이 방법은 단백질 화학 및 약물 발견에 대한 질문에 어떤 조건이 단백질을 안정시키는가? 효소의 열안정성에 어떤 돌연변이가 영향을 미각을 가하는가? 그리고 어떤 리간드가 단백질 표적에 결합합니까?
이 기술의 주요 장점은 표준 실험실에서 빠르고 쉽게 수행되며 중간에서 높은 처리량 응용 프로그램에 완벽하게 적합하다는 것입니다. 단백질 시료를 준비하기 위해 안정성을 한 각 상태의 10 마이크로리터를 다중채널 파이펫을 이용하여 96웰 플레이트의 해당 웰 플레이트로 전달하여 시간을 절약한다. 그런 다음 적절한 완충 계통에서 밀리리터 단백질 용액당 약 1밀리리터를 준비합니다.
열 시프트 분석기를 수행하는 경우 단백질 샘플에 SYPRO 오렌지 염료를 20배의 최종 농도로 추가합니다. 반전이나 간단한 소용돌이로 섞으세요. 이제 단백질 용액의 10 마이크로리터를 96개의 웰 플레이트의 각 우물로 전달합니다.
96웰 플레이트를 600배G로 밀봉하고 원심분리하여 단백질 샘플과 스크린 성분이 혼합되도록 합니다. 안정성 화면을 잘 차단하고 최대 4개월 동안 섭씨 4도에 화면을 저장합니다. TSA 실험을 수행하려면 서랍의 오른쪽에 있는 들여쓰기를 단단히 눌러 샘플 서랍을 엽니다.
96 웰 트레이를 RTPCR 시스템에 배치하고 A-one을 왼쪽 에 잘 배치합니다. TSA 실험을 설정하려면 새 실험 단추를 클릭합니다. 실험 속성 탭에서 어떤 유형의 실험을 설정하시겠습니까?
그런 다음 다른 옵션을 클릭하면 대상 시퀀스를 감지하는 데 사용할 시약이 있습니까? 플레이트 설정에서 대상 및 샘플 탭을 정의하고 대상 이름을 입력한 다음 리포터를 ROX로 설정합니다. 그리고 아무도로 Quencher.
플레이트 설정에서 대상 및 샘플 탭에 할당할 때 설정은 수동 참조로 사용할 염료를 없음으로 선택합니다. 동일한 탭에서 96 웰 플레이트의 모든 웰을 이전 단계에서 입력한 대상 이름에 할당합니다. 메서드 실행 탭에서 총 3개가 있을 때까지 단계를 삭제합니다.
첫 번째 단계를 섭씨 25도로 설정하고 경사로 속도는 100%이고 5초의 시간으로 설정합니다. 두 번째 단계를 섭씨 95도로 설정하고 경사로 비율은 1%이고 1분이 소요됩니다. 마지막으로, 경사로 속도가 100%이고 5초의 시간으로 세 번째 단계를 섭씨 95도로 설정합니다.
수집 데이터 드롭 다운 메뉴를 사용하거나 데이터 수집 아이콘을 클릭하여 데이터 수집을 선택합니다. 잘 당 반응 볼륨을 20 마이크로리터로 설정합니다. TSA 실험을 시작하려면 시작 실행 버튼을 클릭합니다.
NanoDSF는 외외염의 사용 없이 단백질 열 안정성을 탐사하는 데 사용될 수 있다. 샘플은 프로토콜에 이전에 설명된 것과 같이 96 개의 잘 플레이트에서 제조 될 수 있지만 SYPRO 오렌지 염료를 추가하지 않고 제조 할 수 있습니다. 서랍 열기 버튼을 눌러 샘플 서랍을 엽니다.
장비가 깨끗하고 샘플 랙 근처의 먼지에 특별한주의를 기울이도록 하십시오. 시스템에 백 산란 거울이있는 경우 에탄올과 보풀이없는 조직을 사용하여 청소하십시오. 모세혈관의 한쪽 끝을 용액에 터치하여 96 웰 플레이트의 각 웰에서 약 10 마이크로리터로 모세혈관을 적재합니다.
그런 다음 모세관을 샘플 랙의 해당 모세관 홀더에 넣습니다. 실험 전반에 걸쳐 형광 판독을 방해할 수 있기 때문에 모세혈관의 중간을 지문으로 오염시키지 않도록 주의하십시오. 마그네틱 밀봉 스트립으로 모세 혈관을 고정합니다.
디스커버리 스캔 탭에서 시작 디스커버리 스캔 버튼을 눌러 각 모세관의 위치와 강도를 감지하기 위해 예비 검사를 시작합니다. 모든 모세 혈관 스캔의 피크가 4, 000 에서 12, 000 단위 사이일 때까지 사고 흥분 강도를 10 %의 초기 전력에서 증가 또는 감소시 강도. 용융 스캔 탭 프로그램에서 온도 경사 옵션을 분당 7.0도로 설정하여 용융 스캔합니다.
섭씨 25도까지 온도를 시작합니다. 그리고 95도까지 온도를 종료합니다. 그런 다음 시작 용융 버튼을 눌러 나노DSF 실험을 시작합니다.
전체 실험을 위해 샘플을 준비하려면 다음 단계를 반복합니다. 전체 실험이 설정되면 용융 스캔 탭으로 이동하여 온도 경사 옵션을 분당 섭씨 1.0도로 설정하여 용융 스캔을 프로그래밍합니다. 섭씨 25도까지 온도를 시작합니다.
그리고 95도까지 온도를 종료합니다. 마지막으로 시작 용융 버튼을 눌러 나노DSF 실험을 시작합니다. Tm은 벤치마크에서 단백질 열 안정성의 정량적 척도로서 사용되어 다른 조건의 호의성을 비교합니다.
여기에 표시된 염분 화면에서 샘플 결과, 리소지멜로염암모늄의 열 안정화 특성을 예시한다. pH 화면과 리소지메의 T m 값을 비교하면 TSA와 나노DSF 간의 계약이 일반적으로 양호하지만 나노DSF는 TSA보다 약간 더 큰 T m 교대에서 약간 더 높은 T m 값을 식별하는 경향을 보여줍니다. pH 값이 감소하면서 안정성을 높이는 일반적인 추세가 있습니다.
동일한 pH 값을 가진 다른 버퍼 시스템을 사용하여 얻은 T m 값의 범위는 중요할 수 있습니다. 리소지메 조합의 경우 각 안정성 화면에서 가장 높은 TSA T m 값을 산출하여 시너지 결합 효과를 테스트했습니다. 버퍼 시스템의 구성 요소가 더 많이 추가됨에 따라 T m 값이 전반적으로 증가합니다.
버퍼의 개별 구성 요소를 최적화하고 안정성 화면과 결합할 때 눈에 띄는 시너지 효과가 발생할 수 있습니다. 이 기술에 따라 결정화와 같은 다른 방법은 단백질의 3차원 구조를 결정하고 리간 드렌전을 위한 분자 기초를 해명하는 데 사용될 수 있다. 또한 Virus-X 프로젝트의 일환으로 단백질 안정성에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 이 기술은 광범위한 약물 발견 및 개발 시스템에 적용할 수 있습니다.
