Diese Methode kann Fragen in der Proteinchemie und Arzneimittelentdeckung beantworten, wie z. B. welche Bedingungen ein Protein stabilisieren? Welche Mutationen beeinflussen die Thermostabilität eines Enzyms? Und welche Liganden binden an ein Proteinziel?
Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell, einfach in einem Standardlabor ausgeführt wird und perfekt für Anwendungen mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet ist. Zur Vorbereitung der Proteinprobe übertragen Sie 10 Mikroliter jedes Zustands eines Stabilitätssiebes in den entsprechenden Brunnen einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette, um Zeit zu sparen. Dann bereiten Sie einen Milliliter von etwa einem Milligramm pro Milliliter Proteinlösung in einem geeigneten Puffersystem vor.
Wenn Sie einen thermischen Schichttest durchführen, fügen Sie der Proteinprobe SYPRO-Orangenfarbstoff zu einer Endkonzentration von 20X hinzu. Mischen Sie entweder durch Inversion oder eine kurze Wirbel. Nun 10 Mikroliter der Proteinlösung in jeden Brunnen der 96-Well-Platte übertragen.
Versiegeln und zentrieren Sie die 96-Well-Platte für zwei Minuten bei 600-fachem G, um sicherzustellen, dass die Proteinprobe und die Siebkomponente gemischt werden. Den Stabilitätsschutz tief gut blockieren und den Bildschirm bei vier Grad Celsius bis zu vier Monate aufbewahren. Um das TSA-Experiment durchzuführen, öffnen Sie die Probenschublade, indem Sie den Einzug auf der rechten Seite der Schublade fest drücken.
Legen Sie das 96-Well-Tray mit gut A-1 nach links hinten in das RTPCR-System. Klicken Sie auf die neue Experimentschaltfläche, um mit dem Einrichten eines TSA-Experiments zu beginnen. Klicken Sie auf der Registerkarte Experimenteigenschaften auf die Option Kurve schmelzen, wenn Sie gefragt werden, welche Art von Experiment Sie einrichten möchten?
Klicken Sie dann auf die andere Option, wenn Sie gefragt werden, welche Reagenzien Sie verwenden möchten, um die Zielsequenz zu erkennen? Geben Sie auf der Registerkarte Platteneinrichtung, Ziele und Samples definieren einen Zielnamen ein, und legen Sie dann Reporter als ROX fest. Und Quencher als Keiner.
Legen Sie auf der Registerkarte Platteneinrichtung, Ziele und Samples zuweisen den Farbstoff fest, der als passive Referenz als Keine verwendet werden soll. Weisen Sie in derselben Registerkarte jeden Brunnen der 96-Well-Platte dem im vorherigen Schritt eingegebenen Zielnamen zu. Löschen Sie auf der Registerkarte Ausführungsmethode Schritte, bis insgesamt drei vorhanden sind.
Stellen Sie den ersten Schritt auf 25 Grad Celsius, mit einer Rampenrate von 100% und einer Zeit von fünf Sekunden. Stellen Sie den zweiten Schritt auf 95 Grad Celsius, mit einer Rampenrate von 1% und einer Zeit von einer Minute. Stellen Sie schließlich den dritten Schritt auf die 95 Grad Celsius mit einer Rampenrate von 100 % und einer Zeit von fünf Sekunden.
Wählen Sie das Sammeln von Daten mithilfe des Dropdown-Menüs Daten sammeln oder indem Sie auf das Datenerfassungssymbol klicken. Stellen Sie das Reaktionsvolumen pro Brunnen auf 20 Mikroliter ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen starten, um das TSA-Experiment zu starten.
NanoDSF kann verwendet werden, um die thermische Stabilität des Proteins ohne die Verwendung von extrinsischen Farbstoffen zu untersuchen. Proben können in 96 Brunnenplatten hergestellt werden, wie zuvor im Protokoll beschrieben, jedoch ohne Zugabe von SYPRO Orangenfarbstoff. Öffnen Sie die Musterschublade, indem Sie die Schaltfläche "Öffnen der Schublade" drücken.
Stellen Sie sicher, dass das Gerät sauber ist, und achten Sie besonders auf Staub in der Nähe des Probengestells. Wenn das System rückstreuenden Spiegel sauber es mit Ethanol und einem fusselfreien Gewebe. Die Kapillaren mit ca. 10 Mikrolitern aus jedem Brunnen der 96-Wellplatte beladen, indem Sie ein Ende der Kapillare in die Lösung berühren.
Und dann die Kapillare in die entsprechenden Kapillarhalter des Probenträgers legen. Achten Sie darauf, die Mitte der Kapillaren nicht mit Fingerabdrücken zu kontaminieren, da dies die Fluoreszenzwerte während des gesamten Experiments stören könnte. Immobilisieren Sie die Kapillaren mit einem magnetischen Dichtstreifen.
Starten Sie einen vorläufigen Scan, um die Position und Intensität jeder Kapillare zu erkennen, indem Sie die Schaltfläche "Ermittlungsscan starten" auf der Registerkarte Ermittlungsscan drücken. Erhöhen oder verringern Sie die Anregungsstärke von einer Anfangsleistung von 10 % bis zum Spitzenwert jedes Kapillarscans zwischen 4.000 und 12.000 Einheiten. Im Registerkarte Schmelzen des Scans wird ein Schmelzscan durch Festlegen der Option Temperaturneigung auf 7,0 Grad pro Minute angezeigt.
Starttemperatur bis 25 Grad Celsius. Und Endtemperatur auf 95 Grad Celsius. Starten Sie dann das nanoDSF-Experiment, indem Sie die Taste "Schmelzen starten" drücken.
Wiederholen Sie diese Schritte, um die Proben auf ein vollständiges Experiment vorzubereiten. Sobald das vollständige Experiment eingerichtet ist, navigieren Sie zur Registerkarte Schmelzendes Scannen, und programmieren Sie einen Schmelzscan, indem Sie die Option Temperaturneigung auf 1,0 Grad Celsius pro Minute setzen. Starttemperatur bis 25 Grad Celsius.
Und Endtemperatur auf 95 Grad Celsius. Starten Sie schließlich das nanoDSF-Experiment, indem Sie die Taste "Schmelzen starten" drücken. T m wird als quantitatives Maß für die thermische Stabilität des Proteins in einem Benchmark verwendet, um die Günstigkeit verschiedener Bedingungen zu vergleichen.
Hier sind Probenergebnisse aus dem Salzsieb zu sehen, die die thermisch stabilisierenden Eigenschaften von Ammoniumchlorid gegenüber Lysozym veranschaulicht. Der Vergleich der T m-Werte von Lysozym mit dem pH-Bildschirm zeigt, dass die Übereinstimmung zwischen TSA und nanoDSF im Allgemeinen gut ist, aber nanoDSF zeigt eine Tendenz, etwas höhere T m-Werte in etwas größeren T m-Schichten als TSA zu identifizieren. Es gibt einen allgemeinen Trend der Erhöhung der Stabilität mit abnehmenden pH-Werten.
Der Bereich der T m-Werte, die mit verschiedenen Puffersystemen mit identischen pH-Werten ermittelt werden, kann signifikant sein. Für Lysozym-Kombinationen von Bedingungen, die die höchsten TSA-T m-Werte aus jedem Stabilitätsbildschirm ergeben, wurden Tests getestet, um einen synergistischen kombinierten Effekt zu untersuchen. Es gibt eine allgemeine Erhöhung der T m-Werte, da mehr Komponenten des Puffersystems hinzugefügt werden.
Ein spürbarer synergistischer Effekt kann auftreten, wenn einzelne Komponenten eines Puffers optimiert und mit den Stabilitätsbildschirmen kombiniert werden. Nach dieser Technik können andere Methoden wie die Kristallisation verwendet werden, um die dreidimensionale Struktur eines Proteins zu bestimmen und die molekulare Basis für die Ligandenbindung zu entwirren. Darüber hinaus bieten wir im Rahmen des Virus-X-Projekts Einblicke in die Proteinstabilität, diese Technik ist auf eine Vielzahl von Arzneimittelermittlungs- und Entwicklungssystemen anwendbar.
