המחברים תודה ד"ר ג'ניפר יאנג קאופמן אלכסנדר (סשה) לקבלת סיוע טכני עם טכניקה זו, כמו גם דיונים קריטיים ומסייע רבים. סרום הורמון מבחני בוצעו על ידי היאנג. et al., 2017 אוניברסיטת וירג'יניה במרכז לחקר רבייה ליגנד Assay ניתוח הליבה, נתמך על ידי מענק יוניס קנדי שרייבר NICHD/NIH (NCTRI) P50-HD28934.
מקורות תמיכה מחקר: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM נתמכה על ידי T32 NICHD 007203.

השיטה המתוארת כאן הוא מסכים עם הנחיות שימוש ו נבחרת מוסדות של בעלי חיים בריאות, קיבלו אישור על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו.
1. הסתגלות לטיפול
<ol><li>הליך הטיפול<ol>
<li>מקום העכבר הכלובים אבטחה הקבינט. הסר את העכבר הראשון הכלוב ואת המקום על משטח מתאים (למשל מכסה כלוב נקי) בתוך ארון אבטחה.</li>
		<li>בעדינות לרסן את העכבר על משטח העבודה על-ידי החזקת בבסיס הזנב עם לאצבע, של יד אחת. לאחר מכן, בחוזקה קו השטח הגחון של הזנב, מהבסיס ועד קצה הזנב, עם לאצבע, האגודל של היד השנייה. חזור על פעולה זו הוספת קו 6 פעמים (כלומר 1 מוגדרת) ולהחזיר את העכבר לכלוב שלו.</li>
		<li>חכה 6 דקות וחזור על שלב 1.1.2. הערה: בסך הכל, שלב 1.1.2 תחזור על עצמה 4 פעמים לכל העכבר (כלומר 4 קבוצות של קווים 6), כך כל עכבר יקבל סך של משיכות הזנב 24 על כל יום של טיפול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התדירות של טיפול יומי<ol>
<li>מ-5 עד שבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, להתמודד עם עכברים כפי שמתואר בשלב 1.1, חמישה ימים בשבוע (עכברים לא מטופלים ביום שבת או ראשון עד השבועיים האחרונים של הסתגלות).</li>
		<li>אם טיפול ניסיוני במהלך תקופת הדגימה יכלול כל טיפול נוספים (למשל scruffing או הזרקת בקרום הבטן), ואקלום העכברים פעילות זו טיפול בכל מפגש טיפול. הערה: עבור הסתגלות לשגרות הזרקה, השתמש מחט קהות לבצע זריקה המזויפים.</li>
		<li>במהלך השבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, להתמודד עם עכברים כמתואר ב- 1.1, שבעה ימים בשבוע.</li>
		<li>לפחות שבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, בית עכברים בזוגות כדי למזער שיבושים לעכברים במהלך הדגימה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת צינורות איסוף דם
<ol><li>הכנת מאגר assay העדינה של LH בבקבוק זכוכית: אלבומין שור 0.2% ל- 0.05% Tween-20 ב- PBS [0.2 גרם אשלגן כלורי, 8 g NaCl, g 1.44 נה2HPO4 (נטול מים), 0.24 g ח'2PO4, מים הנדסה גנטית 1 ליטר, pH 7.4, מסנן אוטוקלב] , לאחסן ב 4 º C. 1 הערה: נפח של מאגר assay העדינה של LH להיות מוכן יכול להיות מחושב בהתבסס על מספר דוגמאות ואת אמצעי האחסון עבור דגימה כמצוין להלן (2.2 & דיונים)</li>
	<li>להכין צינורות איסוף דם (0.6 מ"ל microcentrifuge צינורות). תווית צינורות, מאגר aliquot assay (57 µL מאגר למחזור; הערה, אמצעי אחסון זה עשוי להשתנות בהתאם נפח הדם שנאספו או היחס של הדם אל המאגר הרצוי). צינורות יכול להיות מוכן ימים לפני דגימה, לאחסן ב 4 º C.</li>
</ol>3. איסוף דם
<ol><li>הכנת דם אוסף חומרים.<ol>
<li>להכין הקבינט אבטחה לשימוש ולארגן את החומרים הבאים בשכונה או על עגלה בקרבת מקום: פיפטה טיפים פיפטה (ערכת 3 µL או נפח איסוף הדם הרצויה), 10 µL, לבזבז סל טיפים בשימוש פיפטה, טיימר, התדפיס עם מספרים בעלי חיים, דוגמת מספרים ( עבור הערות בנוגע לסוגיות מדגם או בעלי חיים), קרח בדלי עם צינורות איסוף דם, מספריים, גזה קטנים (2 "x 2"). הערה: "לספור עד" פונקציה על טיימר מעבדה שימושי. כי אין לו התראה נשמעים עלול להפריע העכברים</li>
		<li>השתמש בסמן קבוע כדי לסמן את הזנב של כל עכבר (ליד הבסיס) כדי לסייע בזיהוי מהיר של העכבר הנכון במהלך הדגימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מסיכה של הכנת זנב ואיסוף הדם מראש.<ol>
<li>ב- 45 דקות לפני תחילת איסוף דם, להסיר את העכבר הראשון מהכלוב ומניחים על משטח מתאים (מכסה כלוב נקי עובד היטב) בתוך אבטחה הקבינט.</li>
		<li>להשתמש במספריים חדות, סטרילי כדי להסיר 1-2 מ מ של קצה זנב העכבר, בעקבות הכנת אספטי (קרי לשפשף עם betadine ואלכוהול). הערה: זה יכול להתבצע בבעלי ער באיפוק עדין או תחת הרדמה איזופלוריין.  בנוסף, שיכוך כאבים עשויים להינתן בעקבות המלצות IACUC המקומי.</li>
		<li>בזהירות ללטף את הזנב של העכבר כפי שתואר לעיל (1.1.2; 1-2 קווים מספיקים בדרך כלל) עד ה-droplet של דם צורות בקצה הזנב.</li>
		<li>השתמש פיפטה עם טיפ נקי כדי לאסוף 3 µL של דם מקצה הזנב ולהשליך את הטיפ פיפטה עם דם.</li>
		<li>לפני שחזר העכבר לכלוב שלו, לוודא כי זרימת הדם הפסיק. במידת הצורך, החל לחץ עדין עם גזה סטרילית.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.2.1 - 3.2.5 עבור כל העכברים. ניתן לאסוף דגימות דם עוקבות מאת בחוזקה ללטף את הזנב של העכבר עד droplet של צורות דם בקצה הזנב. הערה: אם droplet דם אינו הטופס לאחר משיחות המשרד, הזנב יכול להיות נכנס עם כרית גזה ספוגה תמיסת מלח. קרישי דם הם נוטים יותר טופס במהלך דגימה בתדירות נמוכה יותר (קרי > במרווחי זמן של 15 דקות). לאחר שקריש מנוקה מן הווריד, הדגימה תוכל להמשיך.</li>
		<li>להמשיך לאסוף 3 µL של דם בכל עכבר כמתואר לעיל כל 6 דקות למשך כ- 45 דקות במהלך תקופה זו הכנה איסוף דם מראש. למחוק את הטיפ דם, פיפטה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לקיחת דמים<ol>
<li>לאסוף 3 µL של דם מקצה הזנב כמתואר לעיל. קח זהירות כדי להבטיח כי לקיחת דגימה 3 µL כולו לתוך קצה פיפטה (ללא בועות או מצעים זיהום). הוצא את דגימת הדם לתוך המאגר assay בשפופרת עם תוויות. לערבב על ידי היפוך ולחזור ברכבת התחתית לקרח.</li>
		<li>לפני שחזר העכבר בכלוב, להבטיח זרימת הדם הפסיק. במידת הצורך, החל לחץ עדין עם גזה סטרילית.</li>
		<li>חזור על הצעדים 3.3.1 - 3.3.2 עבור כל עכבר, כל 6 דקות, משך הדגימה מראש. לפקח על כל בעל חיים סימנים של מצוקה (למשל סגור חלקית העפעפיים, תפקיד הכפוף [אינה נגרמת על ידי טיפול אחר] או חוסר תגובה לטיפול) ולסיים את הדגימה, במידת הצורך. הערה: מצוקה התנהגותית או לסיבוכים אחרים הדורשים סיום של הדגימה מתרחשות לעתים רחוקות מאוד במעבדה שלנו.</li>
		<li>אם בעלי חיים אינם מורדמים בעקבות לקיחת דמים, להבטיח זרימת הדם מהקצה הזנב הפסיק לגמרי. לנגב דם שנשפך מהחלק הפנימי של כל חיה בכלוב (או שינוי הכלובים) ולחזור חיות הכלובים אל המדף דיור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לטעום עיבוד וניתוח
<ol><li>לאחסן דגימות דם ב-20 ° C עד הניתוח. הערה: LH הוא לבדיקה בדגימות דם מדולל במאגר assay; אין הפרדה של sera או פלזמה נדרשת לפני אחסון או ניתוח.</li>
	<li>Assay דגימות דם מאת אליסה העדינה כמו שתואר לעיל ערכים1 וח ב- ng/mL של דם מלא בעקבות תיקון עבור דילול של אמצעי האחסון מדגם במאגר וזמינותו.</li>
	<li>לזהות LH פולסים בערכת הנתונים. לחשב ולהשוות הדופק הממוצע משרעת תדירות דופק (או מרווח בין הדופק) בהתאם לערכת הנתונים. הערה: קריטריונים שפורסמו13,14 תוכניות,15,16 לגילוי פולסים LH הינם זמינים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. , (2015).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+luteinizing+hormone+pulse+frequency+and+amplitude+by+testosterone+in+the+adult+male+rat.">Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat.</a> Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).</li><li>Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+a+robust+arcuate+GABAergic+input+to+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+a+model+of+polycystic+ovarian+syndrome.">Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).</li><li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse+and+Surge+Profiles+of+Luteinizing+Hormone+Secretion+in+the+Mouse.">Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li><li>Campos, P., Herbison, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li><li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li><li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice.">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li><li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technic+for+obtaining+blood+from+mice.">A new technic for obtaining blood from mice.</a> Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).</li><li>Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice.">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li><li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique.">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li><li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone:+differential+suppression+by+ovarian+steroids.">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li><li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes.">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li><li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DynPeak:+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series.">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).</li><li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion.">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li><li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice.">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li><li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress.">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li><li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>. Animal Welfare Inspection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017)</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן נתאר פרוטוקול עבור איסוף דם תכופים של דגימות דם כל זנב-טיפ להערכת הפרשת LH פועמת בעכברים. פרוטוקול זה מאפשר איסוף דגימות לגילוי של שינויים חריפה פועמת הפרשת LH בעקבות חשיפה דחק פסיכו-סוציאלי, והוא מותאם היטב עבור הערכה של LH פולסים מתחת אחרים מניפולציות אקוטי או כרוני.
הטיפ...

תפקוד בלוטת המין אצל יונקים הוא תלוי גונדוטרופין הפרשת הורמון מחלמן (LH), הורמוני, מבלוטת יותרת המוח. Gonadotropins המופרשים בדפוס או פועמת או גל בתגובה היפותלמי הפרשת הורמון releasing – גונדוטרופין (GnRH). סינתזה של הפרשת LH ו- FSH מוסדרים באמצעות פעולה אנדוקרינית, paracrine ו- autocrine מתוך מגוון של מולקולות כולל GnRH היפותלמי, האשכים הורמונים סטרואידים, מערכת activin-inhibin-follistatin, כמו גם מספר עצום של מצבים פיזיולוגיים כולל איזון מתח ואנרגיה. 2
הדפוס פועמת של LH בדם נובע הפרשות די פתאומי של LH לדם ההיקפי, ואחריו כ מעריכי חיסול. חשוב על תכונות של הדפוס כוללות את התדירות של כל הפרשה LH את משרעת של התגובה LH, אשר שניהם מוכתבים, בחלקו, על ידי שחרורו של GnRH. בשל הקושי באיסוף הדם פורטל ההיפותלמוס, יותרת המוח למדידת GnRH פועמת, דגימה של מדידה של LH משמש כמדד לקבלת GnRH רגולציה של הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים. לכן, מידע קריטי מקודד בתדר ו משרעת של LH פולסים, אשר לא ניתן לקבוע מתוך מדגם בודד.
ניתוח של הפרשת LH פועמת היסטורית הוגבלה ל היונקים הגדולים (בני אדם, יונקים ו כבשים) עקב שלהם נפח הדם גדול וסובלנות עבור איסוף דגימת דם תכופים. בחולדות, דגימה דם תכופים היה מוגבל חולדה, מושגת באמצעות שכינתה קטטר פרפור. 3 , 4 עלות נמוכה יחסית וזמינות של גנטי (למשל cre-לקס, CRISPR) ולבצע מניפולציות מורכבות מעגל עצבי (למשל optogenetics, chemogenetics) עכברים אורגניזם מודל יפה; עם זאת, הפרי של דגימות דם תכופים וניתוח עוקבות של LH ריכוזים עד לאחרונה, הוכח חמקמק. מטלה זו היה חלוץ ידי סטיין ועמיתים לעבודה. 1 מאז אז, מספר מעבדות החלו לנצל דגימה דם תכופים ואת מבחני לאולטרה רגישות LH כדי להעריך את הפרשת LH פועמת במגוון של פרדיגמות ניסיוני. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 יצוין כי המרדף אחר שיטה מעשית של איסוף דגימות דם מרובים מעכברים כבר מתקיים כבר שנים לפחות 4010 עם ליטושים מרובים שנעשתה בדרך. 11 , 12
הערכת דפוסי הדופק LH (כלומר תדר ו משרעת) מייצג עידון הגדולות בפיקוח גונדוטרופין הבזליים הפרשת במודל בעלי חיים זה גנטית צייתן. באופן מסורתי, LH ריכוזים בעכברים היו נחושים בדגימת דם בודדת. חולשה אחת הדוגמאות נקודה אחת היא ערכת נתונים משתנה מאוד בגלל ריכוזים LH הם יציבים באופן טבעי במהלך לכל פעימה. חולשה נוספת היא כי מדידות מבודד מטבעו לפסוח על מידע חיוני מועברת על ידי דפוסי הפרשת LH דופק. לפיכך, שיטה לאיסוף דגימות דם תכופים ב להתנהג בחופשיות, עכברים ערככם (למעט טיפול עדין במהלך דגימה) לספק מידע משופרת ולהוכיח שימושי מעבדות רבות חוקרים הורמון פועמת רגולציה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האוסף של בתדירות גבוהה (כל 6 דקות) דם דגימות ער, ערככם עכברים. חשוב לציין, אנו כוללים טיפול הסתגלות פרוטוקול המאפשר עבור זיהוי חזקה ומתמשכת של הפרשת LH פועמת בדגימות דם שנאסף מעל ניתן לקבוע את משך הזמן בו מראש, שלאחר הערכת אתגר חריפה, כמו התגובה ללחץ פסיכו-סוציאלי של קיבעון ואיפוק. וזמינותו יעיל עבור LH ריכוזים של דגימות דם שתיארנו קודם לכן; 1 שפרוטוקול זה מתמקדת שיטה לאיסוף דגימות הדם למדידה הדופק LH.

<table><tbody><tr><td>Biosaftey cabinet</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anhydrous)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Purified and filtered water</td></tr><tr><td>Broome Rodent Restraint Device</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-0460</td><td>Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion

במערכות רבות האנדוקרינית, במחזור הורמונים או גורמים לא מתפרסמים באופן רציף, אך מופרשים כמו דופק דיסקרטית בתגובה גורם releasing. נקודה אחת דגימה אמצעים מתאימים להבין באופן מלא את המשמעות הביולוגית של התבנית הפרשה של הורמונים פועמת בתנאים רגילים הפיזיולוגיות או במהלך תנאי dysregulation. הורמון מחלמן (LH) מסונתז על ידי תאים gonadotrope יותרת המוח הקדמי והוא מופרש בצורה תבניתית פועמת המחייב אוסף תכופים של דגימות דם להערכת הדופק. זה לא היה אפשרי בעכברים עד לאחרונה, עקב התפתחות assay LH רגישות גבוהה, התקדמות טכניקה עבור תכופים בנפח נמוך המדגם אוסף, תיאר בתחילה על ידי סטיין ועמיתיו. 1 כאן נתאר פרוטוקול עבור אוסף דגימת דם היקפיים תכופים של עכברים עם הסתגלות טיפול מספיק כדי לזהות פועמת הפרשת LH. בפרוטוקול הנוכחי מפרט תקופת הסתגלות מורחב המאפשר הערכה של פולסים חזקה ומתמשכת של LH שעות מרובות. פרוטוקול זה, קצה הזנב מקוצצת, דם נאסף מן הזנב באמצעות פיפטה של כף יד. עבור הערכה של LH פועמת בעכברים gonadectomized, טורי הדגימות שנאספו כל 5-6 דקות עבור 90-180 דקות חשוב, האוסף של דם ומדידה של פולסים חזקים של LH יכול להתבצע בעכברים ער, להתנהג בחופשיות, לתת טיפול הולם הסתגלות, מאמץ כדי למזער את גורמי איכות הסביבה. הסתגלות מספיק יכולה להיות מושגת תוך 4-5 שבועות לפני איסוף דם. פרוטוקול זה מדגיש ההתקדמות המתודולוגיה כדי להבטיח אוסף דגימות דם מלא עבור הערכת דפוסי הפרשת LH פועמת במשך שעות רבות בתוך העכבר, במודל בעלי חיים רב עוצמה לחקר נוירואנדוקרינים.

נציג LH הדופק דפוסים של עכברים 4 מוצגים באיור 1 (נתונים הודפס מחדש של יאנג. et al., 2017). LH נמדדה בדגימות דם בתדירות גבוהה כדי לקבוע את התגובה מהווה אתגר כהתקפת פסיכו-סוציאלי. עכברים C57/Bl6 הנשי למבוגרים היו ovariectomized, טיפל כמפורט בפרוטוקול זה עבור איסוף דם תכופי?...

Watch this Scientific Journal Video about Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion at JoVE.com

Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

כאן אנו מציגים פרוטוקול דגימה דם הזנב-טיפ לאיסוף הדגימה תכופים בעכברים ערככם. שיטה זו שימושית עבור להערכת דפוסי הפרשת הורמון מחלמן פועמת, יכול להיות מותאם ניתוח גורמים אחרים במחזור.

תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

frequent-tail-tip-blood-sampling-mice-for-assessment-pulsatile

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  University of California, San Diego School of Medicine. כאן אנו מציגים פרוטוקול דגימה דם הזנב-טיפ לאיסוף הדגימה תכופים בעכברים ערככם. שיטה זו שימושית עבור להערכת דפוסי הפרשת הורמון מחלמן פועמת, יכול להיות מותאם ניתוח גורמים אחרים במחזור.

Video: Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Immunology and Infection

Modified Blood Collection from Tail Veins of Non-anesthetized Mice with a Vacuum Blood Collection System and Eyeglass Magnifier

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. The tail veins of mice are small, and it is sometimes difficult to obtain the required blood volume by conventional puncture methods. This study investigates the superiority of repeated blood sample collection from tail veins of mice through use of a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier (experimental group) compared to conventional blood sampling methods (conventional group), performed by beginners and experts, respectively. With the help of an eyeglass magnifier, a butterfly needle tip is inserted into the tail vein of each mouse in the experimental group. When the vein is penetrated successfully, a blood sample is collected in the vacuum collection tube by insertion of the rubber end of a butterfly needle into the vacuum blood collection tube. The plunger is then used to collect blood without the help of the eyeglass magnifier in the conventional group. Success rates of blood sample collection by the beginners and experts were shown to be 70% vs. 100% (p &#60; 0.01) in the experimental group and 35% vs. 85% (p &#60; 0.01) in the conventional group. For both beginners and experts, puncture times required for obtaining required blood sample were significantly lower in the experimental group compared to the conventional group (2.40 &#177; 0.75 vs. 2.90 &#177; 0.31, p &#60; 0.05; 1.15 &#177; 0.37 vs. 1.55 &#177; 0.76, p &#60; 0.05). In conclusion, the presented blood sampling technique is feasible and easy to practice and enables frequent sampling of adequate blood volumes from non-anesthetized mice.&#160;

This study reports blood sampling from tail vein in mice using a vacuum extraction tube system with eyeglass magnifier. Our method is easy to practice and could be used for repeat blood sampling in mice.

איסוף ששונה דם מן הוורידים הזנב של עכברים שאינם מרדימים עם מערכת איסוף הדם ואקום, זכוכית מגדלת מוכספת

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. ...

Behavior

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a lean PCOS-like mouse model that mimics women with PCOS is clinically meaningful. In this protocol, we describe such a model. By inserting a 4 mm length of DHT (dihydrotestosterone) crystal powder pellet (total length of pellet is 8 mm), and replacing it monthly, we are able to produce a PCOS-like mouse model with serum DHT levels 2 fold higher than mice not implanted with DHT (no-DHT). We observed reproductive and metabolic dysfunction without changing body weight and body composition. While exhibiting a high degree of infertility, a small subset of these PCOS-like female mice can get pregnant and their offspring show delayed puberty and increased testosterone as adults. This PCOS-like lean mouse model is a useful tool to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

We describe the development of a lean PCOS-like mouse model with&#160;dihydrotestosterone pellet to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

מודל Hyperandrogenic העכבר ללמוד תסמונת השחלות הפוליציסטיות

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Developmental Biology

Handling Techniques to Reduce Stress in Mice

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects on&#160;animal well-being and can also be a confounding factor for experimental variables such as anxiety measures. Over the years, handling techniques that minimize handling-related stress have been developed with a particular focus on rats, and little attention to mice. However, it has been shown that mice can be habituated to manipulations using handling techniques. Habituating mice to handling reduces stress, facilitates routine handling, improves animal wellbeing, decreases data variability, and improves experimental reliability. Despite beneficial effects of handling, the tail-pick up approach, which is particularly stressful, is still widely used. This paper provides a detailed description and demonstration of a newly developed mouse-handling technique intended to minimize the stress experienced by the animal during human interaction. This manual technique is performed over 3 days (3D-handling technique) and focuses on the animal&#39;s capacity to habituate to the experimenter. This study also shows the effect of previously established tunnel handling techniques (using a polycarbonate tunnel) and the tail-pick up technique. Specifically studied are their effects on anxiety-like behaviors, using behavioral tests (Elevated-Plus Maze and Novelty Suppressed Feeding), voluntary interaction with experimenters and physiological measurement (corticosterone levels). The 3D-handling technique and the tunnel handling technique reduced anxiety-like phenotypes. In the first experiment, using 6-month-old male mice, the 3D-handling technique significantly improved experimenter interaction. In the second experiment, using 2.5-month-old female, it reduced corticosterone levels. As such, the 3D-handling is a useful approach in scenarios where interaction with the experimenter is required or preferred, or where tunnel handling may not be possible during the experiment.

This paper describes a handling technique in mice, the 3D-handling technique, which facilitates routine handling by reducing anxiety-like behaviors and presents details on two existing related techniques (tunnel and tail handling).

טכניקות טיפול להפחתת מתח בעכברים

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects ...

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

איסוף דם באמצעות ניקוב ורידים תת-מותני בעכברים

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

Medicine

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Biology

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

טכנולוגיית DREADDs ודגימת דם אוטומטית

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

מחבר זרקור: עירוי אוטומטי ודגימת דם לניתוח הורמונלי מדויק בעכברים מודעים

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

הפעלה עצבית מרחוק יחד עם דגימת דם אוטומטית כדי לגרום ולמדוד הורמון luteinizing במחזור בעכברים

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

איסוף ששונה דם מן הוורידים הזנב של עכברים שאינם מרדימים עם מערכת איסוף הדם ואקום, זכוכית מגדלת מוכספת

מודל Hyperandrogenic העכבר ללמוד תסמונת השחלות הפוליציסטיות

טכניקות טיפול להפחתת מתח בעכברים

איסוף דם באמצעות ניקוב ורידים תת-מותני בעכברים

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

הפעלה עצבית מרחוק יחד עם דגימת דם אוטומטית כדי לגרום ולמדוד הורמון luteinizing במחזור בעכברים

הפעלה עצבית מרחוק יחד עם דגימת דם אוטומטית כדי לגרום ולמדוד הורמון luteinizing במחזור בעכברים