Name: design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack
Uploaded: 2018-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack at JoVE.com

Questa ricerca è stata parzialmente sostenuta dal programma internazionale del centro di sviluppo ricerca attraverso National Research Foundation di Korea(NRF) finanziato dal Ministero della scienza e ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345) e Nano· Programma di sviluppo di tecnologia materiale attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza e ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610). L'Istituto di ricerca ingegneria all'Università nazionale di Seoul fornito di strutture di ricerca per questo lavoro. Autori riconoscono gratitudine verso Yoon Tae-Young (scienze biologiche, Università nazionale di Seul) per quanto riguarda la spettroscopia di fluorescenza per l'analisi FRET.

1. progettazione dei 6 da 6 DNA fisarmonica Rack con caDNAno14
<ol><li>Scaricare e installare caDNAno 2.0 software14 per progettare un rack di fisarmonica di DNA (caDNAno 2.5 è anche disponibile su https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Aprire caDNAno14 e fare clic sullo Strumento di Piazza per aggiungere una nuova parte con un reticolo quadrato.</li>
	<li>Numero ogni fascio della cremagliera della fisarmonica e disegnare sul pannello di sinistra della grata del caDNAno14 (Figura 2).</li>
	<li>Fare clic sullo strumento matita e disegnare ogni fascio sul pannello di destra modifica il caDNAno14. Interruzione di travi ogni 32 bp, che è per giunti tra fasci adiacenti. Posto fiocco crossover nella stessa posizione come le articolazioni. Utilizzare lo Strumento di inserimento e lo Strumento matita in caDNAno14 a lasciare i giunti hanno ulteriori singolo filamento crossover.</li>
	<li>Fare clic sullo Strumento matita e collegare i giunti. Ogni fascio ha sette articolazioni.</li>
	<li>Generare patibolo crossover per unire le impalcature il singolo ciclo utilizzando il patibolo precedentemente segnalato11di algoritmo di routing. Non lasciate il dominio obbligatorio minimo tra le ciocche impalcatura e fiocco sia minore di 8 bp (Figura 3).</li>
	<li>Posizionare i ponteggi che non vengono utilizzati nell'assieme i vertici situati sui lati opposti della cremagliera della fisarmonica, come mostrato nella Figura 3.</li>
	<li>Scegliere il Tool di rompere. Rompere i fili dove fili graffette sono circolari o più di 60 bp.</li>
	<li>Progettare i filamenti di DNA serratura.<ol>
<li>Scegliere il Tool di rompere. Pausa 8 bp di una regione di DNA fiocco per fare una parte appiccicosa ed eliminare 8 bp di una regione di DNA fiocco. Ci sono 18 parti appiccicosi (Figura 1) nel rack fisarmonica 6 per 6.</li>
		<li>Inserire sequenze che sono inversione complementari alle parti appiccicose ad entrambe le estremità dei fili di blocco e collegarli da una regione gettante un ponte, che consiste di poli T fili della lunghezza desiderata (Figura 1B).</li>
		<li>Per la riconfigurazione, aggiungere 8 bp delle sequenze di punto d'appoggio all'estremità del DNA serrature per spostamento del filo. La sequenza di punto d'appoggio utilizzata è nella tabella 2.</li>
		<li>Preparare i fili di poli A cui sono invertire complementari alla regione gettante un ponte.</li>
		<li>Fili di progettazione che sono invertire complementari per i blocchi di DNA per l'esperimento di riconfigurazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare clic sullo Strumento di sequenza e fare clic su impalcatura DNA. Scegliere il patibolo come standard M13mp18. fare clic sullo Strumento Esporta e Salva sequenza in formato csv (tabella 1).</li>
</ol>2. simulare la struttura con il oxDNA
<ol><li>Scaricare e installare il oxDNA16,17. L'ultimo codice sorgente è disponibile su https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.</li>
	<li>Rendere i file di configurazione iniziale dal caDNAno14 file utilizzando script python 'cadnano_interface.py', che viene fornito nel pacchetto di17 16,oxDNA. L'utilizzo è come segue: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. Il file della topologia e il file di configurazione vengono ora generati. Nota: Il file della topologia include quanti fili e nucleotidi sono nella struttura e informazioni per quanto riguarda la spina dorsale-backbone legami tra nucleotidi. Il file di configurazione contiene informazioni generali quali timestep, energia e formato del contenitore. Informazioni di orientamento come vettore posizione, vettore di spina dorsale-base, vettore normale, velocità e velocità angolare di nucleotidi è anche incluso (Figura 4).</li>
	<li>Modificare le informazioni nel file di configurazione e topologia da caDNAno14 per farli riflettere le informazioni reali strutturali della cremagliera della fisarmonica. Tutti i fasci sono disposti in parallelo quando sono visualizzati i file di configurazione e topologia da caDNAno14 . Tuttavia, il rack della fisarmonica è una struttura reticolare così la distanza fra i nucleotidi legati sono lontano per simulazione (Figura 5).<ol>
<li>Ruotare e spostare ogni trave a struttura reticolare desiderata. Le nove colonne sulla sinistra nel file di configurazione sono il vettore posizione, vettore di spina dorsale-base e vettore normale (Figura 4). Per ruotare un fascio, ruota tutto della posizione, spina dorsale-base e normali vettori utilizzando la trasformazione di rotazione. Quindi spostare una trave modificando il vettore posizione per individuarlo come mostrato nella Figura 5.</li>
		<li>Rilassarsi alla struttura utilizzando lo script fornito nel pacchetto oxDNA (vedere l'esempio in $oxDNA/esempi/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION per maggiori informazioni).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la simulazione di dinamica molecolare per 10 milioni passaggi utilizzando il file di configurazione rilassato. L'utilizzo è come segue: '. / oxDNA < input >' Salva dati ogni 5000 o 10000 passi.</li>
	<li>Visualizzazione Nota: Le strutture sono state visualizzate utilizzando cogli.<ol>
<li>Scaricare e installare l'ultima versione di cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).</li>
		<li>Eseguire la cogli con i file di configurazione e topologia dalla simulazione oxDNA. L'utilizzo è come segue: '. / cogli1 -t < file della topologia >< file di configurazione >'.</li>
		<li>Nascondere la casella premendo b.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sintesi della struttura
Nota: Il metodo di sintesi è adattato dal precedente protocollo15,18.
<ol><li>Acquistare le graffette di DNA progettate da un provider di oligonucleotidi.</li>
	<li>Regolare la concentrazione di queste graffette di DNA a 100 μM utilizzando acqua priva di nucleasi.<ol>
<li>Piscina ogni filamento di DNA che costituisce una struttura 'stato libero' in una provetta e regolare la concentrazione a 2 μM per ogni filo.</li>
		<li>Piscina del DNA serratura fili di lunghezza e numero di blocco siti nelle provette e regolare la concentrazione a 2 μM per ogni filo. 18, 9 e 4 siti di blocco vengono utilizzati. Aggiungere filamenti di A poli che sono complementari alla regione passerella alla stessa concentrazione.</li>
		<li>Fili di piscina che sono invertire complementare al DNA bloccare fili di lunghezza nelle provette e regolare la concentrazione a 2 μM per ogni filo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare MgCl2 soluzione di 300 nM mescolando 70 μL di acqua esente da nucleasi e 30 μL della 1 soluzione μM MgCl2 . Preparare una soluzione di EDTA Tris di 5x con 95 μL di acqua esente da nucleasi e 5 μL della soluzione di EDTA Tris 100 x.</li>
	<li>Aggiungere 2 μL di DNA, 1,1 μL della soluzione di MgCl2 fiocco, 2 μL di soluzione di EDTA Tris, 7,6 μL di acqua esente da nucleasi e 7,3 μL di DNA dell'impalcatura di cui la concentrazione è di 110 nM a fare 20 μL di stock misto. Impostare la concentrazione finale dell'impalcatura del DNA a 40 nM, fiocco del DNA a 200 nM, MgCl2 a 16 mM e la soluzione di EDTA Tris a 0.5 x.</li>
	<li>Rapidamente riscaldare la soluzione stock mista in un termociclatore a 80 ° C e fredda a 60 ° C a una velocità di 4 min per ° C e cool da 60 ° C a 4 ° C a una velocità di 40 min per ° C.</li>
</ol>4. purificazione della struttura
Nota: I campioni di tutte le strutture sono stati purificati prima dell'analisi. In questa sezione descriviamo il protocollo di purificazione di PEG, che è adattato da precedente letteratura19. Il campione può essere purificato anche mediante elettroforesi su gel come descritto nella precedente letteratura15,18.
<ol><li>Preparare 5 M di NaCl e 100 x Tris-EDTA.</li>
	<li>Preparare tampone di precipitazione miscelando 150 μL di PEG 8000, 500 μL di 100 x Tris EDTA e 101 μL di 5 M di NaCl e 249 μL di acqua esente da nucleasi.</li>
	<li>Preparare buffer di destinazione con 5,5 μL di 300 nM MgCl2 soluzione da sezione 3.3, 10 μL di soluzione di EDTA Tris x 5 dalla sezione 3.3 e 84,5 μL di acqua esente da nucleasi.</li>
	<li>Mix 20 μL della struttura sintetizzata dalla sezione 3 e 20 μL di buffer di precipitazione da sezione 4.2. Poi girare lo stock misto a 16000 x g a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e dissolva pallina nel buffer di destinazione da sezione 4.3.</li>
</ol>5. riconfigurazione del Rack fisarmonica da uno stato di' libero' per un 'stato bloccato'
<ol><li>Sintetizzare la struttura senza blocchi di DNA per l'esperimento di configurazione.</li>
	<li>Preparare i filamenti di DNA serratura dalla sezione 3.</li>
	<li>Aggiungere 2 μL di filamenti di DNA serratura della lunghezza desiderata in 20 μL della struttura sintetizzata. Concentrazione dei filamenti di DNA serratura è cinque volte maggiore rispetto alla struttura.</li>
	<li>Incubare il campione per 0, 10, 25, 50, o 100 minuti per vedere quanto veloce riconfigurazione si verifica.<ol>
<li>Per l'incubazione di 100 minuti, incubare il campione a 50 ° C per 30 minuti e raffreddare lentamente fino a 25 ° C a una velocità di 0,33 ° C/minuto.</li>
		<li>Per l'incubazione di 50 minuti, incubare il campione a 50 ° C per 15 minuti e raffreddare lentamente fino a 25 ° C a una velocità di 0.66 ° C/minuto.</li>
		<li>Per l'incubazione di 25 minuti, incubare il campione a 50 ° C per 7,5 minuti e raffreddare lentamente fino a 25 ° C a una velocità di 1,32 ° C/minuto.</li>
		<li>Per l'incubazione di 10 minuti, incubare il campione a 50 ° C per 3 minuti e raffreddare lentamente fino a 25 ° C a una velocità di 3,3 ° C/minuto.</li>
		<li>Per l'incubazione di 0 minuti, conservare il campione a 4 ° C a destra dopo l'aggiungono di filamenti di DNA serrature.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Subito dopo la fase di fissaggio, raffreddare rapidamente il campione a 4 ° C per evitare indesiderata denaturazione.</li>
</ol>6. riconfigurazione del Rack fisarmonica da un stato 'bloccato' per uno "stato libero"
<ol><li>Sintetizzare la struttura con blocchi di DNA della lunghezza desiderata per l'esperimento di configurazione.</li>
	<li>Preparare fili complementari inversione dalla sezione 3.</li>
	<li>Aggiungere 2 μL di fili che sono invertire complementari sui filamenti di blocco della lunghezza desiderata in 20 μL della struttura sintetizzata. Concentrazione dei filamenti di DNA serratura è cinque volte maggiore rispetto alla struttura.</li>
	<li>Incubare il campione per 0, 12, 60, 120, 240 minuti per vedere quanto veloce riconfigurazione si verifica.<ol>
<li>Per le 12, 60, 120, incubazione di 240 minuti, rapidamente riscaldare il campione a 40 ° C e raffreddare lentamente fino a 20 ° C per il tempo corrispondente a ciascuno. Subito dopo la fase di scollegamento, raffreddare rapidamente il campione a 4 ° C per evitare indesiderata denaturazione.</li>
		<li>Per l'incubazione di 0 minuti, conservare campione a 4 ° C a destra dopo invertire fili complementari sono state aggiunte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. TEM Imaging
Nota: Protocollo imaging TEM è stato adattato da precedente letteratura18,20.
<ol><li>Preparare soluzione di NaOH M 1,25 con 87,5 μL di acqua esente da nucleasi e 12,5 μL di soluzione di NaOH 10 M.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di soluzione di NaOH di 1,25 M a 50 μL di soluzione di formiato di uranile al 2%.</li>
	<li>Vortice la soluzione per 3 minuti e centrifugare a massima velocità per 3 minuti. Deposito 3 μL del campione purificato sulla griglia di partenza TEM di Scarica a bagliore per 3 minuti e lavare rapidamente con carta da filtro.</li>
	<li>Deposito 7 μL di soluzione di formiato di uranile preparato per 30 secondi e lavare rapidamente con carta da filtro.</li>
	<li>Misurare la lunghezza e l'angolo della struttura della fisarmonica imaged di TEM.</li>
</ol>8. FRET analisi
<ol><li>Utilizzare Atto 550 e tintura di Atto 647N, per cui la distanza di Förster è 6.5 nm. Sostituire 58 fiocco e fiocco 117 nella tabella 1 con filamenti fluorescente etichettati. Quindi di sintetizzare la struttura con fili fluorescente etichettati secondo il metodo descritto nella sezione 3.</li>
	<li>Misurare la concentrazione del campione purificato.</li>
	<li>Normalizzare il campione a 10 nM e carico 50 μL di 384 micropiastre bene.</li>
	<li>Eccitare il campione con coloranti donatore e accettore a 550 nm e misura dello spettro di fluorescenza da 570 nm a 800 nm con un fluorimetro.</li>
	<li>Misurare lo spettro di fluorescenza del campione solo donatore nello stesso modo.</li>
	<li>Eccitare le tinture del campione a 650 nm e lo spettro di fluorescenza e misura da 670 nm a 800 nm. Si tratta di misurare la concentrazione di acceptor.</li>
	<li>Ottenere le deviazioni standard ripetendo lo stesso esperimento con tre campioni, che vengono sintetizzati e purificati separatamente.</li>
	<li>Calcolare l'efficienza FRET con il rapporto di un metodo come descritto dall'equazione sotto21. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> DA550: intensità di fluorescenza di picco accettore del campione con donatore e accettore a eccitazione di 550 nm. D550: intensità di fluorescenza nell'intervallo di emissione accettore del campione solo donatore a eccitazione di 550 nm. DA650: intensità di fluorescenza di picco accettore del campione con donatore e accettore a eccitazione di 650 nm.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare

Questo protocollo introduce l'intero processo dalla progettazione, simulazione, sintesi e analisi della cremagliera della fisarmonica DNA 2D base. Le regole di simulazione e Progettazione modificata sono stati descritti perché la regola di progettazione è diverso da quello di origami di DNA standard, in quanto il rack di fisarmonica di DNA ha nucleotidi supplementari presso i crossover per flessibilità14,15. Da questo, ci aspettiamo che il protocollo può acce...

Sistemi meccanici basati su nanostrutture di DNA o DNA nanomacchine1,2,3,4,5 sono unici perché producono movimento complessi su scala nanometrica in 2D e 3D in nanometro a Ångström risoluzione, secondo vari biomolecolari stimoli2,3,6. Associare i materiali funzionali su queste strutture e controllando le loro posizioni, queste strutture possono essere applicate alle varie aree. Per esempio, DNA nanomacchine sono stati proposti per un reattore molecolare7, droga consegna8e nanoplasmonic sistemi9,10.
In precedenza, abbiamo introdotto il riconfigurabile rack fisarmonica del DNA, che può manipolare una rete su scala nanometrica 2D o 3D di elementi11 (Figura 1A). A differenza di altre DNA nanomacchine che controllano solo pochi elementi, la piattaforma può manipolare collettivamente periodicamente disposti elementi 2D o 3D in varie fasi. Prevediamo che una rete di reazione chimica e biologica programmabile o un sistema di calcolo molecolare può essere costruito dal nostro sistema, aumentando il numero di elementi controllabili. La cremagliera della fisarmonica di DNA è una struttura, in cui la rete di fasci multipli di DNA è collegata alle articolazioni composti di DNA single-stranded (Figura 1B). La cremagliera della fisarmonica generata dai fasci del DNA viene riconfigurata da blocchi di DNA, che ibridano a parte adesiva di travi e cambiare l'angolo tra le travi secondo la lunghezza della parte passerella delle serrature (stato bloccato). Inoltre, multi-step riconfigurazione è dimostrato aggiungendo nuove serrature dopo la formazione dello stato libero rimuovendo blocchi di DNA attraverso basati su toehold strand displacement12,13.
In questo protocollo, descriviamo l'intero processo di progettazione e sintesi di rack fisarmonica DNA riconfigurabile. Il protocollo comprende progettazione, simulazione, gli esperimenti di laboratorio bagnato e analisi per la sintesi del DNA della fisarmonica rack di 6 per 6 maglie e una riconfigurazione di questi. La struttura coperta nel protocollo è il modello base della precedente ricerca11 e 65 nm da 65 nm in dimensioni, composto da 14 fasci. In termini di progettazione e simulazione, la progettazione strutturale della cremagliera della fisarmonica è diversa da convenzionale del DNA origami14,15 (cioè, imballato strettamente). Pertanto, la regola di progettazione e simulazione molecolare sono stati modificati dai metodi tradizionali. Per illustrare, mostriamo la tecnica di progettazione utilizzando il metodo modificato di caDNAno14 e la simulazione del rack fisarmonica utilizzando oxDNA16,17 con script aggiuntivi. Infine, sono descritti entrambi i protocolli di TEM e FRET per l'analisi delle strutture configurato rack della fisarmonica.

<table><tbody><tr><td>M13mp18 Single-stranded DNA</td><td>NEB</td><td>N4040s</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Solution</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer</td><td>Biosesang</td><td>T2142</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>5M Sodium Chloride solution</td><td>Biosesang</td><td>s2007</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2038</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl formate</td><td>Thomas Science</td><td>C993L42</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodropic 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM (LIBRA 120)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer Enspire 2300</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Labogene</td><td>LZ-1580</td><td></td></tr></tbody></table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

Sistemi meccanici basati su nanostrutture di DNA o DNA nanomacchine, che producono movimento complessi su scala nanometrica in 2D e 3D in nanometro ångström risoluzione, mostrano il grande potenziale in vari campi della nanotecnologia come i reattori molecolare, consegna della droga, e sistemi di nanoplasmonic. Il rack di fisarmonica DNA riconfigurabile, che può manipolare collettivamente una rete su scala nanometrica 2D o 3D di elementi, in più fasi in risposta agli ingressi del DNA, è descritto. La piattaforma ha il potenziale per aumentare il numero di elementi che DNA nanomacchine controllabili da pochi elementi per una scala di rete con più fasi di riconfigurazione.
In questo protocollo, descriviamo l'intero processo sperimentale del rack fisarmonica DNA riconfigurabile di 6 per 6 maglie. Il protocollo comprende una procedura di simulazione e regola di progettazione delle strutture e un esperimento di bagnato-laboratorio per sintesi e riconfigurazione. Inoltre, analisi della struttura utilizzando TEM (microscopia elettronica di trasmissione) e FRET (trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza) sono incluso nel protocollo. I nuovi metodi di progettazione e simulazione coperti in questo protocollo aiuterà i ricercatori a utilizzare il rack di fisarmonica di DNA per ulteriori applicazioni.

Il rack di fisarmonica del DNA 6 progettato per 6 è simulato dal16,oxDNA17 e i risultati sono mostrati in Figura 6. Dal risultato della simulazione, è stato confermato che la struttura desiderata è costituita senza distorsione della struttura.
Le immagini TEM nella Figura 7 sono immagini di strutture configur...

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Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Descriviamo il protocollo dettagliato per la progettazione, la simulazione, gli esperimenti di laboratorio bagnato e analisi per un rack di fisarmonica DNA riconfigurabile di 6 per 6 maglie.

Progettazione e sintesi di un Rack di fisarmonica di DNA riconfigurabile

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K Views.  Seoul National University. Descriviamo il protocollo dettagliato per la progettazione, la simulazione, gli esperimenti di laboratorio bagnato e analisi per un rack di fisarmonica DNA riconfigurabile di 6 per 6 maglie.

Video: Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Ricerca

Chimica

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

Auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da Campagna DNA a singolo filamento

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

Progettazione di un robot bio-sensibile da DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Bioingegneria

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetica

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivi di DNA stabile, 1D e 2D nanostrutture costruito da molecole di DNA circolare piccola

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

Il nanopatterndifid antistrato DNA Mediato delle strutture inorganiche per applicazioni di rilevamento

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Modellazione semplice, economica e modulare delle cellule utilizzando il DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

RNA polimerasi legata al DNA per la trascrizione in vitro programmabile e il calcolo molecolare

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plasmidi derivati ​​da DNA Strand Displacement Cancelli per reti di reazione implementazione chimici

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Progettazione e sintesi di un Rack di fisarmonica di DNA riconfigurabile

Riepilogo

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