La disfunzione del locus coeruleus è stata implicata in disturbi neurologici e neuropsichiatrici, tra cui il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, la depressione, il disturbo bipolare e l'ansia. Dati questi ruoli, l'analisi del locus coeruleus è fondamentale per studiarne la funzione e la disfunzione. Durante la sezione cerebrale del topo, il locus coeruleus può essere facilmente perso in sezioni coronali o sagittali a causa delle sue piccole dimensioni.
Pertanto, per offrire una guida per la localizzazione del locus coeruleus, descriviamo un protocollo che abbiamo sviluppato per localizzare questa regione nel cervello del topo per diverse applicazioni. Iniziare posizionando il cervello appena isolato di un topo anestetizzato e poi perfuso nel 4%PFA in un tubo da 50 millilitri. Incubare il cervello per 24 ore a quattro gradi Celsius.
Utilizzare le forcep per trasferire il cervello in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 25 millilitri di soluzione di saccarosio al 30%. Incubarlo a quattro gradi Celsius per 48-72 ore fino a quando il cervello affonda sul fondo del tubo. Per incorporare la sezione del tronco encefalico, posizionare la sua superficie di taglio sul fondo di uno stampo di incorporamento e aggiungere un composto di temperatura di taglio ottimale per circondare il tronco encefalico.
Congelare il cervello incorporato in un congelatore meno 80 gradi Celsius per almeno 12 ore fino a un ulteriore utilizzo. Posizionare lo stampo con il cervello nel criostato e incubarlo per diverse ore per regolare la sua temperatura a quella del criostato. Per esporre il blocco oct contenente il cervello, utilizzare una lama di rasoio per tagliare i quattro bordi dello stampo fino al fondo, quindi rimuovere lo stampo di incorporamento da esso.
Utilizzare lamette da barba per rimuovere l'eccesso di OCT dalla superficie del blocco, assicurandosi di non toccare il cervello. Quindi montare il blocco OCT sul mandrino del criostato, esponendo la superficie tagliata del cervello verso la parte anteriore. Per regolare il cervello, orientare la superficie di taglio parallela alle lamette del criostato.
Orientare correttamente il campione è un passo cruciale in questo protocollo. Poiché stiamo usando caratteristiche anatomiche della superficie dorsale del cervello per localizzare l'LC, come il confine tra cervelletto e collicolo inferiore, è importante che le sezioni siano allineate correttamente. Ciò richiede attenzione nell'impostare correttamente il cervello nella matrice dell'affettatrice cerebrale del mouse.
Tagliare il cervello a partire dal midollo, tagliando le sezioni di 100 micrometri rostralmente. Una volta che il cervelletto e il tronco encefalico iniziano a tagliare come una fetta continua a livello del quarto ventricolo, inizia a raccogliere fette con uno spessore di 50 micrometri. Utilizzare le forcep per raccogliere ogni fetta cerebrale e posizionarla in un pozzo di una piastra di 24 po 'piena di PBS.
Il locus coeruleus sarà più evidente in una fetta dove il cervelletto e il collicolo inferiore si incontrano a circa 5,52 millimetri posteriori di bregma. Il primo giorno, lavare le fette cerebrali nella piastra di 24 pozzi tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS. Quindi aggiungere lo 0,5%PBS con detersivo e permeabilizzarli a quattro gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno seguente, lavare le fette tre volte per cinque minuti ciascuna con 0,5%PBSD. Quindi aggiungere l'anticorpo primario a una diluizione da uno a 500 nello 0,5% di PBSD e incubare a quattro gradi Celsius per 18 ore. Il terzo giorno, lavare le fette tre volte per 10 minuti ciascuna con 0,5%PBSD, quindi aggiungere l'anticorpo secondario con una diluizione da uno a 1000 nello 0,5%PBSD.
Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio e incubare a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dopo l'incubazione, lavare le fette tre volte per cinque minuti ciascuna con 0,5%PBSD, quindi per cinque minuti in PBS. Coprire le sezioni utilizzando un supporto di montaggio rigido senza DAPI.
Coprire con una copertura in vetro e asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi utilizzare un microscopio confocale con impostazioni per rilevare il segnale dalla lunghezza d'onda di fluorescenza appropriata alle fette cerebrali dell'immagine. Dopo aver regolato il microscopio sul piano focale della fetta cerebrale, utilizzare 10 volte l'ingrandimento per scattare una singola immagine.
Utilizzare il quarto ventricolo situato sotto il cervelletto e sopra pons e tronco encefalico per localizzare una possibile regione LC nella fetta cerebrale. Focus sui bordi laterali del quarto ventricolo e l'LC si posizionerà partendo dai bordi del quarto ventricolo e puntando verso la regione del tronco encefalico del pons. La distribuzione intracellulare della dopamina beta-idrossilasi, una proteina espressa nella LC, è stata valutata utilizzando questo protocollo al fine di studiare la morfologia LC e la densità neuronale.
Un'altra proteina espressa nella LC, l'idrossilasi tirosina, ha anche mostrato un forte segnale fluorescente verde nelle fette cerebrali contenenti l'LC.I cambiamenti nell'omeostasi metallica sono spesso osservati nei disturbi neurologici, compresi i cambiamenti nel LC.In questo esempio, quando una fetta cerebrale tagliata attraverso l'LC è stata misurata per fosfato, potassio, zinco e rame, solo il rame ha mostrato un aumento specifico del segnale. Si consiglia di tagliare circa 500 micron in più di tessuto anteriore e posteriore a LC per evitare di perdere il nucleo e tagliare più sezioni del necessario, soprattutto se si esegue per la prima volta questo protocollo. Un attento studio delle immagini dell'atlante cerebrale prima della colorazione è molto utile.
Una volta che l'LC si trova per immunoistochimica, le fette cerebrali adiacenti possono essere utilizzate per ulteriori studi, tra cui l'analisi morfologica e metabolica, così come studi di imaging metallico tramite microscopia a fluorescenza a raggi X. Le sezioni cerebrali generate utilizzando il protocollo descritto possono essere utilizzate per quantificare i livelli di rame e altri metalli nella LC e confrontarli con i livelli nelle regioni al di fuori della LC, che è necessario per la comprensione del meccanismo della malattia. Ulteriori possibili applicazioni di questo protocollo includono il rilevamento dell'abbondanza e della distribuzione intracellulare della dopamina beta-idrossilasi, tirosina idrossilasi, e altre proteine espresse nella LC individualmente, o nei test di co-colorazione, studi sulla morfologia LC e sulla densità neuronale.
