Questo metodo può rispondere a domande in chimica delle proteine e scoperta di farmaci come quali condizioni stabilizzano una proteina? Quali mutazioni hanno un impatto sulla termostabilità di un enzima? E quali ligandi si legano a un bersaglio proteico?
I principali vantaggi di questa tecnica sono che è veloce, facilmente eseguito in un laboratorio standard e perfettamente adatto ad applicazioni di produttività medio-alta. Per preparare il trasferimento del campione proteico 10 microlitri di ciascuna condizione di uno schermo di stabilità nel pozzo corrispondente di una piastra di pozzo 96 utilizzando una pipetta multicanale per risparmiare tempo. Quindi preparare un millilitro di circa un milligrammo per soluzione proteica millilitro in un adeguato sistema tampone.
Se si esegue un test di spostamento termico, aggiungere il colorante arancione SYPRO al campione proteico a una concentrazione finale di 20X. Mescolare per inversione o un breve vortice. Ora trasferisci 10 microlitri della soluzione proteica in ogni pozzo della piastra del pozzo 96.
Sigillare e centrifugare la piastra del pozzo 96 per due minuti a 600 volte G per garantire che il campione proteico e il componente dello schermo siano mescolati. Rispezionalizza lo schermo di stabilità in profondità e blocca lo schermo a quattro gradi Celsius per un massimo di quattro mesi. Per eseguire l'esperimento TSA, aprire il cassetto campioni premendo saldamente il rientro sul lato destro del cassetto.
Posizionare il vassoio del pozzo 96 nel sistema RTPCR con ben A-one a sinistra. Fare clic sul nuovo pulsante esperimento per iniziare a configurare un esperimento TSA. Nella scheda Proprietà esperimento fare clic sull'opzione Fusione curva quando richiesto, che tipo di esperimento si desidera impostare?
Quindi fare clic sull'altra opzione quando richiesto, quali reagenti si desidera utilizzare per rilevare la sequenza di destinazione? Nella scheda Imposta piastra, Definisci destinazioni ed esempi immettere un nome di destinazione, quindi impostare Reporter come ROX. E Quencher come Nessuno.
Nella scheda Imposta piastra (Plate Setup), Assegna destinazioni (Assign Targets) e Campioni (Samples), impostate la tintura da utilizzare come riferimento passivo come Nessuno. Nella stessa scheda, assegnare ogni pozzo della piastra del pozzo 96 al nome di destinazione inserito nel passaggio precedente. Nella scheda Esegui metodo eliminare i passaggi fino a quando non sono disponibili per un totale di tre.
Impostare il primo passaggio su 25 gradi Celsius, con una velocità di rampa del 100% e un tempo di cinque secondi. Impostare il secondo passaggio su 95 gradi Celsius, con una velocità di rampa dell'1% e un'ora di un minuto. Infine, impostare il terzo passaggio sui 95 gradi Celsius con una velocità di rampa del 100% e un tempo di cinque secondi.
Scegliere Raccogli dati utilizzando il menu a discesa Raccolta dati oppure facendo clic sull'icona raccolta dati. Impostare il volume di reazione per pozzo su 20 microlitri. Fare clic sul pulsante Avvia esecuzione per iniziare l'esperimento TSA.
Il NanoDSF può essere utilizzato per sondare la stabilità termica delle proteine senza l'uso di coloranti estrinseci. I campioni possono essere preparati in 96 piastre di pozzo come descritto in precedenza nel protocollo, ma senza aggiungere alcun colorante arancione SYPRO. Aprire il cassetto campioni premendo il pulsante Apri cassetto.
Assicurarsi che l'apparecchiatura sia pulita, prestando particolare attenzione a qualsiasi polvere vicino al rack del campione. Se il sistema ha uno specchio di dispersione posteriore, pulirlo usando etanolo e un tessuto privo di pelucchi. Caricare i capillari con circa 10 microlitri da ogni pozzo della piastra del pozzo 96 toccando un'estremità del capillare nella soluzione.
Quindi posizionare il capillare nei corrispondenti supporti capillari del rack del campione. Fare attenzione a non contaminare il centro dei capillari con le impronte digitali in quanto ciò potrebbe interferire con le letture di fluorescenza durante l'esperimento. Immobilizzare i capillari con una striscia di tenuta magnetica.
Avviare una scansione preliminare per rilevare la posizione e l'intensità di ciascun capillare premendo il pulsante Avvia scansione individuazione nella scheda Discovery Scan. Aumentare o diminuire la forza di eccitazione incidente da una potenza iniziale del 10% fino a quando il picco di ogni scansione capillare è compreso tra 4.000 e 12.000 unità. Nella scheda Scansione fusione programmate una scansione di fusione impostando l'opzione Pendenza temperatura su 7,0 gradi al minuto.
Inizia la temperatura a 25 gradi Celsius. E temperatura finale a 95 gradi Celsius. Quindi avviare l'esperimento nanoDSF premendo il pulsante Avvia fusione.
Ripetere questi passaggi per preparare i campioni per un esperimento completo. Una volta impostato l'esperimento completo, passare alla scheda Scansione fusione e programmare una scansione di fusione impostando l'opzione Pendenza temperatura su 1,0 gradi Celsius al minuto. Inizia la temperatura a 25 gradi Celsius.
E temperatura finale a 95 gradi Celsius. Infine, lanciate l'esperimento nanoDSF premendo il pulsante Avvia fusione. T m è usato come misura quantitativa della stabilità termica delle proteine in un benchmark per confrontare la favorabilità delle diverse condizioni.
Qui sono riportati i risultati del campione dello schermo del sale, che esemplificano le proprietà termo stabilizzanti del cloruro di ammonio verso il gliozima. Il confronto dei valori T m del lysozima con lo schermo del pH rivela che l'accordo tra TSA e nanoDSF è generalmente buono, ma il nanoDSF mostra una tendenza a identificare valori T m leggermente più alti in spostamenti T m leggermente più grandi rispetto alla TSA. C'è una tendenza generale ad aumentare la stabilità con valori di pH decrescente.
L'intervallo di valori T m ottenuti utilizzando diversi sistemi tampone con valori di pH identici può essere significativo. Per le combinazioni di lysozima di condizioni che producono i valori TSA T m più alti da ogni schermo di stabilità sono stati testati per sondare un effetto combinato sinergico. C'è un aumento generale dei valori T m man mano che vengono aggiunti più componenti del sistema buffer.
Un notevole effetto sinergico può verificarsi quando i singoli componenti di un buffer sono ottimizzati e combinati con le schermate di stabilità. Seguendo questa tecnica altri metodi come la cristallizzazione possono essere usati per determinare la struttura tridimensionale di una proteina e svelare le basi molecolari per il legame del ligando. Inoltre forniamo informazioni sulla stabilità delle proteine come parte del progetto Virus-X, questa tecnica è applicabile a una vasta gamma di sistemi di scoperta e sviluppo di farmaci.
