هذه الطريقة يمكن الإجابة على الأسئلة في الكيمياء البروتين واكتشاف المخدرات مثل الظروف التي استقرار البروتين؟ ما هي الطفرات التي تؤثر على قابلية التر حرارة الإنزيم؟ وما هي اليغانندات التي ترتبط بهدف البروتين؟
المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة، يتم تنفيذها بسهولة في مختبر قياسي، ومناسبة تمامًا لتطبيقات متوسطة إلى عالية الإنتاجية. لإعداد عينة البروتين نقل 10 ميكرولترات من كل حالة من شاشة الاستقرار في بئر المقابلة من 96 لوحة البئر باستخدام ماصة متعددة القنوات لتوفير الوقت. ثم إعداد ملليلتر واحد من ما يقرب من مليغرام واحد لكل ميلليلتر حل البروتين في نظام عازلة مناسبة.
إذا كان إجراء تحليل التحول الحراري إضافة صبغة البرتقال SYPRO إلى عينة البروتين إلى تركيز النهائي من 20X. تخلط إما عن طريق عكس أو دوامة وجيزة. الآن نقل 10 ميكرولترات من محلول البروتين في كل بئر من 96 لوحة جيدا.
ختم وطاردة مركزية لوحة 96 بئر لمدة دقيقتين في 600 مرة G لضمان مزيج عينة البروتين وعنصر الشاشة. إعادة الغلق شاشة الاستقرار كتلة جيدة عميقة وتخزين الشاشة في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أربعة أشهر. لتنفيذ تجربة TSA، افتح درج العينة عن طريق الضغط بقوة على المسافة البادئة على الجانب الأيمن من الدرج.
ضع علبة 96 بئرًا في نظام RTPCR مع A-One جيدًا إلى اليسار الخلفي. انقر على زر التجربة الجديد لبدء إعداد تجربة TSA. في علامة التبويب خصائص التجربة، انقر فوق الخيار تذوب منحنى عند سؤال، ما نوع التجربة التي تريد إعدادها؟
ثم انقر فوق الخيار الآخر عند سؤاله، أي الكواشف التي تريد استخدامها للكشف عن التسلسل المستهدف؟ في علامة التبويب إعداد لوحة ، تعريف الأهداف والعينات ، أدخل اسم الهدف ، ثم تعيين مراسل كـ ROX. و (كوينشر) كـ لا شيء
في علامة التبويب إعداد لوحة تعيين الأهداف و النماذج، قم بتعيين الصبغة لاستخدامها كمرجع سلبي كـ بلا. في نفس التبويب، تعيين كل بئر من لوحة 96 جيدا إلى اسم الهدف الذي تم إدخاله في الخطوة السابقة. في التبويب تشغيل أسلوب، حذف الخطوات حتى يكون هناك إجمالي ثلاثة.
تعيين الخطوة الأولى إلى 25 درجة مئوية، مع معدل منحدر من 100٪ والوقت من خمس ثوان. تعيين الخطوة الثانية إلى 95 درجة مئوية، مع معدل منحدر من 1٪ والوقت من دقيقة واحدة. وأخيرا، تعيين الخطوة الثالثة إلى 95 درجة مئوية مع معدل منحدر من 100٪ والوقت من خمس ثوان.
اختر تجميع البيانات باستخدام القائمة المنسدلة تجميع البيانات أو بالنقر فوق رمز تجميع البيانات. تعيين حجم التفاعل في جيدا إلى 20 ميكرولتر. انقر فوق الزر بدء التشغيل لبدء تجربة TSA.
NanoDSF يمكن استخدامها للتحقيق الاستقرار الحرارية البروتين دون استخدام الأصباغ extrinsic. يمكن إعداد العينات في 96 صحن البئر كما هو موضح سابقا في البروتوكول ولكن دون إضافة أي صبغة برتقال SYPRO. افتح درج العينة بالضغط على زر الدرج المفتوح.
تأكد من أن المعدات نظيفة، ولعب اهتماما خاصا لأي غبار بالقرب من رف العينة. إذا كان النظام قد يعود مبعثر مرآة تنظيفها باستخدام الإيثانول والأنسجة الحرة الوبر. تحميل الشعيرات الدموية مع ما يقرب من 10 ميكرولترات من كل بئر من 96 لوحة البئر عن طريق لمس واحدة من نهاية الشعيرات الدموية في الحل.
ثم ضع الشعيرات الدموية في حاملي الشعيرات الدموية المقابلة من رف العينة. يجب الحرص على عدم تلويث منتصف الشعيرات الدموية ببصمات الأصابع لأن هذا يمكن أن يتعارض مع قراءات الفلورانس طوال التجربة. شلّب الشعيرات الدموية بشريط مغناطيسي للختم.
قم بتشغيل فحص أولي للكشف عن موضع وكثافة كل شعرية عن طريق الضغط على الزر "فحص اكتشاف ابدأ" في علامة التبويب "مسح اكتشاف". زيادة أو نقصان قوة إثارة الحادث من قوة أولية من 10٪ حتى ذروة كل مسح شعري هو ما بين 4، 000 و 12، 000 وحدة. في برنامج علامة التبويب ذوبان المسح الضوئي مسح تذوب عن طريق تعيين خيار درجة الحرارة المنحدر إلى 7.0 درجة في الدقيقة الواحدة.
تبدأ درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية. ونهاية درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية. ثم قم بتشغيل تجربة nanoDSF عن طريق الضغط على زر بدء الذوبان.
كرر هذه الخطوات لإعداد العينات لتجربة كاملة. بمجرد إعداد التجربة الكاملة، انتقل إلى علامة التبويب مسح الذوبان، وبرنامج مسح تذوب عن طريق تعيين خيار درجة الحرارة المنحدر إلى 1.0 درجة مئوية في الدقيقة الواحدة. تبدأ درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية.
ونهاية درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية. وأخيراً، قم بتشغيل تجربة nanoDSF عن طريق الضغط على زر بدء الذوبان. يستخدم T m كمقياس كمي للاستقرار الحراري للبروتين في معيار للمقارنة بين تفضيل الظروف المختلفة.
تظهر هنا نتائج عينة من شاشة الملح، تجسد خصائص الاستقرار الحراري لكلورايد الأمونيوم نحو الميزوزيم. المقارنة بين قيم T m من lysozyme مع الشاشة pH يكشف أن الاتفاق بين TSA و nanoDSF جيدة عموما ولكن nanoDSF يظهر ميلا إلى تحديد أعلى قليلا T m القيم في أكبر قليلا T m التحولات من TSA. هناك اتجاه عام لزيادة الاستقرار مع انخفاض قيم درجة الوفيات.
يمكن أن يكون نطاق قيم T m التي تم الحصول عليها باستخدام أنظمة عازلة مختلفة ذات قيم رقمية متطابقة كبيرًا. بالنسبة لمجموعات lysozyme من الظروف التي تسفر عن أعلى قيم TSA T m من كل شاشة استقرار تم اختبارها للتحقيق في تأثير مشترك تعاوني. هناك زيادة عامة في قيم T m حيث يتم إضافة المزيد من مكونات نظام المخزن المؤقت.
يمكن أن يحدث تأثير تآزري ملحوظ عندما يتم تحسين المكونات الفردية من المخزن المؤقت ودمجها مع شاشات الاستقرار. بعد هذه التقنية يمكن استخدام طرق أخرى مثل التبلور لتحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد للبروتين وكشف الأساس الجزيئي للليغاند ملزم. كذلك نحن نقدم نظرة ثاقبة في استقرار البروتين كجزء من مشروع فيروس العاشر، وهذا الأسلوب ينطبق على مجموعة واسعة من اكتشاف المخدرات ونظم التنمية.
