Gli autori ringraziano la d. ssa Jennifer Yang e Kauffman Alexander (Sasha) per assistenza tecnica con questa tecnica, come pure numerose discussioni utili e critiche. Analisi dell'ormone del siero sono state effettuate da Yang et al., 2017 presso The University of Virginia Center for Research in riproduzione Ligand Assay e analisi Core, supportato da Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fonti di sostegno alla ricerca: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM è stata sostenuta da T32 NICHD 007203.

Il metodo qui descritto è in accordo con gli istituti nazionali di salute Animal Care e linee guida sull'uso e sono state autorizzate dal comitato di impiego presso l'Università di California, San Diego e istituzionali Animal Care.
1. acclimatazione alla movimentazione
<ol><li>Procedura di gestione dei<ol>
<li>Del mouse posto gabbie nella cappa di biosicurezza. Rimuovere il primo mouse dalla gabbia e posto su una superficie idonea (ad es. un coperchio gabbia pulita) all'interno della cappa di biosicurezza.</li>
		<li>Frenare dolcemente il mouse sul piano di lavoro tenendo la base della coda con il dito indice e il pollice di una mano. Quindi, saldamente corsa la superficie ventrale della coda, dalla base fino alla punta della coda, con l'indice e il pollice di altra mano. Ripetere l'operazione che segna 6 volte (cioè 1 insieme) e tornare il mouse alla sua gabbia.</li>
		<li>Attendere 6 min e ripetere il punto 1.1.2. Nota: In totale, passo 1.1.2 verrà ripetuto 4 volte per topo (cioè 4 gruppi di 6 colpi), così che ogni mouse riceverà un totale di 24 colpi di coda ogni giorno di trattamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La frequenza di maneggiamento quotidiano<ol>
<li>Da cinque fino a due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, è necessario gestire topi come descritto al punto 1.1, cinque giorni alla settimana (topi non vengono gestiti il sabato o la domenica fino alle ultime due settimane di acclimatazione).</li>
		<li>Se il trattamento sperimentale durante il periodo di campionamento includerà qualsiasi movimentazione aggiuntiva (ad esempio scruffing o iniezione intraperitoneale), acclimatare i topi a questa attività di manipolazione durante ogni sessione di trattamento. Nota: Per l'acclimatazione alle procedure di iniezione, utilizzare un ago smussato per eseguire una finta iniezione.</li>
		<li>Durante le due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, è necessario gestire topi come descritto in 1.1, sette giorni alla settimana.</li>
		<li>Almeno due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, casa topi a coppie per minimizzare le interruzioni ai topi durante il campionamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione di provette per prelievo ematico
<ol><li>Preparare il tampone di dosaggio ultrasensibile LH in bottiglia di vetro: 0,2% di albumina di siero bovino e 0.05% Tween-20 in PBS [0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (anidro), 0,24 g KH2PO4, acqua ultrapura a 1 L, pH 7.4, filtro e autoclave] , conservare a 4° C. 1 Nota: Volume di tampone di dosaggio ultrasensibile LH essere preparati può essere calcolato basato sul numero di campioni e il volume per esempio come indicato di seguito (2.2 & discussione)</li>
	<li>Preparare le provette per prelievo ematico (microcentrifuga 0,6 mL). Tubi e tampone aliquota etichette (57 µ l di tampone per tubo; notare, questo volume può variare a seconda del volume di sangue prelevato o il rapporto del sangue per il buffer desiderato). Tubi può essere preparato giorni prima del campionamento, conservare a 4 ° C.</li>
</ol>3. prelievo sangue
<ol><li>Preparazione di materiali di raccolta del sangue.<ol>
<li>Preparare il gabinetto di biosicurezza per l'uso e organizzare i seguenti materiali nella cappa o su un carrello è vicino a: 10 µ l (set di 3 µ l o volume di raccolta di sangue desiderata), puntali di pipetta, Pattumiera per puntali usati, timer, stampa con numero di animali e campione numeri ( per le note relative ai problemi di campionamento o animale), ghiaccio secchio con tubi di raccolta sangue, forbici e piccola garza (2 "x 2"). Nota: Il "contare" funzione su un timer di laboratorio è utile perché non ha un allarme acustico che potrebbe disturbare i topi</li>
		<li>Utilizzare un pennarello per segnare la coda di ogni mouse (vicino alla base) per semplificare l'identificazione rapida del mouse corretto durante il campionamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ritaglio della preparazione coda e pre-sangue raccolta.<ol>
<li>A 45 min prima dell'inizio della raccolta sangue, rimuovere il primo mouse dalla sua gabbia e posto su una superficie adatta (un coperchio gabbia pulita funziona bene) all'interno della biosicurezza armadietto.</li>
		<li>Usare le forbici taglienti, sterile per rimuovere 1-2 mm della punta della coda di topo, seguendo la preparazione asettica (cioè strofinare con alcol e betadine). Nota: Questo può essere ottenuto in animali svegli con dolce fermo o nell'ambito dell'anestesia isoflurano.  Inoltre, l'analgesia essere effettuato seguendo la raccomandazione del IACUC locale.</li>
		<li>Corsa con attenzione la coda del mouse, come descritto in precedenza (1.1.2; 1-2 colpi sono generalmente sufficienti) fino a quando la goccia di forme di sangue sulla punta della coda.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta con punta pulita per raccogliere 3 µ l di sangue dalla punta della coda ed eliminare il puntale della pipetta con sangue.</li>
		<li>Prima di restituire il mouse alla sua gabbia, garantire che il flusso di sangue è stata interrotta. Se necessario, applicare una leggera pressione con una garza sterile.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.2.1 - 3.2.5 per tutti i topi. Campioni di sangue successive possono essere raccolti da saldamente carezze coda di topo fino a una gocciolina di forme di sangue sulla punta della coda. Nota: Se una gocciolina di sangue non forma dopo colpi di fermi, la coda può essere tamponò con una garza imbevuta di soluzione fisiologica. I grumi sono più propensi a forma durante il campionamento meno frequente (cioè > intervalli di 15 min). Una volta che il coagulo è cancellato dalla vena, il campionamento può continuare.</li>
		<li>Continuare a raccogliere 3 µ l di sangue da ogni mouse come descritto sopra ogni 6 min per circa 45 min durante questo periodo di preparazione del pre-sangue raccolta. Eliminare la punta di sangue e pipetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prelievo di sangue<ol>
<li>Raccogliere 3 µ l di sangue dalla punta della coda come descritto sopra. Prendere le dovute precauzioni per assicurare che l'intero campione di 3 µ l si tenga la punta della pipetta (senza bolle o contaminazione di biancheria da letto). Espellere il campione di sangue nel tampone in una provetta etichettata. Mescolare per inversione e tornare il tubo al ghiaccio.</li>
		<li>Prima di restituire il mouse alla sua gabbia, garantire che il flusso sanguigno ha smesso. Se necessario, applicare una leggera pressione con una garza sterile.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.3.1 - 3.3.2 per ogni mouse, ogni 6 min, per la durata di campionamento predeterminati. Monitorare ogni animale per segni di sofferenza (per esempio parzialmente chiuse le palpebre, posizione ricurva [non causato da altro trattamento] o mancanza di risposta al trattamento) e terminare il campionamento, se necessario. Nota: Disagio comportamentale o altre complicazioni che richiedono la risoluzione di campionamento si presentano estremamente raramente nel nostro laboratorio.</li>
		<li>Se gli animali non sono euthanized dopo prelievo di sangue, è necessario garantire che il flusso di sangue dalla punta della coda è interrotto completamente. Pulire qualsiasi sangue versato dall'interno di ogni animale in gabbia (o cambiamento gabbie) e restituire le gabbie degli animali alla cremagliera di alloggiamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l'elaborazione e l'analisi del campione
<ol><li>Conservare i campioni di sangue a-20 ° C fino all'analisi. Nota: Il LH è analizzata in campioni di sangue intero diluiti in tampone del saggio; Nessuna separazione del siero o del plasma è necessaria prima del deposito o analisi.</li>
	<li>I campioni di sangue di dosaggio ultrasensibile Elisa come descritto in precedenza i valori1 e relazione in ng/mL di sangue intero dopo la correzione per la diluizione del volume campione nel tampone.</li>
	<li>Identificare gli impulsi LH nel set di dati. Calcolare e confrontare Ampiezza impulso media e frequenza dell'impulso (o intervallo di Inter-impulso) come appropriato per il set di dati. Nota: Criteri pubblicati13,14 e programmi, sono disponibili15,16 per il rilevamento di impulsi di LH.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. , (2015).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li><li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li><li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice.">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li><li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technic+for+obtaining+blood+from+mice.">A new technic for obtaining blood from mice.</a> Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).</li><li>Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice.">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li><li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique.">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li><li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone:+differential+suppression+by+ovarian+steroids.">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li><li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes.">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li><li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DynPeak:+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series.">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).</li><li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion.">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li><li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice.">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li><li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress.">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li><li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>. Animal Welfare Inspection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017)</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui descriviamo un protocollo per la raccolta di sangue frequenti tutta la punta della coda dei campioni di sangue per la valutazione della secrezione pulsatile di LH in topi. Questo protocollo consente il prelievo di campioni per il rilevamento di cambiamenti acuti nella pulsatile secrezione del LH dopo esposizione a stress psicosociale ed è particolarmente adatto per la valutazione degli impulsi LH sotto altre manipolazioni acute o croniche.
Un componente critico di questo protocollo per la...

Funzione della gonade in mammiferi dipende dalla secrezione della gonadotropina, ormone luteinizzante (LH) e follicolo-stimolante ormone, da parte della ghiandola pituitaria. Le gonadotropine sono secernute in entrambi un motivo pulsatile o sovratensioni in risposta alla secrezione ipotalamica di GnRH (GnRH). La sintesi e la secrezione di LH e di FSH sono regolati tramite azione endocrini, paracrini e autocrini da una varietà di molecole tra cui GnRH ipotalamico, ormoni steroidi gonadici e il sistema di activina-inhibin-follistatina, come pure una miriade di condizioni fisiologiche tra cui lo stress e del bilancio energetico. 2
Il modello pulsatile di LH nel sangue nasce da uno scarico piuttosto brusco di LH nel sangue periferico, seguita da circa esponenziale eliminazione. Importanti caratteristiche del modello includono la frequenza di ogni scarico di LH e l'ampiezza della risposta LH, entrambi i quali sono dettati, in parte, dal rilascio di GnRH. dovuta alla difficoltà nel raccogliere il sangue portale ipotalamo-ipofisario per la misura di GnRH pulsante, il campionamento e la misurazione di LH è usata come un proxy GnRH regolazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. Di conseguenza, le informazioni critiche sono codificate nella frequenza e l'ampiezza degli impulsi di LH, che non può essere determinata da un singolo campione.
Analisi della secrezione pulsatile di LH sono stato storicamente limitato ai grandi mammiferi (esseri umani, primati e pecore) a causa del loro sangue grande volume e tolleranza per la raccolta del campione di sangue frequenti. Nei roditori, prelievo di sangue frequenti era limitato al ratto e raggiunto tramite indwelling catetere atriale. 3 , 4 il relativamente basso costo e la disponibilità di genetica (ad es. cre-lox, CRISPR) e manipolazioni complesse circuito neurale (per esempio optogenetica, chemogenetics) rendono topi un organismo modello attraente; Tuttavia, realizzazione di campioni di sangue frequenti e successiva analisi delle concentrazioni di LH è fino a recentemente, dimostrato sfuggente. Tale compito monumentale è stata introdotta da Steyn e colleghi di lavoro. 1 da allora, diversi laboratori hanno iniziato a utilizzare frequenti prelievi e analisi di LH ultra-sensibili per valutare pulsatile secrezione del LH in una varietà di paradigmi sperimentali. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 si noti che il perseguimento di un metodo pratico di raccogliere più campioni di sangue dai topi è stato in corso per almeno 40 anni10 con più perfezionamenti fatto lungo la strada. 11 , 12
Valutazione dei modelli di impulso del LH (cioè frequenza e ampiezza) rappresenta un importante affinamento in monitoraggio secrezione della gonadotropina basale in questo modello animale geneticamente trattabile. Tradizionalmente, le concentrazioni di LH in topi sono state determinate in un campione di sangue. Una debolezza di singolo-punto campioni è un set di dati altamente variabile perché le concentrazioni di LH sono naturalmente fluttuanti durante ogni impulso. Un altro punto debole è che misure isolate perdere intrinsecamente critiche informazioni veicolate dai pattern di secrezione di impulso del LH. Così, un metodo per la raccolta di campioni di sangue frequenti a comportarsi liberamente, topi sfrenati (ad eccezione di manipolazione delicata durante il campionamento) fornirà informazioni avanzate e rivelarsi utili per molti laboratori indagando la regolazione dell'ormone pulsatile.
Qui, descriviamo un protocollo per la raccolta di frequente (ogni 6 min) campioni dai topi svegli, sfrenati di sangue. D'importanza, includiamo una gestione protocollo di acclimatazione che consente per rilevamento affidabile e continuo della secrezione pulsatile di LH in campioni di sangue intero raccolti nel corso di un periodo di tempo in cui pre- e Post-assesment ad una sfida acuta può essere determinato, come la risposta allo stress psicosociale di immobilizzazione e contenimento. Un dosaggio efficace per le concentrazioni di LH da campioni di sangue intero è stato descritto in precedenza; 1 il presente protocollo è focalizzato su un metodo per raccogliere i campioni di sangue per la misura di impulso del LH.

<table><tbody><tr><td>Biosaftey cabinet</td><td>Lab Products Inc</td><td>L/F-B</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A5403</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anhydrous)</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Purified and filtered water</td></tr><tr><td>Broome Rodent Restraint Device</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-0460</td><td>Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.</td></tr><tr><td>DynPeak</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td></tr></tbody></table>

frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion

In molti sistemi endocrini, ormoni o fattori circolanti non vengono rilasciati continuamente, ma sono secreti come impulsi discreti in risposta ad un fattore di rilascio. Singolo punto di campionamento misure non siano sufficienti comprendere appieno il significato biologico di modello secretivo di ormoni pulsatile o in condizioni fisiologiche normali, o anche durante condizioni della disregolazione. Ormone luteinizzante (LH) è sintetizzata dalle cellule gonadotrope pituitaria anteriore e secreta in un modello pulsatile che richiede frequente raccolta di campioni di sangue per la valutazione del polso. Questo non è stato possibile nei topi fino a recentemente, a causa dello sviluppo di un dosaggio di LH di alto-sensibilità e avanzamento in una tecnica per frequente campionario a basso volume, inizialmente descritto da Steyn e colleghi. 1 qui descriviamo un protocollo per la raccolta del campione di sangue periferico frequenti da topi con sufficiente acclimatazione di movimentazione per rilevare pulsatile secrezione di LH. L'attuale protocollo i dettagli di un periodo di acclimatazione espanso che permette la valutazione di impulsi robusti e continui di LH nel corso di più ore. In questo protocollo, la punta della coda viene ritagliata e sangue raccolti dalla coda utilizzando una pipetta tenuto in mano. Per la valutazione di LH pulsatile in topi gonadectomized, campioni di serie sono raccolti ogni 5-6 minuti per un minimo di 90-180 d'importanza, la raccolta di sangue e misurazione di impulsi robusti di LH può essere realizzati in topi svegli, liberamente si comporta, dati adeguata manipolazione acclimatazione e lo sforzo per ridurre al minimo i fattori di stress ambientale. Sufficiente acclimatazione può essere raggiunto entro 4-5 settimane prima della raccolta del sangue. Questo protocollo evidenzia progressi nella metodologia per garantire la raccolta di campioni di sangue intero per la valutazione dei pattern di secrezione LH pulsatile sopra più ore nel topo, un potente modello animale per la ricerca della neuroendocrina.

Rappresentante modelli impulso del LH 4 topi sono illustrati nella Figura 1 (dati ristampati da Yang et al., 2017). LH è stata misurata in campioni di sangue frequenti per determinare la risposta ad una sfida sforzo psicosociale acuto. Topi C57/Bl6 femminili adulti erano ovariectomizzati e gestiti come dettagliate nel presente protocollo per la raccolta del sangue frequenti. I campioni di sangue sono stati raccolti per i primi 90 min in tutti gli an...

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Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Qui presentiamo un protocollo di campionamento di sangue punta della coda per la raccolta del campione di frequente nei topi sfrenati. Questo metodo è utile per la valutazione dei modelli di secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante e potrebbe essere adattato per l'analisi di altri fattori circolanti.

Frequenti prelievi di punta della coda in topi per la valutazione della secrezione Pulsatile dell'ormone luteinizzante

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

frequent-tail-tip-blood-sampling-mice-for-assessment-pulsatile

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  University of California, San Diego School of Medicine. Qui presentiamo un protocollo di campionamento di sangue punta della coda per la raccolta del campione di frequente nei topi sfrenati. Questo metodo è utile per la valutazione dei modelli di secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante e potrebbe essere adattato per l'analisi di altri fattori circolanti.

Video: Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

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Immunologia e infezioni

Modified Blood Collection from Tail Veins of Non-anesthetized Mice with a Vacuum Blood Collection System and Eyeglass Magnifier

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. The tail veins of mice are small, and it is sometimes difficult to obtain the required blood volume by conventional puncture methods. This study investigates the superiority of repeated blood sample collection from tail veins of mice through use of a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier (experimental group) compared to conventional blood sampling methods (conventional group), performed by beginners and experts, respectively. With the help of an eyeglass magnifier, a butterfly needle tip is inserted into the tail vein of each mouse in the experimental group. When the vein is penetrated successfully, a blood sample is collected in the vacuum collection tube by insertion of the rubber end of a butterfly needle into the vacuum blood collection tube. The plunger is then used to collect blood without the help of the eyeglass magnifier in the conventional group. Success rates of blood sample collection by the beginners and experts were shown to be 70% vs. 100% (p &#60; 0.01) in the experimental group and 35% vs. 85% (p &#60; 0.01) in the conventional group. For both beginners and experts, puncture times required for obtaining required blood sample were significantly lower in the experimental group compared to the conventional group (2.40 &#177; 0.75 vs. 2.90 &#177; 0.31, p &#60; 0.05; 1.15 &#177; 0.37 vs. 1.55 &#177; 0.76, p &#60; 0.05). In conclusion, the presented blood sampling technique is feasible and easy to practice and enables frequent sampling of adequate blood volumes from non-anesthetized mice.&#160;

This study reports blood sampling from tail vein in mice using a vacuum extraction tube system with eyeglass magnifier. Our method is easy to practice and could be used for repeat blood sampling in mice.

Raccolta del sangue modificate dalle vene di coda dei topi Non anestetizzati con un sistema di raccolta di sangue sotto vuoto e la lente di ingrandimento per occhiali

Blood sample collection is the basis of experimental animal research. It is of importance to obtain adequate blood samples for various research purposes. ...

Comportamento

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a lean PCOS-like mouse model that mimics women with PCOS is clinically meaningful. In this protocol, we describe such a model. By inserting a 4 mm length of DHT (dihydrotestosterone) crystal powder pellet (total length of pellet is 8 mm), and replacing it monthly, we are able to produce a PCOS-like mouse model with serum DHT levels 2 fold higher than mice not implanted with DHT (no-DHT). We observed reproductive and metabolic dysfunction without changing body weight and body composition. While exhibiting a high degree of infertility, a small subset of these PCOS-like female mice can get pregnant and their offspring show delayed puberty and increased testosterone as adults. This PCOS-like lean mouse model is a useful tool to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

We describe the development of a lean PCOS-like mouse model with&#160;dihydrotestosterone pellet to study the pathophysiology of PCOS and the offspring from these PCOS-like dams.

Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Biologia dello sviluppo

Handling Techniques to Reduce Stress in Mice

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects on&#160;animal well-being and can also be a confounding factor for experimental variables such as anxiety measures. Over the years, handling techniques that minimize handling-related stress have been developed with a particular focus on rats, and little attention to mice. However, it has been shown that mice can be habituated to manipulations using handling techniques. Habituating mice to handling reduces stress, facilitates routine handling, improves animal wellbeing, decreases data variability, and improves experimental reliability. Despite beneficial effects of handling, the tail-pick up approach, which is particularly stressful, is still widely used. This paper provides a detailed description and demonstration of a newly developed mouse-handling technique intended to minimize the stress experienced by the animal during human interaction. This manual technique is performed over 3 days (3D-handling technique) and focuses on the animal&#39;s capacity to habituate to the experimenter. This study also shows the effect of previously established tunnel handling techniques (using a polycarbonate tunnel) and the tail-pick up technique. Specifically studied are their effects on anxiety-like behaviors, using behavioral tests (Elevated-Plus Maze and Novelty Suppressed Feeding), voluntary interaction with experimenters and physiological measurement (corticosterone levels). The 3D-handling technique and the tunnel handling technique reduced anxiety-like phenotypes. In the first experiment, using 6-month-old male mice, the 3D-handling technique significantly improved experimenter interaction. In the second experiment, using 2.5-month-old female, it reduced corticosterone levels. As such, the 3D-handling is a useful approach in scenarios where interaction with the experimenter is required or preferred, or where tunnel handling may not be possible during the experiment.

This paper describes a handling technique in mice, the 3D-handling technique, which facilitates routine handling by reducing anxiety-like behaviors and presents details on two existing related techniques (tunnel and tail handling).

Tecniche di manipolazione per ridurre lo stress nei topi

Laboratory animals are subjected to multiple manipulations by scientists or animal care providers. The stress this causes can have profound effects ...

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

Prelievo di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei topi

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

Medicina

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

Valutazione della capacità di manipolazione dei lipidi di tutto il corpo nei topi

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Prelievo di sangue dalla vena della coda laterale del Topo

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Biologia

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. Dysregulated glucose metabolism is an important manifestation of the disease and is the key to its pathogenesis. Therefore, studies involving evaluation of glucose metabolism in PCOS are of utmost importance. Very few studies have quantified hepatic glucose production directly in PCOS models using non-radioactive glucose tracers. In this study, we discuss step-by-step instructions for the quantification of the rate of hepatic glucose production in a PCOS mouse model by measuring M+2 enrichment of [6,6-2H2]glucose, a stable isotopic glucose tracer, via gas chromatography - mass spectrometry (GCMS). This procedure involves creation of stable isotopic glucose tracer solution, use of tail vein catheter placement and infusion of the glucose tracer in both fasting and glucose-rich states in the same mouse in tandem. The enrichment of [6,6-2H2]glucose is measured using pentaacetate derivative in GCMS. This technique can be applied to a wide variety of studies involving direct measurement of the rate of hepatic glucose production.

This study describes the direct measurement of hepatic glucose production in a polycystic ovary syndrome mouse model by using a stable isotopic glucose tracer via tail vein in both fasting and glucose-rich states in tandem.

Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Tecnologia DREADDs e prelievo automatico di sangue

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

Autore in primo piano: Infusione automatizzata e prelievo di sangue per un'analisi ormonale precisa nei topi coscienti

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

Attivazione neuronale remota accoppiata con campionamento automatico del sangue per indurre e misurare l'ormone luteinizzante circolante nei topi

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

Frequenti prelievi di punta della coda in topi per la valutazione della secrezione Pulsatile dell'ormone luteinizzante

Riepilogo

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Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Raccolta del sangue modificate dalle vene di coda dei topi Non anestetizzati con un sistema di raccolta di sangue sotto vuoto e la lente di ingrandimento per occhiali

Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

Tecniche di manipolazione per ridurre lo stress nei topi

Prelievo di sangue attraverso la puntura della vena subclavia nei topi

Valutazione della capacità di manipolazione dei lipidi di tutto il corpo nei topi

Prelievo di sangue dalla vena della coda laterale del Topo

Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

Attivazione neuronale remota accoppiata con campionamento automatico del sangue per indurre e misurare l'ormone luteinizzante circolante nei topi

Attivazione neuronale remota accoppiata con campionamento automatico del sangue per indurre e misurare l'ormone luteinizzante circolante nei topi