הגירה תאית היא תהליך ריפוי פצעים קריטי שיכול לשנות באופן דרסטי את התוצאה של פצע ריפוי. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את ההשפעה של תרכובות שונות על הגירה תאית במהלך ריפוי פצעים. אשר לעתים קרובות יכול להוביל אסטרטגיות טיפול ממוקדות לרפואה קלינית.
בדיקת השריטה היא גישה חסכונית ותפוקה גבוהה ליצירת נתוני ריפוי פצעים משמעותיים לפני בדיקות vivo יקרות ועתימות זמן. תווי השריטה כשיטה רלוונטיים במיוחד יישומים לריפוי פצעים. באופן ספציפי ביותר, העור.
עם זאת, ההתלהמות היא באמת מזרע הגירה, ויתן להחילה על כל סוג תא שבו העברת תאים מעניינת למדידה או ללכידה. בדומה לתרבות תאים ורקמות קלאסית, נהלי הפעלה סטנדרטיים, הכשרה, טכניקה ותרגול, תרגול, תרגול. אלה הם המפתח להצלחה עם הראיה שריטה.
הדגמת ההליך תהיה נתן קרוז, סטודנט לתואר שני, ואוסקר לוג'אן, חוקר לתואר ראשון. כדי להתחיל בהליך זה, להכין את ארון biosafety II באמצעות פתרון מים isopropyl 70% לבצע מגבון תברואה, החל הקירות האחוריים בצד, ועובד עד הבסיס. כמו כן, יש לנגב את כל החומרים שישמשו בהטלת הראיה לפני הצבתם בקבינט.
לאחר מכן, להשיג בקבוקונים המכילים את קו התאים הרצוי cryopreserved, ולמקם אחד באמבט מים בעומק סנטימטר אחד ב 37 מעלות צלזיוס להפשיר. הוסף 10 מיליליטר של בינוני בתוספת 10%FBS לתוך בקבוק תרבות רקמת T75. פתח את הבקבוקון המכיל את מלאי התא, ושוכך בזהירות את הפתרון.
ואז להעביר את התאים לתוך בקבוק T75. הסר מיליליטר אחד של מדיה מן הבקבוק, ולהעביר אותו בחזרה לתוך הבקבוקון, ולאחר מכן להעביר אותו בחזרה לתוך הבקבוקון כדי למקסם את תפוקת התא מן הבקבוקון. הדקו את מכסה הבקבוק וטלטלו אותו בעדינות כדי לפזר באופן אחיד את התאים בהשעיה על פני השטח כולו.
לאחר מכן, סמן את הבקבוק עם המידע המוצג כאן, והצב אותו באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. ראשית, לאחזר את בקבוקון תרבות הרקמה מהאינקובטור, ולצפות בתאים דבק כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שאפו את כל נפח המדיה מהבקבוק והעברתו למיכל פסולת.
מוסיפים חמישה מיליליטר של תווי מלח מאוזנים לבקבוק, ומטלטלים אותו בעדינות כדי לשטוף כל מדיה עודפת, תאים מתים או פסולת. לאחר מכן להסיר את כל נפח של תסכולת מלח מן הבקבוק להשליך אותו לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של טריפסין לבקבוקון, ומטלטלים אותו בעדינות כדי לפזר את האנזים על התאים הדבוקים.
ודא כי המשטח חסיד הוא רווי לחלוטין, ולה מניחים את בקבוק הרקמה באינקובטור במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, הקישו בעדינות על צד הבקבוק שלוש עד חמש פעמים כדי להקל על ניתוק התאים. נגב את הבקבוק עם 70% אלכוהול, והצב אותו בארון biosafety.
הוסף חמישה מיליליטר של מדיה מלאי לבקבוק הרקמה כדי לעצור את תגובת מצע האנזים. שאפו את כל נפח הנוזל מהבקבוק, והעבירו אותו לצינור חרוט סטרילי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 200 פעמים g וב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן השתמשו ב-70% אלכוהול כדי לנגב את הצינור המכיל את התאים המו גלולות, והצבו אותו בתוך הארון הביו-בטיחותי. פיפטה מחוץ לתקשורת, משאיר מאחור כ 250 microliters של נוזל עם גלולת התא. הפעל את החלק התחתון של הצינור חרוט על פני חריצי הבקבוקון של מתלה צינור microcentrifuge כדי ליצור רטט מהיר להפריע ולתלות מחדש את גלולת התא.
כאשר הושלמה כראוי, פתרון התא החדש יופיע כתערובת מעוננת ללא גלולה שנותרה. הוסף שני מיליליטר של מדיה לזולת התא. פיפטה התאים בעדינות למעלה ולמטה בצד הצינור 20 פעמים כדי לשבור את כל הגושים.
ולתקליט את נפח המתלים הכולל של התא. לאחר מכן, השתמש פיפטה סטרילית להוסיף 20 microliters של מלאי כחול trypan ל הבאר ריקה של צלחת 96 היטב. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, להעביר 20 microliters של מלאי התא מן הצינור 15 מיליליטר ל הבאר המכילה את הפתרון הכחול trypan.
פיפטה בעדינות לערבב את התוכן ולהעביר 10 microliters של התערובת בין להחליק את הכיסוי ואת תא הספירה על hemocytometer. ספור רק את התאים במרכז וארבעה ריבועים פינתיים, בנפרד, וספירת התאים הכוללת וספירת התאים הלא-בת קיימא עבור חמשת הריבועים שזוהו. לאחר חישוב ספירת התאים בת קיימא, סמן קו אופקי לאורך החלק התחתון של לוח 12 בארות שישמש כסימן ייחוס במהלך ההדמיה.
לדלל את מלאי התא עם מדיה לצפיפות של 19,000 תאים למיליליטר. ואז לזרוע כל באר של צלחת 12 באר עם מיליליטר אחד של מלאי התא מדולל, ערבוב מלאי התא מעת לעת כדי להבטיח אפילו זריעת תאים על פני כל 12 בארות. סמן כל לוחית בתווית עם המידע המוצג כאן.
ומ מניחים אותו באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד שהתאים גדלים ל-100%. לאחזר צלחת 12 באר עם תאים מהאינקובטור. באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה 10x, להתבונן בתאים ולקבוע את הקונפדרציה בתוך כל באר.
לאחר מכן, שאף והשליך את תקשורת הצמיחה מכל באר. להרכיב צינור P200 עם קצה סטרילי 1-200 מיקרוליטר. בכל באר, להחליק את קצה פיפטה על פני השטח של התא ממיקום 12: 00 למיקום 6: 00 כדי לייצר פצע ללעוג שריטה.
יש לשטוף כל באר במיליליטר אחד של תווי מלח מאוזנים כדי לנקות פסולת עודפת וגושי תאים. רוק הצלחת מצד לצד כדי להקל על הכביסה. לאחר מכן להסיר ולהיפטר תווי מלח מאוזנים מכל באר.
באמצעות צינור P1000 עם קצה 1,000 מיקרוליטר, להוסיף 1,000 microliters מן המניות ארסן מוכן לתוך בארות שהוקצו באופן אקראי עם קבוצת טיפול. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל באר, ולתזמן את הזמן שבו הטיפולים מתווספים. הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
כדי לדמיין את הלוחות, לכוד תמונות של כל באר בהגדלה אובייקטיבית של פי 10 כל ארבע שעות במשך 24 שעות. הפני לקו שצויר בעבר בתחתית הלוח כדי לדמיין את אותו מיקום לאורך השריטה בתוך כל באר בכל נקודת זמן. במחקר זה, בדיקה שריטה in vivo משמש כדי לבחון את ההשפעות של ארסן על הגירת תאים.
שריטות אחידות נצפו בכל קבוצות הטיפול, עם רוחב שריטה ממוצע של כ 0.8 מילימטרים. תאי הבקרה מראים שריטה שהחלימה לחלוטין לאחר 20 שעות. שתי קבוצות הארסן אינן מראות רמה זו של ריפוי.
עם טיפול 10 מיקרומולרים מעכב סגירה לגמרי במשך 24 שעות. תוצאות אלה מראות כי נוכחותו של ארסן מאטה את ההגירה התאית. התמונות הגולמיות שנלכדו במהלך ההתנסויות מנותחות באמצעות תוכנה אוטומטית למדידת רוחב הפצע, לאחר מכן לחשב את סגירת האחוזים ולבסוף לחשב את האזור מתחת לעקומה.
קבוצת הטיפול 10 מיקרומולרי מראה הגירה תאית מואטת סטטיסטית של פיברובלסטים עוריים יילודים אנושיים בהשוואה לכל קבוצות הטיפול האחרות. חשוב לתרגל ביסודיות טכניקה זו כדי להגביר את העקביות בעת גירוד התאים. שונות לא מכוונת בין מבחנה עלולה להטות נתונים ולשנות מסקנות.
טכניקות מולקולריות נוספות כגון תגובת שרשרת פולימראז כמותית ובדיקות אימונוסורבנט הקשורות לאנזימים ניתן להשתמש בבדיקה שלאחר השריטה כדי לזהות אותות וחלבונים שליח שעשויים להיות היעד לשינויים בנדידת תאים שנצפו בבדיקה. חקירה זו תרמה להבנת החוקרים של גרורות סרטן, טיפולים חדשים בסרטן המתעוררים, תאי גזע ורפואה רגנרטיבית, ואבני דרך מדעיות רבות אחרות.
