilir.</li>
	<li>Hücrelerin konumunu bir kuyu üzerinde sağ tıklatarak sığdırmak için kuyu objektif odak noktası ayarlayın. Not: Otofokus da plaka illüstrasyon sağında çubuğunu taşıyarak el ile ayarlanabilir.</li>
	<li>Zaman dönemi Resim aralığı altında görüntü için ayarla (Örneğin (00: 30:00)).</li>
	<li>Tekrarı istenen dönem (Örneğin 97 tekrarlar) sığacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Run Başlat düğmesini sağ alt köşesine tıklatarak başlatın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Geliştirme, yara iyileşmesi, immünoloji ve kanser araştırmaları göç önemi için birkaç farklı yöntem geçiş çalışma yol açmıştır. Geçiş ya da bir ifade genişleme veya boşluk hücreleri tarafından kapatılması olabilir. Bir monolayer hücreleri büyümek ve daha belirli form8hücrelerde büyüyen bir çizik bile yapmak daha kolay olduğu gibi en sık kapatılması çizik, mercek altına alındı. Tekniği Master kolay ve düşük maliyetli olduğu gibi bizim çalışma man...

Geçiş birçok fizyolojik açıdan etkileyen önemli bir süreçtir. Yara iyileşmesinde, geçiş cildin yeniden epithelization kolaylaştırır. Kronik yaralar gibi Sigara şifa yaralar fırsatçı bakteriler yara enfeksiyonu neden ve açık yaralar bakteri büyüme ve biyofilm1,2oluşumu için idealdir. Biyofilm dirençli bakterilerin gelişimi nedenleri biri bizim modern toplumun3için en büyük tehdit olan biridir. Yara iyileşmesinde, bağışıklık hücreleri biyofilm aşamıyor. Kanser, kanser hücrelerinin geçiş metastaz, çok önemli bir adım olan ölüm solid tümör4,5olan hastalar için birincil nedeni olmasıdır. Bu nedenle, geçiş çalışma çok önemlidir.
Kazı-kazan tahlil kez çünkü ucuz ve kolay, fibroblast, endotel ve epitel hücre hatları6,7gibi yapışık hücre satırları üzerinde gerçekleştirmek için hücre göç sınamak için kullanılır. Bugün, çizikler8gerçekleştirmek için birkaç yöntem var ve farklı malzemeler kullanılmak üzere, kürdan9, hücre Kazıma aletleri10, lazerler11ve elektrik akımları12de dahil olmak üzere bildirilmiştir. Tüm yöntemleri farklı artıları ve eksileri var ve yöntem üzerine hücre türü, bütçe ve analiz aracına göre karar vermesi gerektiğini. Örnek olarak, kullanılan hücre tipi, el ile basınç kaldırma, kaplama gerektiriyorsa, Örneğin bir kürdan veya pipet ucu ile geçiş alanı içinde etkisi, farklı bir yöntem kullanılmalıdır. Bu çalışmada, el ile kazıma üzerinde durulacak.
El ile kazıma için bir zararı olmaz bu çizikler şekilleri ve çizik kenarlarında hücre birikimi, boyutu varyasyonu. Birçok protokoller bulunmaktadır ve hızlı artış ve/veya13çizilmemesi sonra ayrıntılı çamaşır yüksek atıf kağıt tavsiye eder. Buna ek olarak, hücrelerin çoğalması göç--dan ayırt edici olamaz ve bu nedenle yanlış pozitif sonuçlar göç verebilir beri yayılması, en aza indirmek için birkaç yöntem kullanılmıştır. Bazı yöntemler sıfırdan14 önceki ve serum15miktarı azalan serum açlık bildirilir. Ancak, bu yöntemlerin ikisi de hiçbir nükleer silahların yayılmasına karşı olduğundan emin olabilirsiniz. Bu nedenle, biz ön arıtma göç doğru sonuçlar sağlamak için mitomycin C içeren hücrelerin raporu. Mitomycin C DNA16ayıran engeller DNA ile kovalent bağ oluşturarak DNA sentezini engeller bir antibiyotiktir. Mitomycin C ile önceden tedavi ve çizilmemesi önce PBS ile yıkama, Gap algılanan kapatılması (Şekil 1) hücrelerinin doğru geçiş gösteriyor.
Tüm yöntemleri geçiş17süreci analiz etmek bir sistemi için ihtiyaç özelliğidir. Ortak bir ilerleme çözümlemek için ucuz bir yöntem ise bir görüntü yazılımı18,19boşluğu kapatılması bir analizini ve ardından önceden belirlenmiş zaman noktalarda çizik görüntülerini çekmek için ışık alan mikroskop kullanmak için. Bu yöntem zaman alan, aynı yerde ve odak fotoğraf çekmek açısından güvenilmez ve resimlerin çekildiği ise sıcaklık değişiklikleri döngüleri kuluçka hareketinden kamera için zorlar. Diğer yöntemler mevcut akışını ölçerek geçiş algılamak için geliştirilmiştir. Geçerli değişiklikleri hücreler olarak empedans20artış olarak okumak plaka üzerinde daha fazla yer kapsamaktadır. Empedans ölçüm, çevrenin hücrelerin etkilenmez ve yöntemi bu nedenle non-invaziv olarak kabul edilir. Bu yöntem pahalı, altın elektrotlar ile özel plakaları kullanır ama onlar hücresel bağlılık, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve hücre ölümü gibi birçok işlemlerin algılanmasını sağlar. Sıcaklık gibi faktörler empedansı üzerinde büyük bir etkiye sahip olarak empedans ölçüm doğrudan geçiş, göstermez bu yöntemin bir engel olduğunu. Empedans değişimler veri analizi daha zor hale yazılım tarafından incelenir değil çeşitli faktörler neden olabilir. Bu nedenle, görselleştirme eksikliği geçiş doğrulamak için geleneksel bir ışık mikroskobu gerektirir.
Birçok kullanılabilir teknikleri downsides üstesinden gelmek için gerçek zamanlı otomatik optik kamera kullanın. Optik kamera küçük bir platformda bir lens, aydınlatma ünitesi ve bir dijital fotoğraf makinesi ile yüksek-den geçerek mikroskop ile algılama sistemidir. Göç ve diğer şeyler arasında nükleer silahların yayılmasına karşı test edebilirsiniz bir yerleşik yazılım vardır. Geçiş algılamak için iki algoritmaları büyüme ve hücrelerin çoğalması ve analizi, sırasıyla şifa yara adı verilen geçiş kinetik çözümlemek için kullanılır. Doku analizi (sarı renkle gösterilmiştir) cep kaplı alanlar arasındaki farkı bulmak için geçerlidir bir iki aşamalı görüntü segmentasyonu algoritma dayalı ve boş yayılması analizi arka plan alanları göre gelişmiş çubuk grafik analiz. Analiz şifa yara hücre monolayer algılar, yara boşluk bulur ve boşluk genişliğini belirler bir üç adım algoritmasına dayanan. Aşağıdaki adımları Kullanıcı tarafından belirlenen saat-noktalarda yapıldığı ve verileri kapalı alan, boşluk genişliği ve gap alanı sunulur. Bu makine büyük avantajlarından biri21kamera açısı yüzünden sıvı ile yapışık hücreleri görüntüleme sağlar olduğunu. Resimleri odak noktası (Şekil 2) olduğundan emin olmak için bir z-yığını için tek bir z uçağı öngörülen kamera hareket ettirildiğinde lenstakes görüntüler oluşturmak. z-yığınlar yara kenarına ve tüm yara arasında dikey çekilen fotoğraflar (Örneğin 40) dizi birleştirme tarafından oluşturulur. Z-yığınlar hücre katmanı hem de bir odakta uçak derinliği yara yakalama sağlar. Ayrıca, resimleri dizi görüntüleri, video koleksiyonuna bir düğmeyi tıklamak ile birlikte konabilir.
Biz algılanması HaCaT keratinosit hücre doğrultusunda geçiş için en iyi duruma getirilmiş bir protokol göstermek. Laktoferrin ve onun N-terminal peptid, Lactoferricin, insanlar ve inekler, bu moleküller çok sayıda uygulama antimikrobiyal ve bağışıklık molekülleri22 oransal için gösterildiği şekilde geçiş üzerindeki etkileri analiz etmek için test , 23. dört bileşikler tedavi edilmezse HaCaT hücrelere karşılaştırıldı ve epidermal büyüme faktörü (EGF) olumlu bir denetim olarak kullanıldı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">oCelloScope</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:221px;">Optical camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UniExplorer software&#160;</td>
			<td style="width:156px;">BioSense Solution ApS</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>(8.0.0.7144 (RL3))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HaCaT cell</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Donated from Bispebjerg Hospital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31966-021</td>
			<td>Medium for HaCaT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">D837</td>
			<td>Without Mg+ and Ca2+</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pencillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P0781</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin (10x)</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:156px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">3258</td>
			<td>Inhibits proliferation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:156px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">677 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator</td>
			<td style="width:156px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:156px;">Assistent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>T&#252;rk (0.1 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipet boy</td>
			<td style="width:156px;">Accu-Jet pro</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

Hücre göç sağlık, yara iyileşmesi ve kanser, gibi birçok yönünü etkileyen önemli bir süreçtir ve bu, bu nedenle, geçiş çalışma yöntemleri geliştirmek için çok önemlidir. Kazı-kazan tahlil uzun bileşikler ile anti ve pro migration özellikleri nedeniyle, düşük maliyetli ve basit yordamı sınamak için en yaygın vitro yöntemi olmuştur. Ancak, bir sık rapor tahlil hücreleri birikimi sıfırdan kenar boyunca bir sorundur. Ayrıca, tahlil verileri elde etmek için farklı pozlama görüntüleri bir süre içinde tam olarak aynı noktada göç hareketleri karşılaştırmak için alınması gerekir. Farklı analiz programları sıfırdan kapatılması tanımlamak için kullanılan, ancak emek yoğun, yanlış ve kuvvetleri döngüleri sıcaklık değişiklikleri. Bu çalışmada, geçiş etkisi, Örneğin doğal olarak meydana gelen proteinler insan ve sığır Laktoferrin ile ve epitel hücre satırındaki HaCaT onların N-terminal peptid Lactoferricin test etmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi göstermektedir. Çok önemli bir optimizasyon yıkayın ve söz konusu birikimi hücre kenarı boyunca ortadan kaldırır PBS sıfırdan etmektir. Bu özellikler, keratinosit hücre-hücre bağlantısı üzerinde etkisi olduğu gösterilmiştir kaldırma tarafından açıklanabilir. Geçiş doğru tespiti sağlamaktır, mitomycin C, DNA sentezi inhibitörü ile önceden tedavi protokolü için eklendi. Son olarak, aşırı sıcaklık döngüleri, ortadan kaldıran otomatik optik kamera, el emeği ile sıfırdan kapatma analizi, tekrarlanabilirlik üzerinde iyileştirilmesi ve zamanla çizik aynı bölümden analiz sağlanması sırasında göstermek.

HaCaT keratinosit hücre, deride en bol bulunan hücre türlerinden biri olan bir. Bir yara ortaya çıktığında, cilt hücrelerini çoğalırlar ve üzerinde yara (Şekil 3) kapatmak için yara yatağına geçirmek başlatın. Her iki süreç vardır, bu nedenle, uygun şifa için son derece önemlidir.
Optik kamera her iki süreç gerçek zamanlı olarak takip edebilirsiniz. Geçiş için sistem...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Kazı-kazan tahlil Vitro hücre göç bir otomatik optik kamera ile test etmek için en iyi duruma getirilmiş

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.8K Görüntüleme.  Roskilde University. Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.

Video: Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Küçük Kalpler Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analizi

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Biyoloji

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

Bir In vitro FluoroBlok Tümör Invasion Testi

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, polarity, and motility. The organization of the actin and microtubule networks has been extensively studied but that of IFs is not yet fully characterized. IFs have an average diameter of 10 nm and form a network extending throughout the cell cytoplasm. They are physically associated with actin and microtubules through molecular motors and cytoskeletal linkers. This tight association is at the heart of the regulatory mechanisms that ensure the coordinated regulation of the three cytoskeletal networks required for most cell functions. It is therefore crucial to visualize IFs alone and also together with each of the other cytoskeletal networks. However, IF networks are extremely dense in most cell types, especially in glial cells, which makes its resolution very difficult to achieve with standard fluorescence microscopy (lateral resolution of ~250 nm). Direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) is a technique allowing a gain in lateral resolution of one order of magnitude. Here, we show that lateral dSTORM resolution is sufficient to resolve the dense organization of the IF networks and, in particular, of IF bundles surrounding microtubules. Such tight association is likely to participate in the coordinated regulation of these two networks and may, explain how vimentin IFs template and stabilize microtubule organization as well as could influence microtubule dependent vesicular trafficking. More generally, we show how the observation of two cytoskeletal components with dual-color dSTORM technique brings new insight into their mutual interaction.

The overall goal of this methodology is to give the optimal experimental conditions from sample preparation to image acquisition and reconstruction in order to perform 2D dual color dSTORM images of microtubules and intermediate filaments in fixed cells

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae has made it a pre-eminent genetic model organism. However, since efficient protein isolation depends upon optimal disruption of cells, the use of yeast for biochemical analysis of cellular proteins is hampered by its cell wall which is expensive to digest enzymatically (using lyticase or zymolyase), and difficult to disrupt mechanically (using a traditional bead beater, a French press or a coffee grinder) without causing heating of samples, which in turn causes protein denaturation and degradation. Although manual grinding of yeast cells under liquid nitrogen (LN2) using a mortar and pestle avoids overheating of samples, it is labor intensive and subject to variability in cell lysis between operators. For many years, we have been successfully preparing high quality yeast extracts using cryogrinding of cells in an automated freezer mill. The temperature of -196 &#176;C achieved with the use of LN2 protects the biological material from degradation by proteases and nucleases, allowing the retrieval of intact proteins, nucleic acids and other macromolecules. Here we describe this technique in detail for budding yeast cells which involves first freezing a suspension of cells in a lysis buffer through its dropwise addition into LN2 to generate frozen droplets of cells known as "popcorn". This popcorn is then pulverized under LN2 in a freezer mill to generate a frozen "powdered" extract which is thawed slowly and clarified by centrifugation to remove insoluble debris. The resulting extracts are ready for downstream applications, such as protein or nucleic acid purification, proteomic analyses, or co-immunoprecipitation studies. This technique is widely applicable for cell extract preparation from a variety of microorganisms, plant and animal tissues, marine specimens including corals, as well as isolating DNA/RNA from forensic and permafrost fossil specimens.

We describe a reliable method for the preparation of whole cell extracts from yeast or other cells using a cryogenic freezer mill that minimizes degradation and denaturation of proteins. The cell extracts are suitable for purification of functional protein complexes, proteomic analyses, co-immunoprecipitation studies and detection of labile protein modifications.

Otomatik Dondurucu Değirmeninde Kriyogrinding ile Hücre Ekstrelerinin Hazırlanması

The ease of genetic manipulation and the strong evolutionary conservation of eukaryotic cellular machinery in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

Maliyet Etkin ve Uyarlanabilir Çizilme Göçü Tsası

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.