שיטה זו יכולה לענות על שאלות בכימיה של חלבונים וגילוי תרופות כגון אילו תנאים מייצבים חלבון? אילו מוטציות משפיעות על הקרומוציבות של אנזים? ו אילו ליגנדים נקשרים למטרה של חלבונים?
היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מהירה, מבוצעת בקלות במעבדה סטנדרטית, ומתאים באופן מושלם ליושמי תפוקה בינוניים עד גבוהים. כדי להכין את דגימת החלבון להעביר 10 microliters של כל מצב של מסך יציבות לתוך הבאר המתאימה של צלחת 96 גם באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי לחסוך זמן. לאחר מכן הכינו מיליליטר אחד של כמיליגרם לתותחת חלבון מיליליטר במערכת חיץ מתאימה.
אם מבצעים שינוי תרמי, הוסיפו צבע כתום SYPRO לדגימה של החלבון לריכוז סופי של פי 20. מערבבים או על ידי היפוך או מערבולת קצרה. עכשיו להעביר 10 microliters של פתרון החלבון לתוך כל באר של צלחת 96 גם.
אטמו וצנטריפוגה את צלחת ה-96 היטב במשך שתי דקות ב-600 פעמים G כדי להבטיח שדגימה החלבון ורכיב המסך מעורבבים. סותמים מחדש את מסך היציבות עמוק היטב לחסום ולאחסן את המסך בארבע מעלות צלזיוס עד ארבעה חודשים. כדי לבצע את ניסוי ה- TSA, פתח את מגירה לדוגמה על-ידי לחיצה איתנה על הכניסה בצד ימין של המגירה.
מניחים את מגש 96 באר במערכת RTPCR עם גם A-One שמאלה. לחץ על לחצן הניסוי החדש כדי להתחיל בהגדרת ניסוי TSA. בכרטיסיה מאפייני ניסוי, לחץ על האפשרות היתוך עקומה כאשר תישאל, איזה סוג ניסוי ברצונך להגדיר?
לאחר מכן לחץ על האפשרות האחרת כאשר תישאל, באיזה רייגנטים ברצונך להשתמש כדי לזהות את רצף היעד? בכרטיסיה הגדרת לוח, הגדר יעדים ודוגמאות, הזן שם יעד ולאחר מכן הגדר את הכתב כ- ROX. וקוונצ'ר בתור אף אחד.
בכרטיסיה הגדרת לוח, הקצאת יעדים ודוגמאות, הגדר את הצבע שיש להשתמש בו כהפניה פסיבית כ'ללא'. באותה כרטיסיה, הקצה כל באר של לוחית הבאר 96 לשם היעד שהוזן בשלב הקודם. בכרטיסיה הפעלת פעולת שירות, מחק שלבים עד שיהיו בסך הכל שלושה.
הגדר את הצעד הראשון ל 25 מעלות צלזיוס, עם קצב רמפה של 100% שעה של חמש שניות. הגדר את השלב השני ל 95 מעלות צלזיוס, עם קצב רמפה של 1% ושעה של דקה אחת. לבסוף, קבעו את השלב השלישי ל-95 מעלות צלזיוס עם קצב רמפה של 100% ותשעה של חמש שניות.
בחר לאסוף נתונים באמצעות התפריט הנפתח איסוף נתונים או על-ידי לחיצה על סמל איסוף הנתונים. הגדר את נפח התגובה ל-20 מיקרוליטרים. לחץ על לחצן התחל הפעלה כדי להתחיל בניסוי TSA.
NanoDSF יכול לשמש כדי לחקור יציבות תרמית חלבון ללא שימוש בצבעים חיצוניים. דגימות ניתן להכין 96 צלחות גם כמתואר בעבר בפרוטוקול אבל בלי להוסיף כל צבע כתום SYPRO. פתח את המגירה לדוגמה על-ידי לחיצה על לחצן פתח מגירה.
ודא כי הציוד נקי, משחק תשומת לב מיוחדת לכל אבק ליד מתלה מדגם. אם למערכת יש מראה מפזרת אחורית לנקות אותו באמצעות אתנול ורקמות ללא מוך. לטעון את נימי עם כ 10 microliters מכל באר של צלחת 96 גם על ידי נגיעה בקצה אחד של נימי לתוך הפתרון.
ואז למקם את נימי לתוך המחזיקים נימי המתאים של מתלה מדגם. היזהר לא לזהם את אמצע נימים עם טביעות אצבעות כמו זה יכול להפריע קריאות פלואורסצנטיות לאורך כל הניסוי. שתק את נימי הים עם רצועת איטום מגנטית.
הפעל סריקה ראשונית כדי לזהות את המיקום והעוצמה של כל נימי על-ידי לחיצה על לחצן התחל סריקת גילוי בכרטיסיה סריקת גילוי. הגדל או הקטן את עוצמת העירור של האירוע מעוצמה ראשונית של 10%עד לשיא של כל סריקת נימים בין 4, 000 ל -12,000 יחידות. בתוכנית הכרטיסיה סריקת היתוך, סריקת היתוך על-ידי הגדרת האפשרות שיפוע טמפרטורה ל- 7.0 מעלות לדקה.
התחל טמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס. וטמפרטורת הסיום ל-95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הפעל את ניסוי nanoDSF על ידי לחיצה על כפתור התחל נמס.
חזור על שלבים אלה כדי להכין את הדגימות לניסוי מלא. לאחר הגדרת הניסוי המלא, נווט אל הכרטיסיה סריקת התכה ותיכנת סריקת התכה על-ידי הגדרת האפשרות שיפוע טמפרטורה ל- 1.0 מעלות צלזיוס לדקה. התחל טמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס.
וטמפרטורת הסיום ל-95 מעלות צלזיוס. לבסוף, הפעל את ניסוי nanoDSF על ידי לחיצה על לחצן התחל נמס. T m משמש כמדד כמותי של יציבות תרמית חלבון ב אמת מידה כדי להשוות את העדפה של תנאים שונים.
המוצגים כאן הם תוצאות מדגם ממסך המלח, המדגים את המאפיינים המייצבים תרמית של אמוניום כלורי לכיוון lysozyme. השוואה של ערכי T m של lysozyme עם מסך pH מגלה כי ההסכם בין TSA ו nanoDSF הוא בדרך כלל טוב אבל nanoDSF מראה נטייה לזהות ערכי T m מעט גבוה יותר במשמרות T m מעט גדול יותר מאשר TSA. ישנה מגמה כללית של יציבות גוברת עם ירידה בערכי ה-pH.
הטווח של ערכי T m המתקבלים באמצעות מערכות מאגר שונות עם ערכי pH זהים יכול להיות משמעותי. עבור שילובי lysozyme של תנאים המניבים את ערכי TSA T m הגבוהים ביותר מכל מסך יציבות נבדקו כדי לבדוק אם יש אפקט משולב סינרגיסטי. יש עלייה כללית בערכי T m ככל שנוספו רכיבים נוספים של מערכת המאגר.
השפעה סינרגיסטית מורגשת יכולה להתרחש כאשר רכיבים בודדים של מאגר ממוטבים ומשולבו עם מסכי היציבות. בעקבות טכניקה זו ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון התגבשות כדי לקבוע את המבנה התלת מימדי של חלבון ולפענח את הבסיס המולקולרי עבור קשירה ligand. כמו כן אנו מספקים תובנות על יציבות החלבון כחלק מפרויקט Virus-X, טכניקה זו ישימה למגוון רחב של מערכות גילוי ופיתוח תרופות.
